基于RBL-2H3模型分析過敏反應效應細胞激活的差異基因

劉 艷，谷福蝶，陳慧瑩，李 焱，周 鈺，張 軍，劉 紅，曹敏杰，劉光明，劉慶梅

（集美大學海洋食品與生物工程學院，福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

過敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一，是世界上最常見的慢性疾病之一[1]。常見的過敏性疾病包括食物過敏、支氣管哮喘、變應性鼻炎、特應性皮炎等，其特征主要是IgE介導的超敏反應[2-3]。IgE介導的過敏反應能夠引起效應細胞激活，釋放組胺、蛋白酶和細胞因子等，從而誘發(fā)全身性過敏反應癥狀[4]。

肥大細胞是過敏反應中的重要效應細胞，大量存在于機體屏障組織中，如皮膚、呼吸道和胃腸道黏膜[5-7]。肥大細胞可通過多種表面受體被激活，包括高親和力受體、干細胞因子受體和細胞因子受體等。大鼠嗜堿性粒細胞（rat basophilic leukemia，RBL）-2H3表面高表達IgE高親和力受體（high affinity IgE receptor，FcεRI），通常作為肥大細胞模型用于大通量的抗過敏藥物篩選以及I型過敏反應的機理研究[8]，該方法簡便快捷、重復性高且經濟成本低。Wang Chongyang等[9]通過RBL-2H3細胞模型探究了紫檀芪可通過調控腫瘤抑制因子LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶AMPK信號分子抑制FcεRI通路；Ma Jing等[10]發(fā)現果膠寡糖能抑制RBL-2H3細胞的脫顆粒以及炎癥因子的釋放，可以作為治療過敏性疾病的潛在藥物；本課題組也用RBL-2H3細胞模型挖掘天然活性產物，為治療食物過敏的食/藥用原材料開發(fā)提供參考[11-13]。但是目前對于該細胞模型的機理探究還不夠深入。

轉錄組測序（RNA-seq）技術是通過反轉錄從RNA中獲得互補DNA序列的高通量測序技術[14]。RNA-seq是近年來轉錄組學中應用最廣泛的技術之一，它可以揭示遺傳改變與復雜生物學過程之間的關系[15]。通過RNA-seq技術，Kanagaratham等[16]研究了奧美拉唑對激活后肥大細胞的轉錄因子表達情況的影響，該藥物能抑制過敏相關的轉錄因子表達，為肥大細胞特異性的藥理靶點提供參考；Dong Na等[17]利用轉錄組學分析差異基因（differential expressed genes，DEGs）發(fā)現黃芪多糖通過調控核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路抑制脂多糖LPS誘導的豬上皮細胞產生炎癥因子。已有學者探究過敏反應效應細胞的某些信號通路[16,18]，但針對RBL-2H3細胞激活的轉錄組信息全面分析還鮮見報道。因此本研究以IgE介導的RBL-2H3細胞為過敏反應模型，通過RNA-seq技術對RBL-2H3細胞激活后表達差異顯著的基因及其參與的信號通路進行分析，以期為IgE介導的過敏反應潛在靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RBL-2H3細胞 上海復祥生物技術有限公司；最低必需液體培養(yǎng)基（Eagle’s minimum essential medium，EMEM） 美國HyClone公司；胎牛血清 美國Gemini生物科技公司；抗二硝基苯單克隆抗體 美國Sigma公司；二硝基苯偶聯牛血清白蛋白（dinitrophenol-bovine serum albumin，DNP-BSA）、氟代五氯丙酮 美國Biosearch公司；組胺酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 德國IBL公司；小鼠白細胞介素4/6 ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-αELISA試劑盒 美國Perprotech公司；其他試劑為國產分析純。

分別稱取NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、NaHCO31.0 g以及NaH2PO40.05 g，加蒸餾水溶解，接著加入CaCl20.2 g及MgCl20.1 g，經磁力攪拌均勻后定容至1 L。量取50 mL的上述緩沖液加入50 mg葡萄糖，充分溶解后經0.22 μm過濾器過濾除菌后使用（臺式緩沖液）；量取50 mL臺式緩沖液加入50 μL的Triton-X 100，振蕩均勻后待用（細胞裂解液）。

