條斑紫菜R-藻紅蛋白的分離純化及穩定性研究

董 碩，姜璐瑤，聶 巖，翟 婧，張 冉，李文軍，唐志紅

(1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003)

1 引言

藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)是存在于多種藻類的重要捕光色素蛋白。在紅、藍藻中，根據光譜性質和起源的不同，將PE分為四類：R-PE，B-PE，C-PE和b-PE[1,2]。PE含有藻膽素，因此呈熒光紅色。藻膽素通過特定的半胱氨酸殘基，共價連接在脫輔基蛋白上。紅藻和藍藻的PE中通常存在兩種色基，包括藻尿膽素(Absmax=495 nm, phycouroblilin, PUB)和藻紅膽素(Absmax=540～550 nm, phycoerythrobilin, PEB)。PE是易溶于水的色素蛋白，可用作食品、化妝品領域[3]；PE還具有高熒光強度能用于醫藥領域，并制成熒光試劑用于免疫疾病的診斷[4]；同時PE有抗氧化和抗炎活性[5～7]。在不同領域使用PE時對其純度(Amax/A280)的要求不同，Amax/A280大于0.7為食品級，大于3.0為醫藥級，大于4.0為試劑級。一般而言，藻紅蛋白的光譜學純度越高，售價越高[8～10]。

國內外已有較多關于PE分離純化的相關報道，例如：馬海樂等[11]以條斑紫菜為原料，采用硫酸銨鹽析、超濾、羥基磷灰石層析和DEAE-52陰離子交換層析獲得純化的R-PE，最高純度(A561/A280)分別為2.76和1.74；付曉蘋等[12]采用硫酸銨分級沉淀、離子交換和凝膠過濾柱層析從紅毛藻中純化得到純度為5.0的PE；Niu等[13]采用硫酸銨鹽析、擴展床吸附和離子交換層析3種分離純化方法相結合，從條斑紫菜純化得到R-PE純度為3.2；刁海平等[14]以海生紅藻多管藻為材料，采用超濾結合離子交換等3種層析方法分離純化得到試劑級的PE；趙麗等[15]采用2次雙水相層析分離純化方法，以條斑紫菜為原料純化得到R-PE的純度為1.55；郭子葉等[16]以條斑紫菜為原料，采用多次硫酸銨鹽析和兩次羥基磷灰石層次得到R-PE的純度為高于4.5。這些制備方法一般采用多步層析技術以獲得高純度的PE，其工藝復雜，得率偏低，生產成本較高，從而使高純度的PE價格居高不下，極大地限制了其應用。

我國是紫菜養殖生產大國，條斑紫菜細胞中含有豐富的藻紅蛋白，但是目前對紫菜的利用僅限于初級產品的加工，深加工技術落后。本研究以條斑紫菜作為原料，目的是得到快速、高效分離純化藻紅蛋白的方法，采用一步疏水層析法分離純化得到試劑級的R-PE，并對其穩定性進行考察，為條斑紫菜R-PE的大規模生產提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料與設備

條斑紫菜購于江蘇南通；Phenyl-sepharose FF 購于美國GE公司，SDS-PAGE電泳試劑盒及蛋白質分子量標準購于上海碧云天生物技術有限公司；其它試劑均為分析純。電熱恒溫水浴鍋(DK-98-1，常州市偉嘉儀器制造有限公司)；分析天平(TE313S-DS，德國賽多利斯集團)；超微量分光光度計(NanoOne，賽默飛世爾公司)；臺式高速冷凍離心機(CT15RT，上海天美生化儀器設備工程有限公司)；高壓雙穩電泳儀(DYY-4C，北京六一生物科技有限公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 條斑紫菜R-PE的分離純化

2.2.1.1 細胞的破碎

將新鮮藻體稱重，按照1∶10的比例懸浮于磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH7.2)中，使用組織搗碎機將藻體破碎后反復凍融4次。細胞破碎完全后進行離心(10000 r/min，10 min)處理，去除沉淀，所得上清液即為粗提液。

2.2.1.2 硫酸銨分級沉淀

取一定體積細胞破碎后的粗提液，進行硫酸銨分級沉淀，使得蛋白進一步分離。加入硫酸銨至飽和度為20%，使得蛋白質沉淀。緩慢加入硫酸銨固體粉末，邊加邊攪拌，防止硫酸銨過多造成蛋白質局部變性，充分攪拌均勻后將蛋白樣品在4 ℃下靜置10 h，樣品進行離心處理(1000 r/min，10 min)，上清液進行二步鹽析，加入硫酸銨至飽和度為40%，攪拌均勻后在4 ℃靜置10 h，離心(10000 r/min，10 min)處理，棄上清，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解。樣品進行全波長掃描，計算R-PE的純度和回收率。

