2套質譜系統臨床微生物鑒定性能評估

劉聰聰， 李佳萍， 周宏偉

（浙江大學醫學院附屬第二醫院檢驗科，浙江 杭州 310009）

1988年，Tanaka和Hillenkamp將基質輔助激光解吸電離時間飛行質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）應用于生物大分子分析，開啟了MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗領域革命性的新篇章[1]。質譜技術給微生物檢驗帶來的最大變革是對臨床微生物的鑒定能力大大提高，原有鑒定方法需要大量的手工操作，且耗時較長，質譜技術能將鑒定時間從幾個甚至幾十個小時縮短到數分鐘。值得一提的是，質譜技術對細菌超強的鑒定能力使得微生物檢驗跨入一個飛速發展的新時代，其對臨床微生物的鑒定準確率超過95%[2-3]。目前，性能得到普遍認可的微生物鑒定質譜儀主要是德國布魯克公司和法國生物梅里埃公司研發的產品。近年來，國產質譜儀的技術也趨于成熟，上海復星長征醫學科學有限公司ATSA MicroIDSys MALDI-TOF MS儀是2018年自韓國引進的新一代質譜系統，目前在我國還缺乏全面的臨床微生物鑒定性能評估。本研究對該系統在臨床微生物鑒定中的效能進行相對全面的評估，以期為臨床微生物實驗室提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2012—2020年浙江大學醫學院附屬第二醫院留存的934株臨床分離株（覆蓋28個屬，70個種或種復合體），包括革蘭陰性菌627株（覆蓋個18菌屬）、革蘭陽性菌264株（覆蓋9個菌屬）、念珠菌43株（20株熱帶念珠菌、15株白念珠菌、4株季也蒙念珠菌、2株近平滑念珠菌、2株光滑念珠菌），其中包括臨床難鑒定的鏈球菌、奈瑟菌和嗜血桿菌等菌種。另納入5株臨床常用標準菌株，包括大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、流感嗜血桿菌（ATCC 49247）和白念珠菌（ATCC 14053），標準菌株購自中國菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株復蘇培養 將所有保存菌株復蘇后，分別轉種于哥倫比亞血瓊脂培養基、巧克力培養基或沙保弱培養基（鄭州安圖生物工程股份有限公司），35 ℃孵育18～24 h，生長緩慢的菌株適當（48 h）延長孵育時間。

1.2.2 菌種鑒定 采用直接涂抹法，同時使用2套質譜系統[ASTA MicroIDSys MALDI-TOF MS儀及配套CoreDB數據庫（簡稱MicroIDSys系統，上海復星長征醫學科學有限公司）和Biotyper MS型系統及配套DB2969數據庫（簡稱Biotyper系統，德國布魯克·道爾頓公司）]對臨床分離株和標準菌株進行菌種鑒定。取少量純培養菌落直接涂抹于靶板，滴加1 μL基質液（α-氰基-4-羥基肉桂酸）。自然干燥后上機分析。當某1套或2套系統鑒定失敗，或2套系統鑒定結果不一致時，采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ，PCR）和基因測序方法作為參考方法：擴增rPorB基因并測序，比對不動桿菌屬細菌；擴增hisA基因并測序，比對伯克霍爾德菌屬細菌，擴增16S rDNA基因并測序，比對其他細菌；擴增ITS基因并測序，比對真菌。PCR擴增和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測序結果與基因文庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對，確定菌種類型。

1.2.3 結果判定 MicroIDSys系統鑒定分值>140為鑒定結果可信；分值110～140為需要重新鑒定；分值<110為鑒定失敗。Biotyper系統鑒定分值>2.000為鑒定至種水平可信；分值1.700～1.999為鑒定屬水平可信；分值<1.700為無鑒定結果。

1.3 術語定義

1.3.1 準確鑒定 系統鑒定結果可信，并與參考方法鑒定結果種水平一致。因某些菌種復合體內各種蛋白指紋圖譜相似度較高，種鑒定正確和復合體鑒定正確均認定為“準確鑒定”。本研究涉及的菌種復合體包括：（1）鮑曼不動桿菌種復合體[4]；（2）陰溝腸桿菌種復合體[5]；（3）洋蔥伯克霍爾德復合群[6]；（4）緩癥/口腔鏈球菌[7]；（5）蠟樣芽孢復合群[8]。

