超聲波酶法輔助提取紫萁黃酮工藝及抗氧化活性研究

李克香，向建英，唐軍榮，邱旭，闞歡，，劉云，

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；

2. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3. 云南省高校大健康類森林資源開發(fā)利用工程研究中心，云南 昆明 650224)

紫萁(Osmunda japonica)為紫萁屬多年生草本蕨類植物[1]，別名薇菜、高腳貫眾、貓兒蕨等，生于林下或溪邊酸性土上，北起山東，南達(dá)兩廣，東自海邊，西達(dá)云、貴、川西，北至秦嶺南坡均有分布，素有綠色保健食品之稱，可藥食兩用[2]，以“山菜之王”和“山珍”聞名中外[3]。紫萁幼葉作為蔬菜食用在我國已有3 000 多年的歷史，加工成紫萁干后，長期出口到日本、韓國及東南亞等國家[4]。紫萁含有黃酮類[5]、 內(nèi)酯類[6]、 多糖類[7－9]、鞣質(zhì)[10]及氨基酸類[11]等多種活性成分，其中黃酮類化合物是紫萁資源中的重要活性成分之一。

紫萁黃酮具有抗衰老、抗腫瘤、抑菌、提高機(jī)體免疫力等生理活性功能[12－14]，提取方法主要有乙醇提取法[15]、丙酮提取法[16]、微波輔助提取法等[17]。植物中的黃酮類化合物通常以糖苷或其它共軛體的形式存在液泡中[18]。植物細(xì)胞壁主要由纖維素組成，紫萁中的纖維素含量高達(dá)37.4%[19]。纖維素酶能水解植物細(xì)胞中的纖維素β－D－葡萄糖苷鍵，破壞植物細(xì)胞壁，有助于黃酮成分的充分溶出。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及振蕩作用，能夠破壞植物組織，加速黃酮成分的溶出[20]。超聲波酶輔助提取法具有安全、環(huán)保、效率高等優(yōu)點(diǎn)[21]，此法在提取紫萁黃酮中的研究至今未見報(bào)道。本研究以云南野生紫萁為原料，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化超聲波酶輔助提取紫萁黃酮的工藝[22]，并對其進(jìn)行抗氧化活性評價(jià)，以期為紫萁的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生紫萁材料采自云南迪慶。將采集的新鮮紫萁于50℃恒溫干燥后，粉碎過80 目篩，得到的紫萁粉于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、纖維素酶(50 U/mg)、2，2′－聯(lián)氮－雙－3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸(ABTS):上海源葉生物科技有限公司；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH):北京博奧拓達(dá)科技有限公司；維生素C(VC):廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV－2600 紫外可見分光光度計(jì):島津儀器(蘇州)有限公司；SB25－12DTDS 超聲波清洗機(jī):寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；DK－98－Ⅱ電熱恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司；Spectra-Max190 酶標(biāo)儀:美谷分子儀器(上海)有限公司；FD5－3 冷凍干燥機(jī):金西盟(北京)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫萁黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取適量紫萁粉末于離心管中，按一定液料比加入不同濃度的乙醇溶液，混勻后調(diào)節(jié)pH 為5，采用纖維素酶在50℃水浴中對樣品進(jìn)行酶解，酶解后將酶滅活，然后將滅活后混合溶液在50℃下進(jìn)行超聲提取，離心取上清液，即為紫萁黃酮提取液。

1.3.2 建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 參考李欣燃等[23]的方法，稍加改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取10 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙醇定容至100 mL，配成濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，之后吸取0、2、4、6、8、10、12 mL，分別置于25 mL 刻度試管中，依次加入5%亞硝酸鈉1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL 、5%氫氧化鈉溶液10 mL，最后用50%乙醇定容、靜置15 min，用50%的乙醇作為空白對照，于510 nm 處測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)(A)、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C，mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合得到回歸方程為A＝11.2664C＋0.0007(R2＝0.9994)。