2.2.1.3 疏水柱層析

疏水層析是利用蛋白質表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度下結合，在洗脫時，采用逐漸降低鹽離子濃度，利用其疏水性不同逐個的先后被洗脫下來而純化。硫酸銨分級沉淀所得蛋白純度不能達到試劑級，因此需要采用層析法進一步分離純化，使得樣品純度達到4.0以上。本實驗采用疏水層析介質Phenyl-sepharose FF(Vt=2.5 cm×10 cm)對R-PE粗提液進一步分離純化，進行梯度洗脫，控制流速，使得流速為2 mL/min，使用逐漸降低鹽離子濃度的磷酸鹽緩沖液(20 mmoL/L，pH7.2)進行洗脫，根據洗脫峰圖譜變化收集R-PE組分，進行全波長掃描計算蛋白純度和回收率。

2.2.2 R-PE含量和回收率(T)的計算

2.2.2.1 含量計算

[R-PE]=0.123×A565-0.07×A616+0.015×A650(mg/mL)

(1)

2.2.2.2 回收率計算

T=(nV[R-PE]/G)×100%

(2)

式(1)、(2)中：[R-PE]為R-PE的含量；A565為R-PE在565 nm處的特征吸收值；A616為R-PE在616 nm處的特征吸收值；A650為R-PE在650 nm處的特征吸收值；n為提取液的稀釋倍數；V為提取液的總體積；G為粗提液中R-PE含量。

2.2.3 條斑紫菜R-PE的性質研究

2.2.3.1 光譜特性

對純化后的R-PE溶液分別進行全波長掃描、熒光光譜掃描及圓二色譜測定，根據圖譜分析R-PE的最大特征吸收峰、最大發射峰和二級結構主要組成部分。

2.2.3.2 分子量測定

采用SDS-PAGE法，配制濃縮膠的濃度為4%，分離膠的濃度為12%，對粗提液和層析純化后的R-PE樣品進行亞基分子量的測定，對所得條帶分析蛋白純化結果。

2.2.4 條斑紫菜R-PE的穩定性研究

2.2.4.1 溫度對條斑紫菜R-PE穩定性的影響

取純化后相同濃度的R-PE溶液各1 mL，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下恒溫水浴處理30 min，進行穩定性研究。因PE具有很強的熒光性，因此在實驗過程中樣品要進行避光保存。對處理后的樣品進行全波長掃描，分析不同溫度條件下對R-PE穩定性的影響。

2.2.4.2 pH值對條斑紫菜R-PE穩定性的影響

取純化后相同濃度的R-PE溶液各1 mL，分別將pH值調至3、4、5、6、7、8、9，在4 ℃下避光放置24 h，進行穩定性研究。對處理后的樣品進行全波長掃描，分析不同pH值條件下對R-PE穩定性的影響。

3 結果與分析

3.1 條斑紫菜R-PE的分離純化

3.1.1 硫酸銨分級沉淀

在蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子會和蛋白質競爭水分子，引起蛋白質表面的水化膜的破會，造成蛋白質溶解度的降低，使其從溶液中沉淀析出。由于硫酸銨溫度系數小，溶解度大，且不易引起蛋白變性，因此應用最為廣泛。硫酸銨分級沉淀能夠從大量樣品粗提液中濃縮和純化部分目標蛋白質，且不會引起蛋白質的變性，是PE初步純化常用的方法。在本實驗中分別采用20%和40%飽和度的硫酸銨，對R-PE含量為0.39 mg/mL、純度(A565/A280)為0.37的藻細胞破碎液進行分級沉淀，R-PE的純度(A565/A280)達到0.83，回收率為75.36%。

3.1.2 疏水層析純化

將R-PE粗提液經硫酸銨鹽析后離心，用少量磷酸鹽緩沖液溶解沉淀。采用Phenyl-sepharose FF疏水層析介質進行純化，經洗雜、洗脫后，得到純化的R-PE，洗脫曲線如圖1所示。大多數雜蛋白在較高濃度的硫酸銨條件下流出，而R-PE在含低鹽的磷酸緩沖液洗脫時流出，說明條斑紫菜R-PE的表面疏水性較強。經過一步疏水層析后，條斑紫菜R-PE純度(A565/A280)為5.47，達到試劑純，總回收率為56.92%。