1.2 儀器與設備

Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱 德國Memmert公司；SG-403生物安全柜 美國的Baker公司；Infinite M200 PRO酶標儀 德國Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 RBL-2H3細胞的培養(yǎng)與模型構建

RBL-2H3細胞按照5×105個/孔培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的EMEM培養(yǎng)液（2 mL培養(yǎng)液/孔）中。所使用的6 孔板置于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱，待細胞長滿培養(yǎng)板80%（2～3 d）后進行傳代。

參照Liu Qingmei等[12]的方法，將抗二硝基苯單克隆抗體anti-DNP-IgE（終質量濃度為100 ng/mL）加入含有RBL-2H3細胞懸液的10% FBS-EMEM培養(yǎng)液中，充分混合后將細胞懸液移入96 孔板中（細胞數5×104個/孔）。12～16 h后棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌后，接著用臺式緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)，加入不同質量濃度的DNP-BSA（終質量濃度分別為0、100、200、500、1 000 ng/mL，其中未添加DNP-BSA為陰性對照組），刺激RBL-2H3細胞，15 min后收集部分上清液，通過ELISA測定組胺的釋放量。1 h后回收細胞上清液，再加細胞裂解液裂解細胞；最后用25 μL上清液或細胞裂解液分別加入96 孔板，每孔加100 μL 1.2 mmol/L的氟代五氯丙酮試劑，37 ℃反應30 min，用酶標儀測定熒光值（激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm）。

根據β-氨基己糖苷酶確定合適的DNP-BSA質量濃度（500 ng/mL），用500 ng/mL終質量濃度的DNP-BSA處理IgE敏化后的RBL-2H3細胞，收集細胞培養(yǎng)上清液，通過ELISA測定IL-4（培養(yǎng)4 h）以及TNF-α（培養(yǎng)6 h）的產生量[19]。

1.3.2 RNA-seq技術

按照1.3.1節(jié)方法，RBL-2H3細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后棄去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液洗兩次，每孔加入100 μL細胞裂解液，充分裂解細胞后將裂解液轉移到2 mL的無RNA酶離心管，在室溫下靜置5 min，置于-80 ℃保存，用于RNA-seq。在IgE介導的RBL-2H3細胞激活模型中，其中未經過DNP-BSA刺激，即是正常的RBL-2H3細胞，釋放極少的顆粒物質和組胺、細胞因子等，即定義為陰性組；而陽性組中的RBL-2H3細胞經DNP-BSA（500 ng/mL）刺激，細胞能夠脫顆粒，釋放組胺和細胞因子，呈現強烈的過敏反應。陰性組（陰性1、2、3）及陽性組（陽性1、2、3）2 組樣品，每組設置3個平行。

收集上述樣品委托美吉生物醫(yī)藥公司進行檢測，對樣品進行文庫富集和聚合酶鏈反應擴增以便于后續(xù)Illumina平臺上機測序[20-21]。為了保證后續(xù)生物信息分析的準確性，對原始數據raw reads處理得到高質量測序數據clean reads[22]。使用TopHat2軟件將測序數據和參考基因組（大鼠基因組）進行定量比對分析。以顯著性P值和差異倍數（fold change，FC）作為DEGs的篩選條件（|log2FC|≥0.585以及P＜0.05），分析基因表達水平的差異[23-24]?；谥毕低吹鞍追纸M比對（Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups，EggNOG）數據庫和基因本體論（Gene Ontology，GO）數據庫對DEGs進行功能分類分析，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對DEGs進行Pathway注釋和富集分析[25]。

