Affibody分子在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的研究進(jìn)展*

鄭 蕾，李欣禹，成 昭，徐 玥

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西省食品藥品安全監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065)

上世紀(jì)90年代末，由于蛋白質(zhì)工程技術(shù)的進(jìn)步，產(chǎn)生多種非抗體蛋白質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)[1-2]，Affibody分子就是其中之一，已進(jìn)入早期臨床開(kāi)發(fā)階段[3]。Affibody分子，也被稱(chēng)為親和體或者多肽適體探針，屬于新型親和配體，是通過(guò)組合蛋白工程技術(shù)，設(shè)計(jì)生產(chǎn)的一類(lèi)通用型的非免疫球蛋白親和蛋白。自20世紀(jì)80年代被首次報(bào)道以來(lái)，因其區(qū)別于一般抗體分子的結(jié)構(gòu)特征，功能方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，因此Affibody的應(yīng)用研究與發(fā)展迅速，被越來(lái)越多的研究者們所關(guān)注，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于診斷和治療領(lǐng)域[4]。作者將對(duì)Affibody技術(shù)的最新進(jìn)展，尤其是已經(jīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)行重點(diǎn)綜述。

1 Affibody分子的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

Affibody分子是基于三螺旋束結(jié)構(gòu)域框架的小(6.5-kDa)親和蛋白。作為組合蛋白質(zhì)工程產(chǎn)物，Affibody的結(jié)構(gòu)能夠根據(jù)組合蛋白質(zhì)工程方法，選擇性地進(jìn)行設(shè)計(jì)，并與所需的靶分子結(jié)合，通過(guò)體外選擇方法產(chǎn)生。Affibody分子為單鏈結(jié)構(gòu)，1997年，Nord等人發(fā)現(xiàn)[5]，Affibody分子最初是由葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域Fc段衍化而來(lái)，結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)α-螺旋亞結(jié)構(gòu)域，呈現(xiàn)出特殊的“Z段”結(jié)構(gòu)，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性高、易于改造等特點(diǎn)[6-8]，就目前已報(bào)道的臨床證據(jù)表明Affibody分子應(yīng)用于人體有效且安全。通常，三螺旋束骨架結(jié)構(gòu)中的螺旋一和二上，共包含可與受體結(jié)合的13個(gè)氨基酸殘基位置，包含58個(gè)殘基(6.5 kDa)，如果希望骨架蛋白結(jié)構(gòu)獲得新的親合活性，最直接有效的辦法就是將其受體結(jié)合部位上的氨基酸，以合成DNA進(jìn)行隨機(jī)化序列重組，可構(gòu)建獲得龐大分子庫(kù)，通過(guò)不同手段進(jìn)行分離[9-10]，改善蛋白支架的性能[11]，后續(xù)可按需求通過(guò)耦合基因型或表型配對(duì)的方法進(jìn)行選擇，與不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因融合[12-14]。小尺寸和易于工程化使Affibody分子適用于多特異性構(gòu)建體，可使Affibody獲得更優(yōu)的親和活性[15]。最新報(bào)道的Affibody分子庫(kù)設(shè)計(jì)已運(yùn)用三核苷酸密碼子混合物，而不是簡(jiǎn)并密碼子構(gòu)建，這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)的精準(zhǔn)控制(例如實(shí)現(xiàn)排除半胱氨酸和脯氨酸的目的)。三核苷酸密碼子混合物的設(shè)計(jì)使用，基于與相同靶標(biāo)之間的序列相似性和/或基于單個(gè)殘基對(duì)通過(guò)丙氨酸掃描獲得的結(jié)合貢獻(xiàn)度等信息，促進(jìn)第二代親和體分子具有更強(qiáng)的親和性和穩(wěn)定性。目前已有超過(guò)400項(xiàng)關(guān)于Affibody的研究發(fā)表，圖1是目前文獻(xiàn)報(bào)道的或已經(jīng)進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段的Affibody分子信息[16]。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道的、已上市的或正在臨床開(kāi)發(fā)階段的Affibody分子

