植物乳桿菌接種量對低鹽風干腸品質特性及風味特征的影響

劉思婷，劉馨嶼，王雯萱，王慧平，劉 騫，陳 倩，王 輝

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

風干腸是我國北方傳統自然發酵肉制品，原料肉在微生物的作用下形成獨特的色澤、質地及風味，深受消費者喜愛。食鹽是干腸制品加工過程中必不可少的腌制材料，可以提供咸味、提升鮮味，同時有效抑制腐敗菌和致病菌，保證產品品質及安全特性。由于風干腸在較長時間的風干和發酵過程中水分含量的降低，導致最終產品食鹽含量高達3.6%～4.0%[1]。高食鹽攝入量會增加患心腦血管疾病、中風、腎臟疾病等風險[2-4]。直接降低食鹽添加量是減少鈉鹽攝入最為經濟、有效的方法，但勢必會影響風干腸發酵過程中微生物的生長及其代謝情況，進而對產品風味和品質產生一系列影響，還有可能造成亞硝胺、生物胺等潛在危害因素的增加[5-7]。

乳酸菌是發酵肉制品加工中的常用發酵劑，可以通過代謝產乳酸降低體系pH值和/或產細菌素抑制致病菌及腐敗微生物的生長、產生胺氧化酶降解生物胺，保證產品安全性；還可以通過提高蛋白酶活性促進肉中蛋白質的分解，改善產品的質構特性；促進發酵過程中醛類、酮類、醇類和酸類等風味物質的形成，提升產品風味[8-11]。課題組前期研究表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是風干腸發酵過程中的核心菌株之一，對產品的品質提升和安全控制具有重要的作用[12]。

課題組前期的風干腸“減鹽試驗”發現，接種植物乳桿菌可有效改善低鹽風干腸（食鹽質量分數為1.75%）“咸香稍有不足”的缺陷，實現風干腸品質提升[13-14]，但其最佳接種量尚待研究。基于此，本研究將分離于自然發酵風干腸中的植物乳桿菌以不同接種量（105、106、107CFU/g）接種于低鹽風干腸，探究發酵過程（發酵0、3、6、9 d）中其水分含量、水分活度、pH值、剪切力、腸桿菌數和乳酸菌數的變化，并在發酵結束時（第9天）采用電子鼻和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術綜合分析植物乳桿菌接種量對風味的影響，結合感官評價確定最佳接種量，為低鹽風干腸發酵劑的使用及品質提升提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬臀肉（瘦肉）、豬背膘（肥肉）、食鹽、味素、葡萄糖、大曲酒 哈爾濱香坊區好又多超市；混合香辛料（桂皮、砂仁、丁香、肉豆蔻等）、豬小腸衣哈爾濱康泉食品商店。

MRS瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂 青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9240A鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FITOCLIMA 600PH恒溫恒濕箱葡萄牙Aralab公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；AquaLab 4TE高精度溫控水分活度儀 美國Decagon公司；PEN3電子鼻氣味分析儀德國AirSense公司；TA-XT plus質構儀 英國SMS公司；GCMS-QP 2020 NX GC-MS儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵劑的制備

植物乳桿菌分離于自然發酵的哈爾濱風干腸，并于東北農業大學肉品加工實驗室保藏，在MRS培養基中活化3 代后，將菌液在4 ℃、10 000×g離心10 min獲得菌體細胞，備用。

1.3.2 風干腸的制備

參照Wen Rongxin等[1]的方法略作修改制備4 組低鹽哈爾濱風干腸（食鹽添加量均為1.75%）：將2 250 g豬臀肉和250 g豬背膘切成1.5 cm的肉塊，加入43.75 g食鹽、125 g水、0.25 g亞硝酸鈉、25 g曲酒、25 g綿白糖、7.5 g味素、20 g混合香辛料。分別接種105、106、107CFU/g（記為LP5、LP6、LP7）植物乳桿菌，未接種的為對照組，充分攪拌后將4 組餡料分別灌入豬小腸衣中，制成直徑約3 cm長度15 cm的腸，然后置于（25±2） ℃自然風干24 h，隨后轉移至（25±2）℃、相對濕度（65±5）%的恒溫恒濕發酵箱中發酵9 d。分別于發酵第0、3、6、9天取樣用于理化指標和乳酸菌數的測定，發酵第9天的樣品用于氣味、揮發性化合物種類及含量的測定并用于感官評價。