1.4 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 RBL-2H3 細胞激活模型的建立

通過探究DNP-BSA的最適質量濃度建立了IgE介導的RBL-2H3細胞激活模型，測定β-氨基己糖苷酶釋放率以及組胺釋放量，結果如圖1A、B所示，在DNPBSA質量濃度低于500 ng/mL時，β-氨基己糖苷酶釋放率以及組胺釋放量與DNP-BSA質量濃度呈正相關趨勢。DNP-BSA終質量濃度1 000 ng/mL與DNP-BSA終質量濃度500 ng/mL相比，β-氨基己糖苷酶的釋放有顯著差異，但組胺釋放差異不顯著，說明當使用500 ng/mL DNP-BSA后，RBL-2H3的激活已基本飽和，從成本的角度考慮，最終確定DNP-BSA的最適質量濃度為500 ng/mL。此外，過敏反應發(fā)生后，效應細胞不僅脫顆粒和釋放組胺等過敏介質，也會分泌大量的細胞因子（TNF-α及IL-4）誘發(fā)炎癥反應，使用500 ng/mL DNP-BSA構建IgE介導的RBL-2H3細胞激活模型，測定TNF-α以及IL-4的分泌情況，結果如圖1C所示，TNF-α產生量從120.08 pg/mL增加到253.69 pg/mL，IL-4的釋放量從15.77 pg/mL增加到77.32 pg/mL，結果表明當RBL-2H3細胞被激活時炎癥因子明顯增多，說明500 ng/mL DNP-BSA刺激RBL-2H3后，細胞發(fā)生了強過敏反應，過敏介質及相關細胞因子均顯著上調，模型構建成功。該過敏反應細胞模型的構建能夠為效應細胞激活的分子機制探究奠定基礎，也可用于抑制過敏反應的天然產物或藥物的篩選及機理分析。本課題組也利用該模型對海洋的天然活性物質的抗過敏活性進行了初篩，并且使用該模型對篩選出的活性物質以及紅藻中提取的多糖等進行了抗過敏機理的研究[5,11,26]。

圖1 RBL-2H3細胞β-氨基己糖苷酶釋放率（A）、組胺釋放量（B）以及TNF-α、IL-4釋放量（C）Fig. 1 Release rates of β-hexaminosidase (A), histamine release (B) and TNF-α and IL-4 release (C) from RBL-2H3 cells

2.2 DEGs RNA-seq數據質量分析

對RBL-2H3細胞激活后細胞樣本進行RNA-seq，得到相應的原始測序數據raw reads，經過濾得到質控后的數據clean reads。對質控后的測序數據進行質量評估，根據表1結果可知，樣品中Q20均高于98%，Q30均高于94%（Q20、Q30分別指測序質量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比，一般Q20在85%以上，Q30在80%以上），這一結果表明測序的6個樣本clean reads質量良好，沒有存在污染的情況，能夠達到RNA-seq的要求，可以用于后續(xù)分析[27]。

表1 陽性組與陰性組DEGs RNA-seq數據Table 1 Transcriptome sequencing data for positive and negative groups

2.3 DEGs表達水平分析

為了探究RBL-2H3細胞激活前后基因表達水平的數量以及動態(tài)變化，通過每百萬次讀取的轉錄本進行了不同樣品間的DEGs分析。得到有關陽性組和陰性組樣品之間DEGs的Venn圖（圖2A），其中檢測到10 880個DEGs共同表達，而在陽性組中特異表達的DEGs有199個，陰性組特異表達的DEGs有185個。為進一步了解RBL-2H3細胞激活前后DEGs的差異變化，利用DESeq2軟件分析獲得兩組間發(fā)生差異表達的基因，結果如圖2B、C所示，共有232個DEGs，其中表達量顯著下調的基因18個，表達顯著上調的基因214個。由此可見，RBL-2H3細胞激活主要體現在DEGs的上調表達，如Tnfaip3、Tnfsf8、Fos等，RBL-2H3細胞的激活會發(fā)生細胞脫顆粒，產生大量的包括TNF-α在內的炎癥因子，在一定程度上說明了顯著上調的DEGs與炎癥因子的產生有必然關系。在其他研究中，也發(fā)現效應細胞激活會導致信號通路下游蛋白迅速磷酸化從而釋放炎癥因子[16,18]。