與單克隆抗體相比，Affibody分子不僅選擇性和親和性高，具有耐熱性能，易制備儲(chǔ)存，便于化學(xué)修飾負(fù)載活性基團(tuán)產(chǎn)生新功能，因其分子量小，也具有較高的細(xì)胞/組織穿透能力，使其更容易到達(dá)抗體無(wú)法到達(dá)的靶部位，同時(shí)非特異性結(jié)合部位中未結(jié)合的Affibody也可被迅速清除[4]，利用這一性質(zhì)可通過(guò)注射放射性核素標(biāo)記的Affibody分子，短時(shí)間內(nèi)就可以獲得高對(duì)比度的圖像信息，這對(duì)于臨床診斷和手術(shù)輔助指導(dǎo)都具有重要意義。科學(xué)家們通過(guò)Affibody不同的特性，探索Affibody分子轉(zhuǎn)化應(yīng)用的潛力，開(kāi)發(fā)其在影像學(xué)和治療學(xué)方面的各項(xiàng)應(yīng)用。

2 Affibody分子在影像學(xué)方面的應(yīng)用

在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，某些特異性生物標(biāo)記物的濃度很低，一般在微摩爾甚至更低的水平，這些痕量物質(zhì)的獲取和定量意義重大，因此臨床中檢測(cè)方法的靈敏度對(duì)于疾病的早期和精確診斷至關(guān)重要。

卵巢癌在所有婦科惡性腫瘤中的死亡率最高。HER2+是具有侵襲性，使得腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的主要亞型。臨床上常規(guī)使用PET/CT對(duì)卵巢癌進(jìn)行功能成像檢測(cè)以評(píng)估治療反應(yīng)。然而，這種成像方法并不能提供有關(guān)HER2等癌癥特異性細(xì)胞表面生物標(biāo)志物存在與否的信息，可見(jiàn)傳統(tǒng)方法無(wú)法幫助醫(yī)生決定是否選擇免疫療法來(lái)控制轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，為了區(qū)分卵巢癌肺轉(zhuǎn)移中的HER2+和HER2-病變，Nomani等[17]利用基因工程改造釓(Gd)標(biāo)記的Affibody-XTEN重組載體，用于檢測(cè)卵巢癌肺轉(zhuǎn)移，對(duì)該載體進(jìn)行物理化學(xué)和生物學(xué)表征，以確定其純度、分子量、流體動(dòng)力學(xué)大小和表面電荷、血清穩(wěn)定性、內(nèi)毒素水平、松弛性和靶向HER2抗原的能力，證實(shí)通過(guò)改造的Affibody可以準(zhǔn)確獲取轉(zhuǎn)移性病變的關(guān)鍵生物學(xué)信息，與其他成像方式結(jié)合使用，以預(yù)先篩選患者并確定免疫治療的候選者，幫助醫(yī)生選擇最有效的治療策略。

Yang等[18]：設(shè)計(jì)了一種與不同功能的納米材料金(Au)和氧化鐵(Fe3O4)結(jié)合的三峰納米探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)陽(yáng)性腫瘤的成像。與其他具有單一成分的常規(guī)納米結(jié)構(gòu)不同，這種三峰納米探針能夠?qū)⒍喾N成像模式相結(jié)合，提供互補(bǔ)信息。此外，這種異質(zhì)納米探針可以為靶向EGFR蛋白和PET成像報(bào)告分子，研究表明，所得到的納米探針為人類(lèi)EGFR表達(dá)細(xì)胞和腫瘤的PET和MRI成像提供了高特異性、靈敏度和出色的腫瘤對(duì)比度，進(jìn)一步證明了異質(zhì)納米顆粒靶向EGFR及其進(jìn)一步治療診斷應(yīng)用的可行性。

Orlova等[19]將Affibody分子ZHER2:342-pep2與1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(簡(jiǎn)稱(chēng)DOTA)螯合劑進(jìn)行位點(diǎn)特異性和均相綴合，在通過(guò)肽合成的單一化學(xué)過(guò)程。DOTA-ZHER2:342-pep2自發(fā)折疊并以65 pmol/L的親和力與HER2結(jié)合。在室溫和高達(dá)90 ℃下，30 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)111In摻入量大于95%有效放射性標(biāo)記，對(duì)HER2陽(yáng)性腫瘤具有特異性。赫賽汀預(yù)處理不干擾腫瘤靶向，結(jié)果表明，放射性標(biāo)記的合成DOTA-ZHER2:342-pep2可有效應(yīng)用于臨床診斷HER2陽(yáng)性表達(dá)的體內(nèi)分子成像。