1.3.3 pH值、水分含量和水分活度的測定

將10.0 g切碎后的風干腸與90.0 mL去離子水混合，漩渦振蕩混勻，靜置30 min后過濾混合物。使用pH計測定pH值；參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[15]中的直接干燥的方法測定水分含量；將樣品切碎后均勻鋪滿樣品盒，使用智能水分活度儀測定其水分活度。

1.3.4 剪切力的測定

參照Lü Yichao等[16]的方法略作修改，將風干腸蒸制15 min后冷卻至室溫，修整樣品保持切面平整，采用質構儀AMORS探頭進行分析，測試前速率1.5 mm/s，測試速率1.5 mm/s，測試后速率5.0 mm/s。

1.3.5 乳酸菌總數和腸桿菌數的測定

在無菌條件下去除風干腸的外層腸衣、脂肪、結締組織后切碎，取25.0 g切碎的樣品與225 mL 0.85%無菌NaCl溶液混合后均質，使用9.0 mL 0.85%無菌NaCl溶液進行10 倍梯度稀釋。將不同梯度的稀釋液分別與MRS瓊脂混合，置于（36±1）℃培養（48±2）h后測定乳酸菌數。與結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂混合，置于（36±1）℃培養（24±2）h后測定腸桿菌數，結果均以lg（CFU/g）表示。

1.3.6 電子鼻測定氣味

參照Chen Qian等[17]的方法，取3.0 g切碎的樣品置于頂空瓶，保持密封于室溫平衡30 min，隨后用電子鼻進行分析，測定10個傳感器W1C（芳香成分）、W5S（氮氧化合物）、W3C（氨類）、W6S（氫化物）、W5C（短鏈烷烴）、W1S（烷烴類化合物）、W1W（硫化物）、W2S（醇類及醛酮類）、W2W（含硫有機物）和W3S（長鏈烷烴）對于揮發性化合物的響應值。傳感器參數設置為：注入流速300 mL/min，分析時間60 s，沖洗時間60 s。

1.3.7 揮發性風味化合物的測定

采用頂空固相微萃取-GC-MS法[18]，將3.0 g均勻切碎的風干腸樣品置于20 mL頂空樣品瓶中，加入3 μL 100 mg/L鄰二氯苯（內標物質），用丁基橡膠隔墊密封，45 ℃水浴振蕩條件下平衡25 min，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶的樣品上方，45 ℃條件下萃取30 min。將萃取頭置于GC-MS進樣口解吸附3 min，采用GC-MS對揮發性化合物進行分析鑒定。

色譜條件：InertCap WaX惰性毛細管氣相色譜柱（0.25 mm×60 m，0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1 mL/min；解吸后，以5 ℃/min升溫至200 ℃，然后以10 ℃/min的速率升至230 ℃后保持2 min。

將揮發性化合物質譜與NIST 17質譜庫進行對比，相似度大于90%的作為定性結果。采用內標法對揮發性化合物進行定量分析，結果以μg/kg表示。

1.3.8 感官評價

熟制后的風干腸冷卻至室溫，切成5 mm左右的薄片，隨機置于相同的白色托盤內，并用3 位隨機數字進行標記。選取10 名具有肉品感官評價經驗的人員，經培訓后組成評價小組，對不同處理組的風干腸進行感官評定，對硬度（質地干硬7 分；質地松軟1 分）、顏色（色澤紅亮7 分；色澤暗淡1 分）、香味（干腸特有氣味濃郁7 分；氣味微弱1 分）、酸味（酸味過大7 分；酸味極輕1 分）、咸味（咸味過大7 分；咸味極輕1 分）和整體可接受性（接受性極佳7 分，接受性極差1 分）進行打分。對每個樣品評價前需用清水漱口。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌接種量對低鹽風干腸理化性質、乳酸菌數、腸桿菌數的影響