2.4 DEGs的生物學功能分析

2.4.1 DEGs的GO功能分類統(tǒng)計

圖3為GO分析中DEGs參與的生物學過程。涉及生物過程、細胞組分和分子功能，其中歸屬于生物過程的最多（25個），主要集中在細胞過程、生物調節(jié)和生物過程調節(jié)等；涉及細胞組分有14個生物學過程，主要集中在細胞部分、細胞和細胞器；分子功能富集到的生物學過程有11個，主要集中在結合。

圖2 陽性與陰性組DEGs的Venn圖（A）、火山圖（B）和聚類分析（C）Fig. 2 Venn diagram (A), volcano map (B) and cluster analysis (C) of DEGs in between positive and negative groups

圖3 陽性組與陰性組DEGs的GO生物學功能分析Fig. 3 GO biological function analysis of DEGs between positive and negative groups

2.4.2 DEGs的EggNOG功能注釋

將DEGs注釋到EggNOG數據庫，并對DEGs的功能進行分類。由圖4可知，有127個DEGs注釋到EggNOG數據庫，占總DEGs的54.74%，注釋后的DEGs分配至13 類功能中，在不同的功能分類存在明顯差異，其中細胞內運輸、分泌和囊泡運輸（占比最多（15.95%），其次是翻譯后修飾、蛋白質折疊和分子伴侶占比9.48%，而轉錄占比7.76%，其余基因功能注釋數目占比均在5%以下。根據注釋結果得知RBL-2H3細胞激活后，轉錄因子細胞內運輸、分泌和囊泡運輸活躍，轉錄因子在細胞核中與DNA進行結合，使得胞內炎癥介質等迅速生成與釋放。Wang Chongyang等[9]的結果表明RBL-2H3細胞被激活后，一些炎癥因子及介質分泌顯著增多，而本課題組前期[26,28-29]的實驗結果顯示，在經過DNP-BSA激活后，效應細胞的β-氨基己糖苷酶、IL-4以及TNF-α等分泌明顯增加。

圖4 陽性組與陰性組DEGs的EggNOG功能分類統(tǒng)計Fig. 4 COG function classification statistics of DEGs between positive and negative groups

2.5 DEGs的KEGG信號通路分析

2.5.1 DEGs的KEGG通路富集分析

圖5 陽性組與陰性組DEGs的KEGG富集通路散點圖Fig. 5 Scatter plot of KEGG enrichment pathway analysis of DEGs between positive and negative groups

為探尋DEGs參與的主要信號轉導和生化代謝途徑，進行KEGG通路富集分析，圖5展示了部分信號通路，其中改變較為明顯的KEGG通路為TNF信號通路、Janus激酶-信號轉導與轉錄激活子（Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT）信號通路、MAPK信號通路以及Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號通路等。根據富集結果可以發(fā)現，效應細胞激活作用能夠提高MAP3K8、Junb、Nfkbia、Jun、Fos等基因表達水平，促進TNF信號通路及下游基因表達（圖5、表2），這可能是RBL-2H3細胞激活后釋放炎癥因子的重要原因之一。有研究證明，MAP3K8能夠作為治療過敏性疾病的一個關鍵靶點[30]。Chen Siyan等[31]找到與Junb相關的去泛素酶，能針對哮喘等過敏性疾病。通過KEGG通路的富集說明MAP3K8等轉錄因子在過敏性疾病中能夠起到關鍵性作用，為后續(xù)尋找靶向這些轉錄因子藥物提供一定的理論依據。