3 Affibody分子在腫瘤治療方面的應(yīng)用

在腫瘤藥物治療中，大多數(shù)藥物都因具有細(xì)胞毒性，造成患者用藥的毒副反應(yīng)大，一定程度上影響了患者的生存質(zhì)量。因此，越來(lái)越多的腫瘤治療關(guān)注靶向作用，這種作用可以使得藥物精準(zhǔn)定位腫瘤細(xì)胞達(dá)到有效的治療濃度，同時(shí)又最大程度的降低了對(duì)正常的組織器官的損害。近二十年來(lái)，Affibody參與納米給藥系統(tǒng)的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)有抗癌藥物的靶向作用，并在提高藥物溶解度、穩(wěn)定性、緩控釋、增效減毒等方面取得了豐碩的成績(jī)。將Affibody分子和抗腫瘤藥物進(jìn)行融合，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的靶向性，因此目前Affibody分子在治療學(xué)中主要應(yīng)用于抗腫瘤治療研究方向。

Zhang等[20]將G-四面體DNA膠束修飾的Affibody，結(jié)合5-氟脫氧尿苷和姜黃素，制備雙載藥DNA膠束(Cur@affi-F/GQs)，其中Affibody可靶向促進(jìn)HER2受體介導(dǎo)的攝取，用于Her2+胃癌的治療，這種納米材料可用于具有顯著溶解度差異藥物的靶向共遞送；研究了5-氟尿嘧啶—Affibody核酸納米粒用于HER2+乳腺癌[21]，為核苷類(lèi)抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了新的途徑；通過(guò)鏈間交聯(lián)或加合方法將DNA鏈與順鉑結(jié)合，制備DNA四面體-親和體納米顆粒，這種順鉑納米顆粒對(duì)乳腺癌HER2過(guò)表達(dá)細(xì)胞BT474表現(xiàn)出高選擇性和抑制作用，而在HER2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中表現(xiàn)出較低毒性[22]。設(shè)計(jì)了一種共同裝載核苷類(lèi)似物(5-氟脫氧尿苷，F(xiàn)UdR)和蒽環(huán)類(lèi)藥物(阿霉素，Dox)的特異性Affibody-DNA雜化鏈修飾的金納米顆粒(AuNP)，并證明這些納米顆粒通過(guò)誘導(dǎo)凋亡，對(duì)過(guò)表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞具有更好的協(xié)同抗腫瘤活性[23]。