1.3.3 紫萁黃酮的得率測定 將1.3.1 中所得紫萁黃酮提取液定容至25 mL，取1 mL 按1.3.2 中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定，根據(jù)公式(1)計(jì)算紫萁黃酮得率:

式中:c 為紫萁黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數(shù)；v 為待測提取液的總體積，mL；m 為紫萁粉樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 紫萁黃酮提取單因素試驗(yàn) 在1.3.1 的基礎(chǔ)上，分別考察超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)、纖維素酶添加量(0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%)、液料比(10、20、30、40、50 mL/g)、乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)、纖維素酶解時(shí)間(10、25、40、55、70 min)、超聲功率(100、200、300、400、500 W)對紫萁黃酮得率的影響。

1.3.5 紫萁黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 用SPSS 26 軟件分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取4 個(gè)對紫萁黃酮得率影響顯著的因素作為自變量，以紫萁黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行Box－Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化紫萁黃酮的提取工藝條件[24]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.6 紫萁黃酮抗氧化活性測定 DPPH 自由基清除能力測定:參照袁燕等[25]的方法并稍加改動(dòng)。將紫萁黃酮粗提液凍干后，用蒸餾水復(fù)溶，配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的紫萁黃酮樣品溶液，之后分別取3 mL 于10 mL 離心管中，加入3 mL 濃度為0.08 mg/mL 的DPPH－無水乙醇溶液混勻，避光30 min 后，取200 μL 混合液于96 孔酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀517 nm 處測定吸光值。同時(shí)設(shè)定空白組和樣品對照組，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL 的VC 溶液作為對照。根據(jù)公式(2)計(jì)算清除率。

式中:A0為DPPH 自由基和無水乙醇的吸光值；A1為紫萁黃酮提取液和DPPH 自由基的吸光值；A2為紫萁黃酮提取液和無水乙醇的吸光值。

ABTS 自由基清除能力測定:參照李偉等[26]的方法并稍加改動(dòng)。將7 mmol/mL ABTS 溶液5 mL 與140 mmol/mL 過硫酸鉀水溶液88 μL 混合均勻并避光反應(yīng)12 h，得到ABTS＋·儲備液；使用前用蒸餾水稀釋ABTS＋·儲備液使其734 nm 處吸光值為0.70±0.02，即得ABTS＋·工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將紫萁黃酮粗提液凍干后，用蒸餾水復(fù)溶，配制濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg/mL 的紫萁黃酮樣品溶液。移取不同濃度紫萁黃酮樣品溶液50 μL 于96 孔酶標(biāo)板中，再加入ABTS＋·工作液200 μL，暗反應(yīng)6 min，于酶標(biāo)儀734 nm 處測定吸光值。配制濃度為0.003、0.006、0.009、0.012、0.015、0.018 mg/mL 的VC 溶液作為對照。根據(jù)公式(3)計(jì)算清除率。

式中:A3為ABTS 自由基和蒸餾水的吸光值；A4為紫萁黃酮提取液和ABTS 自由基的吸光值；A5為紫萁黃酮提取液和蒸餾水的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用軟件Design－Expert 12、Origin 2018、SPSS 26 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對紫萁黃酮得率的影響 由圖1可知，紫萁黃酮得率隨超聲時(shí)間的延長呈先增后減的趨勢，20 min 時(shí)得率最高，為3.113%；繼續(xù)延長超聲時(shí)間，得率顯著減少，可能是超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)、攪拌作用破壞了黃酮的結(jié)構(gòu)[27]，影響紫萁黃酮得率。因此超聲時(shí)間選擇20 min 為宜。

圖1 超聲時(shí)間對紫萁黃酮得率的影響

2.1.2 纖維素酶添加量對紫箕黃酮得率的影響

由圖2 可知，隨著纖維素酶添加量的增加，紫萁黃酮的得率先增加后減少，添加量為1.0%時(shí)得率最高，為3.468%；之后，紫萁黃酮得率隨著酶添加量的增加反而顯著性降低，可能是隨著纖維素酶添加量的增加，酶和分解后的纖維素會(huì)阻止黃酮類化合物與提取溶劑的接觸，導(dǎo)致紫萁黃酮得率降低[21]。因此選擇0.6%、1.0%、1.4%的纖維素酶添加量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 纖維素酶添加量對紫萁黃酮得率的影響