1.3.2 鑒定至屬水平 MicroIDSys系統僅提供菌屬名稱，Biotyper系統重復2次試驗鑒定結果均為屬水平可信，結果與參考方法結果一致，判定為鑒定至屬水平。

1.3.3 鑒定失敗 MicroIDSys系統提示“鑒定失敗”，Biotyper系統重復2次試驗鑒定結果分值均<1.700，判定為鑒定失敗。

1.3.4 鑒定錯誤 系統認為準確鑒定，但與參考方法鑒定結果不一致，判定為鑒定失敗。

2 結果

2.1 2套系統鑒定結果

MicroIDSys系統和Biotyper系統對5株標準菌株和43株念珠菌臨床分離株均能準確鑒定。對于934株臨床分離株，MicroIDSys系統的鑒定準確率為96.1%（898/934），有11株鑒定失敗，有25株鑒定錯誤（均鑒定為屬內其他菌種）；Biotyper系統的鑒定準確率為98.3%（918/934），有6株被鑒定至屬水平，2株溶血色桿菌無鑒定結果，8株鑒定錯誤。2套系統未準確鑒定結果見表1。

表1 MicroIDSys系統和Biotyper系統未準確鑒定結果

2.2 2套系統革蘭陰性菌鑒定結果

對于627株革蘭陰性菌，MicroIDSys系統的鑒定準確率為95.1%（596/627）；有9株鑒定失敗，包括3株變棲克雷伯菌、4株溶血嗜血桿菌、1株腦膜炎奈瑟菌、1株產吲哚黃桿菌；有15株鑒定錯誤，其中2株阿氏腸桿菌（陰溝腸桿菌復合群）被鑒定為神戶腸桿菌，1株潘氏變形桿菌被鑒定為奇異變形桿菌，2株流感嗜血桿菌被鑒定為副流感嗜血桿菌，8株微黃奈瑟菌被鑒定為淺黃奈瑟氏菌，2株溶血色桿菌被鑒定為紫色色桿菌。Biotyper系統的鑒定準確率為98.1%（615/627）；有4株被鑒定至屬水平（2株流感嗜血桿菌和2株微黃奈瑟菌）；2株溶血色桿菌無鑒定結果；6株鑒定錯誤，其中2株溶血嗜血桿菌被鑒定為流感嗜血桿菌，4株微黃奈瑟菌被鑒定為淺黃奈瑟菌。

2.3 2套系統革蘭陽性菌鑒定結果

對于264株革蘭陽性菌中，MicroIDSys系統的鑒定準確率為95.5%（252/264）；有2株假白喉棒狀桿菌鑒定失敗；有10株鑒定錯誤，其中2株前庭鏈球菌被鑒定為唾液鏈球菌，4株假肺炎鏈球菌有2株被鑒定為肺炎鏈球菌、2株被鑒定為緩癥鏈球，1株鼠李糖乳桿菌被鑒定為副甘酪乳桿菌，3株溶血孿生球菌被鑒定為麻疹孿生球菌。Biotyper系統的鑒定準確率98.5%（260/264），有2株被鑒定至屬水平（1株假白喉棒狀桿菌、1株前庭鏈球菌）；2株假肺炎鏈球菌鑒定錯誤，被鑒定為肺炎鏈球菌。

3 討論

MicroIDSys系統及配套CoreDB數據庫（包含2 604種細菌、真菌、分枝桿菌）是從韓國引進的新一代質譜系統。有研究結果顯示，MicroIDSys系統對5 322株細菌和酵母菌的鑒定結果與Biotyper系統的一致性很好，種水平符合率為86.1%，屬水平符合率為98.4%[9]。另有研究結果顯示， MicroIDSys系統對酵母菌的鑒定結果與分子生物學方法的符合率為95.1%（270/284）[10]；對厭氧菌的鑒定準確率為91.6%（340/370）[11]；MicroIDSys系統對63株分枝桿菌標準菌株的鑒定準確率為98.4%（62/63），對167株分枝桿菌臨床分離株的鑒定準確率為85.6%[12]。JUNG等[13]的研究結果顯示，MicroIDSys系統對臨床分離菌株的鑒定準確率為96.7%（1 988/2 055），VITEK MS微生物質譜鑒定系統（法國生物梅里埃公司）的鑒定準確率為97.3%（1 999/2 055），提示MicroIDSys系統的檢測性能與VITEK MS相當，可用于鑒定細菌和酵母菌臨床分離株。趙琳娜等[14]評價了MicroIDSys系統對169種常見微生物的鑒定效能，結果顯示，MicroIDSys系統、Autof MS全自動微生物質譜檢測系統（鄭州安圖公司）和Biotyper系統種水平鑒定準確率分別為86.4%（146/169）、91.1%（154/169）和81.7%（138/169），3種質譜系統對常見微生物均有很好的鑒定效能，其中Autof MS在可信水平上的準確鑒定率較高；但該項研究收集的菌株數量較少，覆蓋面較小。本研究收集浙江省某三級甲等綜合性醫院2012—2020年留存的大量菌株（934株）進行驗證，其中包括鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬等臨床易混淆的菌株，全面覆蓋臨床常涉及的微生物，結果顯示，MicroIDSys系統種水平鑒定準確率為96.1%，提示MicroIDSys系統在臨床微生物鑒定方面具有可靠性。