表1 不同植物乳桿菌接種量的低鹽風干腸發酵過程中理化性質、乳酸菌數和腸桿菌數的變化Table 1 Changes in physicochemical properties, lactic acid bacteria count and Enterobacteriaceae count during fermentation of low-sodium dry sausage with different L. plantarum inoculum levels

如表1所示，發酵0～3 d，各組風干腸pH值顯著降低，對照組、LP5、LP6和LP7的pH值由初始的6.42左右分別降至5.74、5.37、5.16和4.81（P＜0.05），這是因為發酵0～3 d時發酵環境適宜，接種的植物乳桿菌利用碳水化合物產生大量的乳酸，pH值大幅度的降低有利于抑制低鹽發酵肉制品中腐敗微生物及致病微生物的生長[19-21]。發酵6～9 d，對照組和LP7的pH值幾乎不變，LP5和LP6的pH值呈現顯著回升趨勢（P＜0.05），這主要歸因于腸體內腐敗微生物產生的堿性生物胺[22]。結合腸桿菌數結果可知，對照組、LP5和LP6在發酵6～9 d時腐敗微生物數量較多，導致其中生物胺含量可能相對較高，造成pH值呈回升趨勢；而未接種的對照組微生物組成較為復雜且在發酵第6天時pH值較其他組高，所以其pH值幾乎不變；另外，由于LP7接種量較高，發酵后期植物乳桿菌仍可產酸，同時抑制了腐敗微生物的產胺作用，表現為pH值幾乎不變。

在發酵0～6 d時，各組風干腸水分含量隨著發酵的進行均呈降低趨勢，但各處理組間差異不顯著（P＞0.05）；發酵結束時，LP6和LP7水分含量高于LP5和對照組。各組風干腸水分活度的變化趨勢與水分含量變化趨勢相似，隨著發酵時間的延長呈現顯著降低趨勢（P＜0.05）。發酵結束時，對照組和LP5、LP6和LP7的水分活度分別降至0.70、0.69、0.75和0.75，風干腸的細菌數量、細菌組成及其代謝均會引起pH值的變化，導致肌肉蛋白變性，進而影響蛋白空間網絡結構，從而加速水分含量及水分活度的降低[23-24]。此外，各組風干腸的剪切力隨著發酵的進行而增大，這可能由于發酵過程中水分散失以及食鹽含量的升高導致質構的改變[25-26]。

發酵第0天，對照組、LP5、LP6和LP7的乳酸菌數分別為4.15、5.08、6.05、6.94 （lg（CFU/g）），這些微生物來源于原料肉及接種的發酵劑，其可通過降低pH值和產生細菌素抑制致病菌及腐敗微生物的生長，還有一些乳酸菌被證明具有產胺氧化酶能力，可以降解生物胺提升低鹽風干腸安全性[27-28]。發酵0～3 d，各處理組中乳酸菌數顯著增加（P＜0.05），這是因為風干腸中水分含量較高，有利于乳酸菌增殖，LP5、LP6和LP7的乳酸菌數均在發酵第3天達到最大，對照組在發酵第6天達到最大，隨后均呈現顯著降低趨勢（P＜0.05），這可能是由于發酵后期腸體中可利用的水分逐漸減少以及NaCl濃度升高對乳酸菌生長產生一定的抑制作用[29]。發酵第0天時，各處理組的腸桿菌數均在3.00 （lg（CFU/g））左右，主要源于原料肉及制作環境。對照組、LP5和LP6的腸桿菌數在發酵第3天增至3.89、3.85和3.79（lg（CFU/g）），隨后均呈降低趨勢；而LP7在整個發酵過程一直呈降低趨勢，這可能是由于接種量107CFU/g時乳酸菌對腸桿菌抑制作用較明顯。

2.2 植物乳桿菌接種量對低鹽風干腸氣味的影響

電子鼻是借助傳感器模擬生物嗅覺系統，其可快速、高效地評估樣品中揮發性風味的差異[30]。如圖1A所示，傳感器W6S、W1S和W2S對于風干腸樣品中揮發性化合物的感應較其他傳感器更強，說明樣品中含有較多的氫化物、烷烴類化合物、醇和醛酮類物質。特別是傳感器W1S和W2S可以區分出各處理組風味強度的差異。