2.1.3 液料比對紫箕黃酮得率的影響 由圖3可知，在液料比10～40 mL/g 范圍內(nèi)，隨著液料比的增加，紫萁黃酮得率呈顯著上升趨勢，液料比為40 mL/g 時(shí)得率最高(3.624%)；繼續(xù)增加液料比，紫萁黃酮得率顯著下降。原因可能是隨著液料比增大，液體體積增加，體系黏度降低，傳質(zhì)過程加快，紫萁黃酮得率相應(yīng)得到提高；當(dāng)液料比增加到一定程度，體系中可能會(huì)有一些可溶性物質(zhì)隨溶劑溶出，導(dǎo)致體系黏度上升，擴(kuò)散系數(shù)隨之降低，從而導(dǎo)致紫萁黃酮得率下降[28]。綜上，選擇30、40、50 mL/g 的液料比進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 液料比對紫萁黃酮得率的影響

2.1.4 乙醇濃度對紫箕黃酮得率的影響 由圖4可知，乙醇濃度為40%時(shí)，紫萁黃酮得率達(dá)到最高峰3.513%；再繼續(xù)升高乙醇濃度，紫萁黃酮得率呈顯著下降趨勢。乙醇對細(xì)胞穿透能力強(qiáng)，溶解性好，用不同濃度的乙醇處理紫萁粉時(shí)，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外形成濃度差，有利于細(xì)胞內(nèi)部紫萁黃酮的溶出；當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，可能紫萁黃酮的溶出已經(jīng)趨于飽和，而隨著乙醇濃度的持續(xù)增加，一些能夠溶解于乙醇的雜質(zhì)、色素等溶出，導(dǎo)致紫萁黃酮得率出現(xiàn)下降趨勢；同時(shí)較高濃度的乙醇可能也會(huì)抑制纖維素酶活性，導(dǎo)致黃酮溶出變少[29]。綜上，選擇30%、40%、50%的乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 乙醇濃度對紫萁黃酮得率的影響

2.1.5 酶解時(shí)間對紫箕黃酮得率的影響 由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長，紫萁黃酮得率呈先升后降趨勢，40 min 時(shí)得率達(dá)到最高，為3.801%，之后得率顯著下降。原因可能是隨著酶解時(shí)間的延長，纖維素酶與底物的作用越充分，細(xì)胞壁被完全破壞，紫萁細(xì)胞內(nèi)部黃酮充分溶出；但當(dāng)繼續(xù)延長酶解時(shí)間，底物濃度降低或者產(chǎn)物積累會(huì)對酶的活性有抑制作用[30]。故酶解時(shí)間選擇40 min 為宜。

圖5 酶解時(shí)間對紫萁黃酮得率的影響

2.1.6 超聲功率對紫箕黃酮得率的影響 由圖6可知，隨著超聲功率的增大，紫萁黃酮得率呈先升后減趨勢，超聲功率為300 W 時(shí)得率達(dá)到最大值，為4.156%，之后得率顯著下降。原因是隨著超聲功率的增大，所產(chǎn)生的空化效應(yīng)及振蕩作用相應(yīng)增強(qiáng)，對細(xì)胞壁的破壞程度也增強(qiáng)，有利于細(xì)胞內(nèi)黃酮的溶出，紫萁黃酮得率升高；然而超聲功率過大可能會(huì)引起黃酮內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致黃酮損失，因此紫萁黃酮得率降低[31]。綜上，選擇200、300、400 W 的超聲功率進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖6 超聲功率對紫萁黃酮得率的影響