HER2高表達(dá)是多數(shù)惡性腫瘤標(biāo)志物。Altai等[24]研究了靶向HER2的Affibody分子ZHER2:2891與細(xì)胞毒性美登素衍生物MC-DM1綴合用于靶向癌癥治療的潛力。所得的Affibody藥物偶聯(lián)物可作用于過(guò)度表達(dá)的HER2細(xì)胞，具有與曲妥珠單抗emtansine相似的IC50值，且不影響HER2低表達(dá)的細(xì)胞。該化合物8.5 mg/kg劑量下可被小鼠良好耐受，并顯示可以延長(zhǎng)攜帶HER2過(guò)表達(dá)腫瘤的小鼠的存活時(shí)間。Zhao等[25]報(bào)告了一種釕催化劑Ru-Affibody分子，與腫瘤細(xì)胞上的HER2受體結(jié)合并原位催化吉西他濱前藥活化，提高選擇性、抑制腫瘤生長(zhǎng)和減少副作用的，揭示了Affibody分子在HER2靶向癌癥化療中的潛力。Lan等[26]設(shè)計(jì)了一種前藥系統(tǒng)ZHER2:2891-ABD-Fcy/5-FC，該系統(tǒng)使用5-氟胞嘧啶(5-FC)和靶向HER2的Affibody蛋白分子ZHER2:2891，與酵母胞嘧啶脫氨酶(Fcy)融合以靶向HER2過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞，并將5-FC轉(zhuǎn)化為毒性顯著增加的化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。Wang等[27]使用Her2特異性Affibody負(fù)載順鉑的納米顆粒，將Her2靶向、診斷和溫度致敏集成為一體，增加了腫瘤放化療敏感性。Alavizadeh等[28]研究抗HER2-Affibody與順鉑PEG化脂質(zhì)體的偶聯(lián)，可有效提高靶向脂質(zhì)體的治療效果。Ding等[29]將Affibody載體與被重組表達(dá)為與白蛋白結(jié)合的融合區(qū)域(ABD)結(jié)合，用于延長(zhǎng)血漿半衰期，1個(gè)或3個(gè)半胱氨酸結(jié)合于細(xì)胞毒性mcDM1分子結(jié)合的C末端。得到藥物偶聯(lián)物ZHER2-ABD-mcDM1和ZHER2-ABD-mcDM13，體外表征，確定了在攜帶HER2過(guò)表達(dá)SKOV3異種移植物的小鼠中的生物分布，載藥量增加會(huì)導(dǎo)致對(duì)HER2的親和力降低，但對(duì)HER2高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。Khaw等[30]將多柔比星聯(lián)合anti-HER2-Affibody-anti-DTPA-Fab，治療HER2+乳腺癌。Xu等[31]設(shè)計(jì)了一種新型的癌細(xì)胞靶向藥物偶聯(lián)物ZHER2:2891-ABD-E3-mcDM1，可有效抑制HER2+腫瘤。

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是癌癥治療的有效靶點(diǎn)。在Jia[32]的研究中，載有順鉑的聚乙二醇化脂質(zhì)體(LS-DDP)——Affibody分子(EGFR拮抗分子)，用于EGFR高表達(dá)腫瘤，在體內(nèi)外均可主動(dòng)靶向EGFR+A431腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)了抗EGFR+腫瘤作用。(ZEGFR:1907)2是一種新開(kāi)發(fā)的二聚體親和體分子，對(duì)EGFR的細(xì)胞外部分具有高親和力。Sahlberg等[33]評(píng)估了(ZEGFR:1907)2在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和HCT116中靶向EGFR信號(hào)通路的細(xì)胞抑制作用。Ding等[34]設(shè)計(jì)了一種雙功能抗體MaAbNA(Affibody靶向EGFR1和HER2)，與阿霉素(ADM)偶聯(lián)，形成新型復(fù)合抗癌藥物MaAbNA-PEG2000-ADM，對(duì)高表達(dá)EGFR1和HER2腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度抑制作用，但在低表達(dá)細(xì)胞中毒性較小。

基于重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)由于半衰期短，臨床使用效率低。使用內(nèi)源性長(zhǎng)效蛋白(如IgG和白蛋白)作為載體的親和控制釋放可改善TRAIL的藥代動(dòng)力學(xué)特征。Yang等[35]研究了TRAIL結(jié)合Affibody分子LgBD，可增加其細(xì)胞毒性和抗腫瘤作用。Tao等[36]設(shè)計(jì)了一個(gè)三域TRAIL變體Z-ABD-TRAIL，通過(guò)將血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β(PDGFRβ)特異性親和體ZPDGFRβ和白蛋白結(jié)合域(ABD)順序融合到TRAIL的N端，從而參與精準(zhǔn)癌癥治療。

