硒化猴頭菇多糖的制備、結構表征及抗增殖活性

古佩嫻，尹惠雙，胡 坤，吳小勇，鐘南京，郭 娟，黃 超，胡 勇，陳 云，王 穎，伍芳芳,*

（1.廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528458；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

猴頭菇（Hericium erinaceus），屬于擔子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬，又名猴頭、猴頭菌、猴頭蘑等，是我國傳統的食藥兩用真菌[1-2]。猴頭菇與魚翅并稱“山珍猴頭、海味燕窩”，不僅味道鮮美可口，還含有豐富的營養成分，如多糖、蛋白質、低聚糖、維生素、糖蛋白等[3-4]。作為猴頭菇的主要功能成分之一，多糖具有調節機體免疫力、抗病毒、調節腸道菌群、降血糖、抗衰老、抗氧化、保護胃黏膜等生物活性[5-10]，目前已成為國內外眾多領域的研究熱點[11]。

本課題組前期以猴頭菇子實體為原料，采用水提醇沉、Sevag去蛋白、柱層析、透析、真空冷凍干燥等工藝得到了純化多糖組分（猴頭菇純化多糖（Hericium erinaceuspolysaccharide，HEPS），總糖含量＞92%），對其單糖組成、平均分子質量、單糖殘基類型、糖苷鍵連接方式等進行了測定，初步得到了HEPS的結構特征，同時對其免疫調節活性進行了研究[12]。前期研究表明HEPS具有毒副作用小、安全性高等優點，同時能有效促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，與脂多糖、伴刀豆球蛋白對B淋巴細胞以及T淋巴細胞產生協同刺激作用，并能顯著增強小鼠巨噬細胞的免疫功能[12]。大量研究證實，絕大多數真菌多糖并不是直接殺傷腫瘤細胞，而是通過激活免疫細胞，增強患者的免疫防御系統而達到抗癌的效果[13]。同時，由于組成多糖的糖鏈上存在大量的羥基，這使多糖很容易與金屬離子形成共價配合物，呈現出更多的功能特性[13]。近年來，越來越多的研究表明硒化改性可顯著提高活性多糖對癌細胞的直接殺傷作用[14]。

硒（Se）是維持人體正常生命活動的必需微量元素之一，參與維持機體的健康與生長發育，在日常膳食中缺乏硒會增加機體心血管疾病、糖尿病等的發生風險。同時，硒還具有“抗癌之王”之稱，對多種癌細胞均具有明顯的殺傷作用[13]。但無機硒的使用劑量比較難控制，容易引起機體中毒或者遺傳毒性，這大大限制了其應用。相關研究利用抗環血酸（VC）還原亞硒酸鈉制備出紅色的單質硒（納米硒），因其具有較高的生物活性及低毒性迅速成為硒補充領域的研究熱點[15]。但由于這種紅色的單質硒具有很高的表面能，非常不穩定，極易轉變成黑色或灰色的單質硒而失活。多年來，為構建高穩定且高生物活性的納米硒，研究者一直在嘗試尋找合適的生物分子模板（穩定劑、分散劑）[16]。大量研究表明，天然多糖具有高穩定性、低毒性、結構可控、生物可降解等優點，是一種極具潛力的生物分子模板[13-14,17]。