為了進一步了解不同植物乳桿菌接種量風干腸的風味差異，對電子鼻傳感器響應值進行PCA。由圖1B可知，PC1的方差貢獻率為83.9%，PC2的方差貢獻率為13.6%，累計方差貢獻率為97.5%。3個接種組相較于對照組距離均較遠，說明接種植物乳桿菌對低鹽風干腸整體風味影響較大。不同接種量的處理組在PC1上被很好地分開，接種量高的LP7位于PC1的負半軸，與W5C、W3C和W1C正相關；LP6位于PC1的正半軸，與W1S、W1W、W2S和W6S正相關。PC2能夠很好地區分樣品是否接種菌株，3個接種組均位于PC2的負半軸，對照組位于PC2正半軸，并且與W2W密切相關。

圖1 不同植物乳桿菌接種量的低鹽風干腸電子鼻分析雷達圖（A）和PCA（B）Fig. 1 Radar plot (A) and PCA plot (B) of low-sodium dry sausages with different inoculum levels of L. plantarum at the end of fermentation based on electronic nose analysis

2.3 植物乳桿菌接種量對于低鹽風干腸揮發性化合物的影響

由表2可知，發酵結束時，風干腸樣品中共檢出51種揮發性化合物，包括醛類、醇類、酮類、酸類、酯類和烯烴類等，它們主要來源于脂質氧化、氨基酸及碳水化合代謝、曲酒和香辛料[31-35]。雖然不同處理組含有諸多共有的揮發性化合物，但其含量差異較大。風干腸中共檢測出9種醇類物質，其中乙醇含量最高，主要來源于兩個途徑：1）原料中曲酒的添加；2）乳酸菌的碳水化合物代謝，同時也作為底物參與酯類化合物的形成[36]。風干腸中共檢測出3種醛類物質，作為重要的揮發性化合物，醛類在賦予發酵肉制品脂肪香味的同時還可以反映其脂肪氧化程度[37-38]。己醛含量隨植物乳桿菌接種量的增加而顯著降低（P＜0.05），這可能是由于植物乳桿菌對于脂質氧化的抑制作用[39]。風干腸中共檢測出3種酮類物質，其中2-壬酮在3個接種組中均被檢出而在對照組中未被檢出，其主要源于微生物對不飽和脂肪酸的β氧化作用[12]。檢出的酮類物質中小茴香酮含量最高，其主要源于香辛料的轉化。風干腸中共檢出8種酸類物質，酸類閾值較高，對風味貢獻作用相對較小，但其可以作為重要的前體物質參與酯類的形成，影響發酵風味的形成[14]。其中，乙酸和丁酸主要來源于乳酸菌對碳水化合物的代謝，在所有處理組中均被檢出，且隨植物乳桿菌接種量的增加乙酸和丁酸含量呈上升趨勢；辛酸主要由脂質氧化產生，接種組中含量均顯著低于對照組（P＜0.05），這可能是由于接種植物乳桿菌降低了脂質氧化水平。風干腸中共檢出11種酯類物質，主要來源于醇類和酸類的酯化反應，大多具有獨特香氣，可以賦予風干腸獨特的果香及酒香[40-41]。與對照組相比，3個接種組中的戊酸乙酯和乳酸乙酯含量均顯著升高（P＜0.05），LP6中的己酸甲酯和乙酸乙酯含量明顯高于其他處理組，這可能與植物乳桿菌進行碳水化合物代謝提供更多的酸類物質作為底物參與酯類合成有關，還可能與接種量不同導致發酵過程中微生物組成差異及微生物酯化活性的差異有關[42]，這一結果表明接種植物乳桿菌有利于風干腸中酯類物質的形成。除此之外，還有大量烯烴（月桂烯和檸檬烯）及一些其他物質（丁香酚和茴香腦）來源于制作過程中添加的香辛料，并隨發酵過程中水分的散失而濃縮。

表2 不同植物乳桿菌接種量的低鹽風干腸中揮發性化合物含量Table 2 Volatile compound contents of low-sodium dry sausages inoculated with different inoculum levels of L. plantarum at the end of fermentationμg/kg