圖1 條斑紫菜R-PE洗脫圖譜

3.2 條斑紫菜R-PE的鑒定

3.2.1 光譜特性

對純化的R-PE樣品進行全波長掃描，如圖2所示。結果顯示，R-PE在498 nm和565 nm處有2個完全吸收峰，544 nm處有一肩峰，最大吸收峰位于565 nm，這與方勇等[17]報道的R-PE可見光光譜特性基本一致。565 nm處特征吸收峰是由藻紅膽素引起的，498 nm處特征吸收峰是由藻尿膽素引起的，說明條斑紫菜R-PE中含有藻紅膽素和藻尿膽素2種藻膽素。

圖2 條斑紫菜R-PE全波長掃描

對純化的R-PE樣品進行熒光光譜掃描，如圖3所示。從圖3a可以看出，R-PE的激發光譜在496 nm、540 nm和560 nm處有峰出現，最大熒光激發峰位于560 nm處；由圖3b可以看出，R-PE的最大熒光發射峰位于576 nm處左右，這與臧帆等[18]報道的研究結果基本一致，說明本研究所采用的純化方法不會影響R-PE結構的穩定性。

圖3 條斑紫菜R-PE熒光光譜

對純化的R-PE樣品進行圓二色譜測定，如圖4所示。250 nm以下為遠紫外光譜區，主要反映的是蛋白質的肽鍵結構[19]，例如α-螺旋和β-折疊。通過色譜帶能夠反映出蛋白質二級結構信息，R-PE紫外光區的圓二色譜在218 nm和221 nm處有兩個負峰，在219 nm處可見一個明顯缺口，這是α-螺旋占主導位置的圓二色譜，說明純化R-PE的二級結構元件主要為α-螺旋。

圖4 條斑紫菜R-PE的圓二色譜

3.2.2 分子量測定

將粗提液和純化后的R-PE樣品進行SDS-PAGE，如圖5所示。結果表明，分子量在14～23 kDa之間的蛋白條帶是R-PE的α和β亞基，分子量在30 kDa附近的是γ亞基，2泳道的條帶顏色深且寬度大，說明純化后的R-PE含量和純度都很高，因為兩個亞基的相對分子質量相當接近，因此2泳道出現折疊現象。文獻報道條斑紫菜R-藻紅蛋白的α、β、γ亞基分子量分別為17、19和33 kDa[20]，與本研究的結果相吻合。已知R-PE的存在形式一般為(αβ)6γ[21]，故推測條斑紫菜中R-PE的相對分子質量約為279 kDa。

圖5 條斑紫菜R-PE的SDS-PAGE圖譜

3.3 條斑紫菜R-PE的穩定性研究

3.3.1 溫度對條斑紫菜R-PE穩定性的影響

對純化所得R-PE樣品經過不同溫度水浴處理30 min后，由圖6可以看出，與對照組相比，在30～60 ℃范圍內，R-PE的特征吸收峰沒有發生太大變化，說明此時對R-PE穩定性沒有太大影響，基本保持不變。在70 ℃處理后最大特征吸收峰出現明顯下降，經過80 ℃處理后，R-PE最大特征吸收峰消失，R-PE發生了局部變性。通過上述實驗結果，說明在低于60 ℃時R-PE較為穩定，當溫度超過60 ℃時，藻紅蛋白的光吸收值(A565)會顯著降低，造成蛋白性質改變。推測超過60 ℃時R-PE的空間結構被破壞，從而對其光吸收值(A565)產生影響，因此在保存或處理條斑紫菜R-PE時應選擇低溫的環境。

圖6 不同溫度處理后R-PE的全波長掃描圖譜

3.3.2 pH對條斑紫菜R-PE穩定性的影響

對純化所得R-PE樣品經過不同pH條件處理后，如圖7所示,與對照組相比，當R-PE溶液處于pH5～7時，其在565 nm處的光吸收值沒有發生明顯變化。表明在接近中性的條件時，R-PE的光譜學性質較為穩定。但是當R-PE溶液的pH值高于7或低于5時，與對照組相比，其在565 nm處的吸光值顯著降低，且分別在pH值為3、4、10時沒有出現最大光吸收峰，推測過酸、過堿環境能造成R-PE結構的破壞，因此在保存條斑紫菜R-PE時應選擇接近中性的條件。

圖7 不同pH值處理后R-PE的全波長掃描圖譜

4 結論

本研究采用硫酸銨分級沉淀結合疏水層析法純化，獲得的R-PE純度(A565/A280)達到試劑級。通過對R-PE進行表征結果的分析，確定了其最大特征吸收峰、最大熒光發射峰、R-PE的主要二級結構和亞基分子組成。穩定性研究顯示R-PE在低于60 ℃、pH值在5～7條件下能保持相對穩定。本實驗采用一步層析法純化得到較高純度的R-PE，操作簡單，減少了純化時間和一定的工藝成本，綠色高效，為條斑紫菜資源的后續利用提供了相應的依據。