分子標記輔助選擇創制小麥抗白粉病基因聚合體

高月，郭秀林，趙敏，李國良*

（1.河北工程大學園林與生態工程學院，河北 邯鄲 056000；2.河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所/河北省植物轉基因中心重點實驗室，河北 石家莊 050051）

小麥為世界主要糧食作物之一，其高產、穩產是維護糧食安全與社會穩定的重要保障。由于耕作、氣候等因素的影響，致使小麥白粉病、銹病、赤霉病等頻發，嚴重影響小麥產量和品質[1]。小麥白粉病是由小麥白粉病菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的一種氣傳性真菌病害，流行范圍廣、強度高、變異快，造成小麥大幅度減產，歐美病害嚴重地區小麥減產高達20%，在亞洲、非洲等冷涼及溫暖潮濕地區也均嚴重發生[2]。小麥對白粉病的抗性是由抗病基因決定的，因此，攜帶何種抗白粉病基因是決定小麥抗病與否的關鍵。傳統育種方法選擇周期長，且效率低。利用分子標記輔助選育抗病基因聚合小麥新種質，可縮短育種周期，提高基因檢測準確率。

目前，國際玉米和小麥改良中心已記載大量與抗病相關的分子標記，有100多個白粉病抗性基因（Pm）和等位變異基因被鑒定，156個QTL被定位[3，4]，但只有部分Pm基因表現出有效抗性。來源于阿富汗地方小麥品種的抗白粉病基因Pm59，對美國大平原發生的小麥白粉病產生有效的抗病性[5]。濟麥23含有抗白粉病基因PmJM23，該基因具有白粉病廣譜抗性，位于5D染色體的短臂上，煙臺大學利用濟麥23創制了一系列農藝性狀優良且高抗白粉病的種系[6]。曹廷杰等[7]發現Pm2或其等位基因抗性較好且比較穩定，適合在我國部分麥區發揮抗病優勢。Pm21源于簇毛麥（Heuchera villosa）染色體6V的短臂，對絕大多數白粉菌生理小種表現免疫，在我國北方冬麥區具有有效的廣譜抗性，且不同的遺傳背景下抗病表現穩定，是已知最好的抗白粉病基因[8]。Pm35源于粗山羊草（Aegilops tauschii），定位于染色體5D的長臂，與同在5D染色體上的Pm2和Pm34對白粉菌的反應不同，遺傳上獨立[9]。良星99先后通過河北省、國家品種審定，是我國北方重要的小麥品種[4]，因攜帶2B染色體長臂單基因Pm52，對白粉病表現高抗[10]。

自然界白粉病原菌不斷變異，但小麥品種抗源單一，單個基因抗性逐漸喪失，造成病害傳播速度快、范圍廣，流行趨勢難以控制。為了預防和應對不斷變異的白粉病，育種工作者越來越重視聚多個抗白粉病基因于一體的新種質創制。美國、英國、加拿大等均通過抗病基因聚合育成了小麥抗病新品種[11]。我國也有科研工作者進行了抗白粉病基因聚合研究。高安禮等[12]創制了一批聚合多基因的抗病植株，如Pm2+Pm4a+Pm21、Pm2+Pm21、Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a，這些基因單獨存在時抗性低，但聚合后抗性表現較好。董娜等[8]利用分子標記輔助選擇技術進行了Pm21與Pm13抗病基因聚合，抗性鑒定結果表明，聚合Pm21與Pm13的株系抗病性良好，整體表現免疫或高抗，Pm21對小麥白粉病的抗性優于Pm13，且聚合后基因間不存在負向作用。因此，利用分子標記輔助選擇技術將多個抗白粉病基因聚合，可提高小麥抗病性，有效防治白粉病。

以攜帶不同抗白粉病基因的小麥品種為供體，以攜帶抗白粉病基因的當地小麥主栽品種為受體材料，采用兩兩雜交、回交的方法，利用分子標記輔助選擇技術進行抗白粉病基因聚合，創制攜帶多個抗病基因的新種質，可為小麥抗病育種提供種質資源，對于減少小麥生產損失，降低農藥用量和殘留，以及提升社會、經濟和生態效益均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 小麥材料

抗白粉病基因Pm21的供體親本為金禾9123，抗白粉病基因Pm35的供體親本為普冰01；受體親本為良星99，攜帶抗白粉病基因Pm52。

1.2 試驗方法

1.2.1 兩兩雜交法聚合抗白粉病基因 以小麥骨干品種良星99為受體親本，分別以金禾9123和普冰01為供體親本，兩兩雜交獲得F1代；F1代之間再進行雜交，獲得三親本雜交系；再利用三親本雜交系與良星99進行回交轉育，創制含有2個及以上抗病基因的新種質材料。

1.2.2 小麥基因組DNA的提取 取小麥葉片0.1 g置于2 mL離心管中，液氮冷凍后磨碎，采用CTAB法[13]提取小麥基因組DNA。

1.2.3 分子標記輔助選擇鑒定抗病基因 搜索與抗病基因Pm21、Pm35和Pm52連鎖的分子標記[14，9，15]，在供體親本和受體親本之間進行多態性檢測。以小麥葉片基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶進行PCR擴增，擴增體系為2×Flash Hot Start Master Mix 5 μL、引物0.2 μmol/L、模板DNA 40～60 ng，用dd·H2O補至10 μL。反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，57℃（Pm21SCAR1265，Xcfd26）/60℃（Xgwm120）退火40 s，72℃延伸1 min，共38個循環；72℃充分延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳（Pm21）或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Pm35和Pm52），經銀染、顯色步驟，檢測擴增產物。