續表2 μg/kg

為進一步探究各處理組中揮發性化合物的差異，對揮發性風味物質進行PCA。如圖2A所示，PC1的方差貢獻率為42.1%，PC2的方差貢獻率為30.8%，累計方差貢獻率為72.9%。揮發性化合物主要分布于PC1和PC2正半軸，PC1和PC2與大多數揮發性化合物（醇、酸和酯）呈正相關。PC1能夠很好地區分樣品是否接種菌株，其中對照組獨自位于PC1正半軸，與3個接種組距離較遠，說明接種植物乳桿菌對揮發性化合物形成影響較大。PC2能夠很好地區分不同接種量的處理組，LP6位于第2象限，與戊酸、乙酸乙酯和1-戊醇等揮發性化合物呈正相關。整體來看，4 組風干腸彼此之間距離較遠，且分別具有其特征風味化合物。

為了確定不同植物乳桿菌接種量的風干腸中關鍵風味化合物，更準確地分析其差異，基于PCA結果進行PLS-DA。如圖2B所示，4個處理組間相對距離較遠，對照組位于PC1正半軸，3個接種組均位于PC1負半軸，與PCA結果基本一致，造成這一結果的主要原因是植物乳桿菌的接種量。然后對其VIP值進行計算，將VIP值大于1的風味物質視為對風干腸整體氣味有較大影響的關鍵風味化合物[15]。如圖2C所示，風干腸共有32種關鍵風味化合物，其中丁香酚、γ-松油烯、乙酸乙酯、1-辛烯-3-醇和丁酸乙酯在4個處理組中均有存在，對風干腸整體氣味具有較大貢獻。結合PCA發現（圖2A），位于第1象限的γ-松油烯、1-辛烯-3-醇和丁酸乙酯，以及位于第2象限的乙酸乙酯、戊酸和庚酸等關鍵揮發性化合物均與LP6呈顯著正相關。這一結果說明，LP6中的關鍵風味物質含量最為豐富。

圖2 不同植物乳桿菌接種量的低鹽風干腸中揮發性化合物的PCA（A）、PLS-DA（B）和VIP（C）值Fig. 2 PCA plot (A), PLS-DA plot (B) and VIP values (C) volatile compound contents of low-sodium dry sausages inoculated with different inoculum levels of L. plantarum at the end of fermentation

2.4 植物乳桿菌接種量對低鹽風干腸感官評價的影響

風干腸發酵過程中pH值改變、脂質氧化和蛋白質水解，均會對風干腸感官特性產生影響[32,45-46]。如表3所示，各組風干腸樣品的硬度、顏色和咸味均無顯著差異（P＞0.05）。接種植物乳桿菌顯著提高了風干腸的香味得分（P＜0.05），可能與乳酸菌對脂質和蛋白質的分解代謝產生的風味化合物有關。隨著接種量的增加，風干腸酸味得分顯著增加（P＜0.05），但LP7酸味過重。就整體可接受性而言，LP6得分最高。因此，106CFU/g為低鹽風干腸中植物乳桿菌的最佳接種量。

表3 不同植物乳桿菌接種量低鹽風干腸感官評價Table 3 Sensory evaluation of low-salt dry fermented sausages with different inoculum levels of L. plantarum

3 結 論

研究了植物乳桿菌接種量（105、106CFU/g和107CFU/g）對低鹽風干腸品質特性及風味特征的影響。結果表明，接種植物乳桿菌能夠使得風干腸在發酵初期（0～3 d）pH值快速下降，接種量為106、107CFU/g時可提高風干腸發酵結束時水分活度。電子鼻和GC-MS結果表明，接種植物乳桿菌影響了揮發性化合物的含量。整體而言，接種發酵增加了風干腸中酸和酯類化合物整體含量，降低了醛類化合物（己醛）含量，提升了風干腸的整體氣味。結合多元統計分析可知，4 組風干腸的風味輪廓差異明顯，植物乳桿菌接種量影響乙酸乙酯和1-戊醇等低鹽風干腸中關鍵風味化合物含量。最后，結合感官評定確定了低鹽風干腸中植物乳桿菌的最佳接種量為106CFU/g。