因此，本實驗以HEPS為研究對象，在含有VC和亞硒酸鈉的氧化還原體系中，制備得到猴頭菇多糖納米硒顆粒（HEPS-Se）。采用原子吸收分光光譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀、X射線衍射儀、掃描電子顯微鏡、EDX元素分析儀、X射線光電子能譜、納米粒度儀對其結構進行表征；并研究HEPS-Se對人肺癌細胞A549、人前列腺癌細胞DU145的抗增殖作用。為猴頭菇多糖的開發應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇子實體原料來自于福建省屏南縣。人肺癌細胞A549、人前列腺癌細胞DU145、人正常肝細胞LO2中山大學醫學院；亞硒酸鈉（＞97%） 天津市化學試劑公司；VC、二甲基亞砜（均為分析純） 美國Sigma公司；溴化鉀（色譜純）、硝酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；DMEM高糖培養基、MEM培養基、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、胰蛋白酶（Trypsin）、青霉素與鏈霉素混合液（×100）、胎牛血清美國Gibco公司；CCK-8試劑盒 日本同仁化學研究所。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；HJ-6A磁力加熱攪拌器、HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；JW-3021HR高速冷凍離心機安徽嘉文儀器裝備有限公司；Affinify-1傅里葉紅外光譜儀、UV-1800紫外-可見分光光度計、AA-7000原子吸收分光光度計 日本島津公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；D8 ADVANCE X射線多晶衍射儀 德國Bruker公司；Nano-ZS激光粒度分析儀英國Malvern儀器有限公司；EVO-18掃描電子電鏡德國Zeiss公司；Axis Ultra DLD X射線光電子能譜儀英國Kratos公司。

1.3 方法

1.3.1 HEPS-Se的制備

HEPS按照Wu Fangfang等[12]方法：即采用水提醇沉、Sevag去蛋白、DEAE Sepharose fast flow柱層析及Sephadex G-100柱層析、透析、冷凍干燥等工藝所制得。HEPS的總糖含量大于92%。

HEPS-Se的制備參照Liao Wenzhen等[13]的方法并稍作改動。將新鮮配制的20 mL，3 mg/mL的HEPS溶液與20 mL，0.1 mol/L亞硒酸鈉溶液旋渦混勻后，置于25 ℃環境中磁力攪拌10 min后，在保持磁力攪拌的情況下，用注射針慢慢加入5 mL，0.4 mol/L VC溶液。置于25 ℃環境中磁力攪拌24 h。將反應液轉移至3.5 kDa透析袋中透析，每3 h換一次蒸餾水。通過VC檢測透析液直至無紅色時停止透析，收集截留液，經濃縮、冷凍干燥即為硒化純化多糖HEPS-Se樣品。

1.3.2 Se含量的測定

采用原子吸收分光光度計對樣品中的硒離子含量進行測定，稱取適量的HEPS-Se樣品，加入5 mL硝酸溶液并進行消化處理，酸趕凈后轉移至10 mL容量瓶中定容后進行分析，采用內標法測定復合物中的硒含量，以HEPS為樣品空白對照。

1.3.3 HEPS-Se的粒徑分布和Zeta電位

準確配制10 mL、1 mg/mL的硒化多糖溶液，充分溶解后，采用馬爾文納米粒度儀測定其粒度分布和Zeta電位分析，以HEPS為樣品空白對照。每個樣品重復3次。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜測定

分別取少量樣品與適量的KBr干燥粉末混合，在瑪瑙研缽中充分研磨后，在油壓機上壓成透明薄片，將薄片放入紅外光譜儀中進行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1[18]。

1.3.5 X射線衍射測定

HEPS、HEPS-Se的晶體結構由X射線多晶衍射儀測得，測定參數為：Cukα輻射、2θ掃描范圍4°～50°、管流40 mA、管壓40 kV、掃描速率4 °/min[19]。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀測猴頭菇多糖HEPS、HEPS-Se的形貌。分別取冷凍干燥后的HEPS、HEPS-Se樣品，取少量樣品將其均勻地分散在導電雙面膠上，使其固定在樣品臺上，將其放入離子濺射鍍膜儀中，在真空環境中將其表面噴金以屏蔽離子的干擾，設置掃描電子顯微鏡的鍍金條件為10 kV、15 mA，分別使用不同的放大倍數觀察猴頭菇多糖HEPS、HEPS-Se的形貌。