2.2 紫萁黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及回歸模型方差分析由表2 所示，通過回歸分析得到二次多項(xiàng)回歸方程為:Y＝4.310－0.003A＋0.200B＋0.100C＋0.007D－0.018AB＋0. 025AC ＋0. 0170AD － 0. 055BC －0.012BD＋0.035CD－0.081A2－0.240B2－0.440C2－0.230D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3 可知，模型P<0.0001，表示該回歸模型差異極顯著；失擬項(xiàng)的P>0.05，表明模型與試驗(yàn)因素?cái)M合較好；模型的決定系數(shù)R2＝0.9899，調(diào)整系數(shù)R2Adj＝0.9798，進(jìn)一步表明此模型精確度高，試驗(yàn)設(shè)計(jì)較可靠，可用此模型對紫萁黃酮提取工藝進(jìn)行分析和理論預(yù)測。

從表3 可看出，一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對紫萁黃酮得率的影響達(dá)到差異高度顯著水平(P<0.01)，交互項(xiàng)BC 對紫萁黃酮得率的影響達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，這說明各因素綜合交互影響紫萁黃酮得率。4 個(gè)因素對紫萁黃酮得率影響的順序?yàn)?液料比(B)>乙醇濃度(C)>超聲功率(D)>纖維素酶添加量(A)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)二次模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析 響應(yīng)面圖曲面坡度越陡、等高線越密集，表示響應(yīng)面值受該因素影響就越大。從圖7 可看出，乙醇濃度與液料比交互作用的響應(yīng)面圖最陡峭，等高線較密集，說明該交互作用對紫萁黃酮提取率的影響最顯著，而其余交互項(xiàng)顯著性相對較差。

圖7 兩兩因素交互作用對黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過回歸模型預(yù)測，得到最佳提取工藝條件為:超聲時(shí)間20 min、纖維素酶添加量0.98%、液料比44 mL/g、乙醇濃度40%、酶解時(shí)間40 min、超聲功率300 W，得率4.357%。結(jié)合實(shí)際情況，將預(yù)測最佳工藝條件優(yōu)化為:纖維素酶添加量0.98%、液料比44 mL/g、乙醇濃度40%、超聲功率300 W。同時(shí)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際得率為(4.371±0.020)%，與模型預(yù)測值相差較小，證實(shí)了該模型的可靠性和有效性，具有一定實(shí)用價(jià)值。

2.3 紫萁黃酮抗氧化活性結(jié)果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由圖8 可知，紫萁黃酮對DPPH 自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到93.23%，表明其具有一定的量效關(guān)系。通過計(jì)算，紫萁黃酮與VC 對DPPH 自由基清除率的IC50值分別為0.169 、0.015 mg/mL。

圖8 紫萁黃酮與VC 對DPPH 自由基的清除率

2.3.2 ABTS 自由基清除能力 由圖9 可知，隨著紫萁黃酮質(zhì)量濃度的增大，其對ABTS 自由基的清除率不斷升高，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL時(shí)，清除率為85.72%，表明其具有一定的量效關(guān)系。通過計(jì)算，紫萁黃酮與VC 對ABTS 自由基清除率的IC50值分別為0.101、0.008 mg/mL。

圖9 紫萁黃酮VC 對ABTS 自由基的清除率

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波酶法輔助提取紫萁黃酮，考察了6 個(gè)因素對紫萁黃酮得率的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取工藝條件為:超聲時(shí)間20 min、纖維素酶添加量0.98%、液料比44 mL/g、乙醇濃度40%、纖維素酶解時(shí)間40 min、超聲功率300 W，得率可達(dá)4.371%。這為袁亮等[32]采用80%乙醇提取陜南紫萁黃酮得率的2.8 倍，田國政等[15]采用60%乙醇提取湖北紫萁黃酮得率的3.4 倍，可見超聲波酶法能夠較好地對紫萁中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取。抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)紫萁黃酮清除DPPH、ABTS 自由基的IC50值分別為0.169、0.101 mg/mL，其清除率是隨紫萁黃酮質(zhì)量濃度的升高而加強(qiáng)，具有一定的量效關(guān)系。該研究結(jié)果可為紫萁資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。