Affibody分子因其典型的高親和力、易于生產(chǎn)以及對(duì)藥物分子裝載和空間排列可控等優(yōu)勢(shì)，作為用于癌癥治療的細(xì)胞毒性藥物的載體具有很大的前景。Xia等[37]研究由Affibody分子ZHER2:342和單甲基奧瑞他汀E(MMAE)在水溶液中制備自組裝納米偶聯(lián)物，成功制備了用于靶向治療癌癥的Affibody-藥物偶聯(lián)物納米劑，具有良好生物安全性和抗癌作用。Zhang等[38將Affibody共軛RALA(affi-RA)設(shè)計(jì)用于遞送寡聚5-氟脫氧尿苷(FUdR，5-FU的代謝物)鏈，以提高5-氟尿嘧啶(5-FU)的選擇性，降低其毒性并改善其治療效果。Cho等[39]研究使用人血清白蛋白(HSA)和白蛋白結(jié)合肽(ABP)之間的強(qiáng)特異性相互作用來(lái)延長(zhǎng)尿酸氧化酶(Uox)的釋放，用于治療高尿酸血癥的治療蛋白，通過(guò)將ABP-HSA相互作用應(yīng)用于可注射水凝膠和治療性蛋白，蛋白的濃度可以在體內(nèi)長(zhǎng)期保持，延長(zhǎng)其治療效果，改善了蛋白半衰期短的問(wèn)題。Han等[40]探討了新型靶向化療藥物ZHER2:V2-培美曲塞偶聯(lián)物，用于晚期非小細(xì)胞肺癌的療效和安全性。Koduvayur等[41]將前體藥物激活酶脫氧胞苷激酶(dCK)的編碼區(qū)與抗Her2親和體和設(shè)計(jì)錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)的融合，通過(guò)促進(jìn)核苷類(lèi)似物氟達(dá)拉濱的活化來(lái)殺死癌細(xì)胞的能力，實(shí)現(xiàn)核苷類(lèi)似物的定點(diǎn)激活，解決了毒性藥物可能的脫靶問(wèn)題。Sochaj-Gregorczyk等[42]合成了包含單個(gè)半胱氨酸的3個(gè)ZHER2:2891變體，與細(xì)胞毒性成分中存在的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)進(jìn)行綴合，將細(xì)胞毒性藥物Auristatin E與識(shí)別HER2的Affibody(ZHER2:2891)偶聯(lián)，對(duì)HER2+腫瘤細(xì)胞敏感性更高。

熱敏脂質(zhì)體是用于向腫瘤遞送和釋放藥物的有吸引力的載體。Puri等[43]為了提高乳腺癌治療的靶向功效，將HER2特異性Affibody分子(ZHER2:342-Cys，8.3 kDa)綴合到脂質(zhì)體表面，改善抗癌劑的遞送。抗體偶聯(lián)光敏分子可實(shí)現(xiàn)理想的腫瘤特異性光動(dòng)力療法(PDT)，顯示出強(qiáng)大的臨床應(yīng)用潛力。Li等[44]設(shè)計(jì)了一種新的靶向光敏劑，基于非常小的靶向蛋白(一種親和體分子)與光敏化合物結(jié)合，光敏焦脫鎂葉綠酸-a(Pyro)用PEG接頭(分子量為727 Da)進(jìn)行修飾，然后與抗HER2Affibody(ZHER2:2891)蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)，提供均質(zhì)的蛋白偶聯(lián)光敏劑。

4 其 他

與單克隆抗體相比，Affibody分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)健，可耐高溫，在環(huán)境溫度下結(jié)合并經(jīng)受多重?zé)嵫h(huán)，因此已被開(kāi)發(fā)成高效的生物技術(shù)工具進(jìn)入市場(chǎng)。例如，作為MabSelect SuRe中的耐堿活性成分，用于mAb的親和純化(MabSelect SuRe，目錄號(hào)17-5438-01，GE Healthcare，Chicago，IL，USA)或作為熱啟動(dòng)PCR試劑盒的一部分，其中Affibody分子通過(guò)在環(huán)境溫度下與DNA聚合酶結(jié)合并在大量熱循環(huán)中存活來(lái)提高DNA聚合酶的保真度(Phusion Hot Start II DNA Polymerase，目錄號(hào)：F549L，Thermofisher Scientific，Waltham，MA，USA)。

5 結(jié)束語(yǔ)

目前Affibody分子因其穩(wěn)定性和特異性特點(diǎn)，為其在靶向給藥系統(tǒng)的應(yīng)用提供展示空間，將Affibody分子直接與藥物相連，通過(guò)其特異性的識(shí)別能力引導(dǎo)藥物濃集于靶部位，提高藥物體內(nèi)靶向性，減少藥物對(duì)體內(nèi)正常組織和臟器的毒副作用，為腫瘤等疾病的治療帶來(lái)新的希望。總之，Affibody分子的優(yōu)勢(shì)特征將極大程度上推動(dòng)治療性蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域的發(fā)展。