1.3.7 EDX元素測定

將真空冷凍干燥后的樣品用導電雙面膠均勻粘在載物臺上，用X射線分析裝置進行分析。

1.3.8 X射線光電子能譜測定

將真空冷凍干燥后的樣品用導電雙面膠均勻粘在樣品臺上，設置檢測條件為：激發源Al Kα射線，束斑400 μm，對樣品表面進行X射線光電子能譜掃描。采用Thermo ScientificTMAvantage軟件對全譜圖進行分析及分峰擬合，以C 1s=284.80 eV結合能為能量校正標準。

1.3.9 HEPS-Se對A549、DU145、LO2細胞存活率的影響

選用人肺癌細胞A549、人前列腺癌細胞DU145、人正常肝細胞LO2均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，A549與LO2所用的培養基為含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖完全培養基。DU145所用的培養基為含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的MEM培養基。

本實驗采用cck-8法考察不同質量濃度的HEPS及HEPS-Se對A549、DU145、LO2細胞增殖能力的影響[20-21]。將處于對數生長期的各細胞系用胰蛋白酶消化后，以每孔3×103個的密度接種于96 孔細胞培養板中，置于CO2培養箱中繼續培養使細胞重新貼壁。24 h后棄去培養液，實驗組加入100 μL不同質量濃度（125、250、500、1 000 μg/mL）的HEPS-Se懸液，空白對照組分別加入100 μL DMEM培養基（A549、LO2細胞）或MEM培養基（DU145細胞），每組設3個平行孔。置于培養箱中繼續培養48 h后，往每個細胞培養孔加入10 μL cck-8溶液，輕輕混勻后置于CO2培養箱中繼續培養1 h，置于酶標儀中測定450 nm處的OD值。設實驗組的OD值為A，空白對照組OD值為B，細胞存活率/%=A/B×100。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 Se元素含量

通過火焰原子吸收光譜法測得HEPS-Se中Se元素的含量為481.79 μg/g，而HEPS無Se元素檢出，說明HEPS在VC和亞硒酸鈉的氧化還原體系中，成功制備出HEPS-Se。

2.2 粒徑與電位分析

表1 HEPS和HEPS-Se的粒徑與電位分析Table 1 Particle sizes and zeta potentials of HEPS and HEPS-Se

如表1所示，在相同濃度下，HEPS-Se的粒徑比HEPS降低了49.01%。有研究表明，粒徑越小越容易被機體吸收并發揮生物活性。為了進一步考察HEPS-Se的穩定性，測定復合物粒子表面的Zeta電位。HEPS的Zeta電位為-13.00 mV，而HEPS-Se的Zeta電位為-42.10 mV，電位絕對值提高了69.12%，此結果與Liao Wenzhen等[13]的研究結果一致，表明復合物形成后，HEPS表面的羥基發生電離，使HEPS-Se表面帶的負電荷大大增加，穩定性顯著增強。上述結果也表明HEPS-Se制備成功。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖1b所示，3 400.39 cm-1附近比較寬的強吸收峰是由于HEPS-Se上的O—H伸縮振動引起的，2 913.38 cm-1以及1 727.19 cm-1處的弱吸收峰分別為C—H伸縮振動峰以及C＝O伸縮振動峰[22-23]。1 620.15 cm-1處吸收峰是由于C—H伸縮振動以及結合水引起的[13]。綜合來看，HEPS-Se中大部分的吸收峰與HEPS無明顯變化，表明HEPS的基本骨架沒有發生變化。然而，與HEPS相比，多糖納米硒表面的OH伸縮振動峰發生藍移現象（從3 326.12 cm-1移位至3 400.39 cm-1），并且C＝O伸縮振動峰從1 641.36 cm-1移位至1 620.15 cm-1，提示猴頭菇多糖的—OH、—C＝O等基團與被還原后的納米硒相結合，從而有效地阻止納米硒進一步的結合與聚集，最終形成穩定的多糖納米硒顆粒[13,24-25]。