表2 與RBL-2H3激活相關的DEGsTable 2 DEGs associated with RBL-2H3 cell activation

2.5.2 DEGs的主要信號通路分析

MAPK信號通路（圖6A）、Jak-STAT信號通路（圖6B）、TNF信號通路（圖6C）以及TLR信號通路（圖6D）4 條信號通路的DEGs在陽性組和陰性組之間均顯示不同的表達量，與陰性組對比，陽性組的基因表達均有所上調。MAPK是炎癥反應中的典型下游信號通路[18]，TNF-α在激活的RBL-2H3細胞中能檢測到明顯升高[9]。當RBL-2H3細胞被激活時，MAPK等信號通路的信號分子發(fā)生磷酸化，炎癥因子得以產生并釋放，這些信號通路是過敏反應中效應細胞激活的關鍵因素，相關信號分子有望成為抑制過敏反應的關鍵靶點。例如，Motojima等[32]報道毛蕊花糖苷能夠通過下調嗜堿性粒細胞中Ca/NFAT等基因，并且通過降低JNK的磷酸化抑制MAPK信號通路，發(fā)揮減弱過敏反應的作用；Kang等[33]也研究發(fā)現，齊墩果酸抑制信號轉導與轉錄激活因子1（STAT1）信號通路，減少促炎因子的表達，從而抑制人源肥大細胞的激活；此外，也有報道稱白藜蘆醇可以抑制STAT3的磷酸化，從而影響人腸組織中肥大細胞的激活[34]；Xiong Wei等[35]發(fā)現右旋美托咪啶預處理能夠通過下調TLR信號通路，降低心肌肥大細胞的活化，抑制炎癥反應。通過本研究轉錄組信息分析和前人的相關研究，能夠得知MAPK、Jak-STAT、TNF以及TLR信號通路在過敏反應效應細胞的激活中起到了重要作用，相關信號分子有望作為防治過敏性疾病的潛在靶點。

圖6 MAPK（A）、Jak-STAT（B）、TNF（C）以及TLR（D）的DEGs情況Fig. 6 DEGs related to MAPK (A), Jak-STAT (B), TNF (C) and TLR (D) signaling pathways

2.5.3 DEGs的TNF信號通路圖

根據KEGG富集的結果選取差異較顯著的信號通路，其中差異最為明顯的為TNF信號通路，TNF在維持免疫穩(wěn)態(tài)和促進疾病發(fā)展中發(fā)揮重要的雙重作用[36]。針對TNF信號通路，繪制具體的信號傳導機制圖，如圖7所示，DNP-BSA能激活TNF信號通路，大致過程為在炎癥反應中當TNF與其受體TNFR1結合后，通過招募TRAF2/5連接蛋白誘導下游的NIK等基因活化，使得轉錄因子AP-1產生量增加，而AP-1會進入細胞核，與DNA結合，促進TNF等炎癥因子的釋放量增加，進而產生嚴重的過敏反應。有研究表明TNF是關鍵的炎癥調節(jié)因子，其通過激活2個主要信號通路，即NF-κB和MAPK實現其生物學功能[37]，對于過敏反應及炎癥反應都相當重要。Ling Yi等[38]發(fā)現，作為雷公藤的有效成分，山柰酚能夠作用于TNF信號通路，參與調控Jun、TNFR1、TNFR2、TNF-α的表達，發(fā)揮抗炎作用；Huang Linlin等[39]發(fā)現南瓜果膠多糖通過抑制MAPK信號通路減少TNF-α的分泌，發(fā)揮免疫調節(jié)活性。這說明可以將TNF信號通路作為治療過敏性疾病潛在的靶點。

圖7 DNP-BSA激活RBL-2H3細胞TNF信號通路Fig. 7 DNP-BSA promotes TNF signaling in RBL-2H3 cells

3 結 論

利用RNA-seq手段結合GO、KEGG數據庫對IgE介導的RBL-2H3細胞體外過敏模型進行轉錄組學分析，IgE介導的RBL-2H3細胞激活后，轉錄水平上體現出多數基因的上調表達，共篩選得到232個表達量有顯著差異的基因，其中顯著上調基因214個，而顯著下調的基因僅有18個；此外，DEGs的KEGG富集分析顯示，RBL-2H3細胞激活參與調控的主要為TNF、MAPK和Jak-STAT等信號通路，其中TNF信號通路富集的DEGs數量最多。雖然本研究找到一些重要的轉錄因子，如MAP3K8、Junb、Nfkbia、Jun、Fos等，仍然缺乏足夠的研究可以闡述過敏反應和這些轉錄因子之間的直接關系，這需要今后深入研究。本研究探討了RBL-2H3細胞激活的分子機制，挖掘了過敏反應效應細胞激活的重要信號通路，為IgE介導的過敏反應的防控研究提供理論依據。