2 結果與分析

2.1 分子標記有效性鑒定

參照已有與抗病基因Pm21、Pm35和Pm52緊密連鎖的分子標記，在供體親本和受體親本之間進行多態性檢測，各篩選到1對有效的緊密連鎖標記，分別為Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120（表1）。其中，Pm21SCAR1265為SCAR標記，在金禾9123中能擴增出長度為1 265 bp的特異DNA條帶，在普冰01和良星99均無特異條帶擴增；Xcfd26和Xgwm120為SSR標記，分別在普冰01和良星99中擴增出特異DNA帶型（圖1）。

圖1 利用不同分子標記對小麥3個親本的多態性檢測結果Fig.1 Polymorphism identification results of three parents of wheat using different molecular markers

表1 分子標記及其信息Table 1 Molecular marker and related information

2.2 分子標記輔助選擇聚合抗白粉病基因株系

利用篩選到的分子標記Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120分別對3個親本雜交又回交良星99的BC1F1材料進行鑒定，結果顯示，利用標記Pm21SCAR1265鑒定出帶型與含有抗病基因Pm21供體親本金禾9123一致的材料3株，分別為3、10和11（圖2）；利用標記Xcfd26鑒定出帶型與含有抗病基因Pm35供體親本普冰01一致的材料3株，分別為4、10和13（圖3）；利用標記Xgwm120鑒定出與含有抗病基因Pm52供體親本良星99一致的材料14株，分別為1、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16和17（圖4）。綜合3個分子標記鑒定結果，獲得聚合3個抗白粉病基因（Pm21+Pm35+Pm52）的株系1個（10）；聚合2個抗白粉病基因的株系4個，其中聚合基因Pm21+Pm52的株系2個（3和11），聚合基因Pm35+Pm52的株系2個（4和13）。

圖2 利用分子標記Pm21SCAR1265對三親本雜交后回交材料BC1F1的檢測結果Fig.2 Identification results of molecular marker Pm21SCAR1265 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

圖3 利用分子標記Xcfd26對三親本雜交后回交材料BC1F1的檢測結果Fig.3 Identification results of molecular marker Xcfd26 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

圖4 利用分子標記Xgwm120對三親本雜交后回交材料BC1F1的檢測結果Fig.4 Identification results of molecular marker Xgwm120 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

3 結論與討論

雖然已經有100多個白粉病抗性基因（Pm）和等位變異基因被鑒定，但截至目前只有Pm1、Pm2、Pm3、Pm5、Pm8、Pm17、Pm21、Pm24、Pm38、Pm41、Pm46和Pm60這12個基因被克隆[4]，其中根據Pm21開發的SCAR分子標記Pm21SCAR1265是檢測Pm21基因有效的分子標記[14，15]，我們的試驗結果也證明了該分子標記的有效性。Pm35和Pm52均已被精細定位[4，16]，并分別開發了有效的分子標記Xcfd26和Xgwm120，在檢測Pm35和Pm52時均有特異帶型。由此可見，分子標記Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120是有效的分子標記，可以用來鑒定小麥雜交后代材料中抗白粉病基因Pm21、Pm35、Pm52是否成功導入。利用有效的分子標記檢測雜交后代，可準確、高效地檢出目標基因，加速多個抗白粉基因聚合的小麥抗病育種進程。

在生產上，為了提高小麥產量，常采用增加種植密度和水肥用量等措施，而這些措施均有利于白粉病的傳播。在大部分麥區，小麥白粉病已發展成為一種常見病害。Pm8來源于黑麥，對小麥白粉病抗性好，早期被廣泛用于小麥抗白粉病育種[17]。其后，Pm2、Pm4、Pm12、Pm13、Pm16、Pm20、Pm21、Pm35和Pm52等抗白粉病基因均被應用到小麥抗病育種[17，18]，其中Pm21、Pm35和Pm52是目前在生產實踐中有效的抗病基因，包含它們任何一個基因的小麥品種均對白粉病高抗甚至免疫[4，8，9，17]。在自然環境下，小麥白粉病菌變異快，很容易導致含有一個抗白粉病基因的小麥品種失去抗性。如Pm8過度利用，致使其對我國大部分麥區的小麥白粉病抗性已經喪失[17]。因此，創制多個抗白粉病基因聚合的新種質進而培育聚合多個抗病基因的小麥新品種，是增強小麥持久抗病性的有效途徑。攜帶Pm21的金禾9123和攜帶Pm52的良星99是我國黃淮冬麥區國審推廣品種，不僅高抗白粉病，而且產量和農藝性狀也表現良好[17，19]。本研究通過兩兩雜交、回交的方法，獲得了聚合Pm21、Pm35和Pm52這3個抗病基因的新種質。后續將在田間對獲得的材料進行抗病鑒定試驗，為利用多個抗白粉病基因進行抗病育種提供種質資源。

綜上所述，利用分子標記輔助選擇技術創制多基因聚合的抗白粉病新種質，不僅可以解決傳統表型鑒定難以快速并準確選擇2個及以上抗病基因個體的問題，還能加速抗病育種進程，提高育種效率，為小麥抗病育種提供抗性更廣譜且更持久的種質材料。這對于減少小麥生產損失，降低農藥用量，提升社會、經濟和生態效益，以及保障國家糧食安全均具有重要的現實意義。