圖1 HEPS（a）、HEPS-Se（b）的紅外光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of HEPS (a) and HEPS-Se (b)

2.4 X射線衍射分析

由圖2可知，在2θ為10°～90°范圍內，HEPS與HEPS-Se復合物的X射線衍射強度曲線相似，均只有一個峰形圓頓、峰強度較低的衍射峰，最高峰分別出現在2θ為19.68°與22.23°附近，說明HEPS與HEPS-Se復合物的結晶度均較低，不能形成單晶，而是以無定型形態存在，也說明兩者的分子剛性較差，這與其他真菌多糖的研究結果一致[24]。

圖2 HEPS（a）、HEPS-Se（b）的X射線衍射圖Fig. 2 XRD spectra of HEPS (a) and HEPS-Se (b)

2.5 掃描電子顯微鏡分析

圖3 HEPS（A）、HEPS-Se（B）的掃描電鏡圖（×10 000）Fig. 3 SEM images of HEPS (A) and HEPS-Se (B) (× 10 000)

從圖3A可以看出，經過一系列純化工藝得到的HEPS多糖鏈相互扭轉、纏繞成團，并交織彎曲成形成連續的網狀結構，這與猴頭菇水洗多糖組分的鏈構象相一致[26]，表明HEPS在溶液中以柔性鏈構象存在，分子整體不具有剛性，此結果與X射線衍射的結果一致，這可能與多糖結構中存在的α-(1→3,4)-、α-(1→6)-、β-(1→2)-糖苷鍵有關[27]。然而，硒化改性后，HEPS-Se的形貌特征發生較大的變化，如圖3B所示，HEPS-Se為形貌規則、球體均一，粒徑之間大小相近，粒子在溶液中呈分散狀態使其不容易凝結和聚集，說明HEPS-Se體系的穩定性有所增強。

2.6 EDX表面元素分析

圖4 HEPS（A）和HEPS-Se（B）的元素分析Fig. 4 EDX spectra of HEPS (A) and HEPS-Se (B)

通過對HEPS和HEPS-Se的元素進行分析可知（圖4），HEPS的元素組成比例為C∶O∶Na∶Cl∶Pt=41.50∶37.91∶4.94∶8.57∶7.08，其中少量的Na元素和Cl元素是由于洗脫過程中使用了大量的0.05 mol/L NaCl洗脫液，有少量殘留。而低劑量的Pt元素是由于掃描電子顯微鏡-EDX操作時，會在真空環境下將其表面噴金而殘留少量的Pt，C元素和O元素均來自于HEPS。而HEPS-Se的元素組成比例為C∶O∶Se∶Pt＝32.92∶24.74∶30.46∶11.87，同樣地，其中的C元素和O元素來自于HEPS，除了制備樣品噴金造成少量的Pt元素殘留，并無其他雜質元素出現，說明HEPS-Se制備成功，純度很高。

2.7 X射線光電子能譜分析

圖5 HEPS和HEPS-Se的X射線光電子能譜全譜圖（A）以及HEPS-Se的Se 3d分峰擬合圖（B）Fig. 5 Wide-range XPS spectra of HEPS and HEPS-Se (A) and Se 3d spectra of HEPS-Se (B)

為了判斷樣品中Se元素的結合價態，采用X射線光電子能譜對HEPS及HEPS-Se樣品進行全譜掃描，結果如圖5所示。HEPS的X射線光電子能譜圖中最強光電子線主要有C 1s和O 1s峰，這與EDX的測試結果一致，HEPS-Se的X射線光電子能譜圖中除了C 1s和O 1s譜峰外，還在結合能約為55.08 eV處存在Se 3d譜峰，而代表高價態硒的Se 2p，2s和1s軌道均沒有檢測到光強值（圖5A）。通過比對參考文獻[28]及Avantage數據庫中硒的價態，零價硒（納米硒）的電子結合能位于54.6～57.5 eV范圍內，由此可推斷樣品中的硒元素是以零價硒（納米硒）的形式存在。通過對50～62 eV的譜圖進行分峰擬合，發現Se 3d的2個擬合峰分別在54.90、55.69 eV處（圖5B），進一步說明HEPS-Se樣品不存在無機硒，該結果與其他多糖納米硒的研究結果一致[24,29]。