本研究鑒定失敗的細菌共11株，其中6株腦膜炎奈瑟菌和10株產吲哚金黃桿菌各有1株鑒定失敗。本研究采用最基本的直接涂抹法，雖節省時間，但和甲酸涂抹法、甲酸萃取法相比，可能會存在涂布薄厚不均或細胞破壁不理想的情況，在實際工作中可以根據菌株特性來選擇合適的前處理方法，以提升質譜系統的鑒定準確率。CoreDB數據庫中未包含變棲克雷伯菌，可能是本研究3株變棲克雷伯菌均鑒定失敗的原因。對于假白喉棒狀桿菌和溶血嗜血桿菌，雖然數據庫中有相關數據，但本研究鑒定失敗，從實驗圖譜來看，數據峰較差，可能與涂布方法和菌株生長情況有關，后續研究將對這2種細菌進行更多驗證，以排除操作不當的影響。

本研究鑒定錯誤的細菌共25株，均為屬內鑒定錯誤，且大部分是由于MicroIDSys系統數據庫缺少相關參考菌株數據所致。潘氏變形桿菌、微黃奈瑟菌、前庭鏈球菌、假肺炎鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和溶血孿生球菌均都被鑒定為屬內其他細菌，提示對于此類細菌，需要納入更多參考菌株進行數據庫建設。本研究部分鑒定錯誤的細菌，如MicroIDSys系統將阿氏腸桿菌（2株）鑒定為神戶腸桿菌，流感嗜血桿菌（2株）鑒定為副流感嗜血桿菌；Biotyper系統將2株溶血嗜血桿菌鑒定為流感嗜血桿菌，提示對于同一菌屬中基因同源性較高的菌株，采用質譜技術鑒定容易混淆。有研究結果顯示，VITEK MS微生物質譜鑒定系統將50株溶血嗜血桿菌中的21株鑒定為流感嗜血桿菌[15]。將更多參考菌株納入數據庫中，Biotyper系統對流感嗜血桿菌的鑒定錯誤率可由13.1%降低至0[16]。遺憾的是，質譜技術用于奈瑟菌的鑒定并不可靠，UNALAN-ALTINTOP等[17]發現，Biotyper系統鑒定的3株奈瑟菌經過16S rRNA測序驗證，顯示2株鑒定錯誤，僅1株和測序結果符合，尤其是淺黃奈瑟菌、深黃色奈瑟菌和Neisseria iguanae親緣關系十分接近[18]，采用質譜技術鑒定更為困難。另外，不能區分假肺炎鏈球菌和肺炎鏈球菌也是質譜技術的局限性之一[19]。對于這幾類容易混淆的菌種，質譜鑒定結果的判讀需要更加慎重，建議用更高質量的圖譜更新數據庫，以增強識別能力，避免遺漏或錯誤識別[20]。本研究中，2套系統均未能準確鑒定2株溶血色桿菌。近年來，溶血色桿菌感染人類的報道逐漸增多，該菌對很多抗菌藥物天然耐藥[21]。在2套系統的數據庫中均未包含溶血色桿菌相關信息，Biotyper系統的數據庫僅包含紫色色桿菌和鐵杉樹色桿菌， MicroIDSys系統的數據庫僅包含紫色色桿菌。本研究中的2株溶血色桿菌，Biotyper系統無鑒定結果，MicroIDSys系統鑒定為紫色色桿菌，在屬水平上有提示意義。

綜上所述，MicroIDSys系統對臨床常見微生物有較好的鑒定能力，但對一些少見菌種和容易混淆的細菌，仍需通過更新數據庫信息來提高鑒定準確率。