2.8 抗腫瘤細胞增殖活性

HEPS具有毒副作用小、安全性高等優點，同時能有效促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，并能顯著增強小鼠巨噬細胞的免疫功能[12]。然而，前期的預實驗結果也顯示HEPS在所測定的質量濃度梯度（100～5 000 μg/mL）范圍內對幾種常見的癌細胞（人乳腺癌細胞MCF-7、人肝癌細胞HepG2、人前列腺癌細胞PC3、人宮頸癌細胞Hela等）并未出現顯著的抑制作用。為了進一步評價硒化前后猴頭菇純化多糖樣品對癌細胞的增值抑制作用，本實驗采用cck-8法考察不同質量濃度的HEPS及HEPS-Se對人肺癌細胞A549、人前列腺癌細胞DU145、人正常肝細胞LO2增殖能力的影響[30]。

圖6 HEPS（A）、HEPS-Se（B）對DU145、A549、LO2細胞的增值抑制作用Fig. 6 Anti-proliferation effects of HEPS (A) and HEPS-Se (B) on DU145, A549 and LO2 cells

從圖6A可以看出，與空白對照組相比，HEPS在所測定的質量濃度梯度（125～1 000 μg/mL）范圍內對LO2細胞基本無細胞毒性，對DU145細胞和A549細胞的增殖作用均較弱，當HEPS的質量濃度達到最大劑量1 000 μg/mL時，2種癌細胞的存活率分別為88.10%與104.45%。然而，當HEPS硒化處理生成HEPS-Se后，HEPS-Se對2種癌細胞增殖的抑制能力顯著提高，并呈現明顯的劑量效應相關性（圖6B）。與空白對照組相比，當HEPS-Se質量濃度達到500 μg/mL時，DU145細胞和A549細胞的存活率分別為52.73%、30.46%。當其質量濃度由125 μg/mL增加至500 μg/mL，DU145細胞和A549細胞的細胞存活率分別下降了19.84%和22.28%。雖然HEPS-Se對人正常肝細胞LO2的增值也有一定的抑制作用，但是這種作用要比2種癌細胞弱（特別是高濃度時）。該結果表明HEPS-Se對癌細胞具有較顯著的抑制能力。研究表明，硒化多糖能夠促進死亡結構域相關蛋白FADD的表達，增強Caspase-3、-8和-9的活性，通過死亡受體介導的外源性細胞凋亡通路和線粒體介導的內源性細胞凋亡通路兩條途徑介導腫瘤細胞的凋亡[13]。結果表明，HEPS-Se對腫瘤的化學預防和治療方面具有一定的應用潛力，但其作用機制仍有待進一步深入研究。

3 結 論

以HEPS為研究對象，在含有VC和亞硒酸鈉的氧化還原體系中，成功制備出HEPS-Se。所制備出的HEPS-Se為形貌規則、均一的球體，其元素組成比例為C∶O∶Se∶Pt=32.92∶24.74∶30.46∶11.87；其中Se元素的含量高達481.79 μg/g，傅里葉變換紅外光譜表明猴頭菇多糖的—OH、—C＝O等基團與被還原后的納米硒相結合，從而有效地阻止納米硒間的相互結合與聚集，最終形成穩定的多糖納米硒顆粒。與HEPS相比，HEPS-Se的粒徑顯著降低，電位絕對值提高了69.12%。同時，體外抗增殖活性結果表明，HEPS-Se能顯著抑制人前列腺癌細胞DU145、人肺癌細胞A549的增值活性，并呈現明顯的劑量效應。