基于理性設計提高假交替單胞菌κ-卡拉膠酶熱穩定性

龍柳妃，蘇 羽，陳艷紅,2，姜澤東,2，倪 輝,2，李清彪,2，朱艷冰,2,*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

卡拉膠是從海洋紅藻中提取的一類線性硫酸化多糖[1]。根據結構內是否含有3,6-脫水-D-半乳糖，以及半乳糖上硫酸基團的位置和數量，卡拉膠主要分為3 類：κ-、ι-和λ-卡拉膠[2]。研究表明，κ-卡拉膠降解得到的低分子質量卡拉膠寡糖具有更顯著的生物活性[1]，包括抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]、植物保護[6]、抗炎[7]等。卡拉膠寡糖制備方法主要包括化學法和生物酶法，反應條件溫和、特異性強的酶解法由于工藝和產物易于控制，降低環境污染，同時保留糖上的硫酸基團，具有更好的應用性[2,8]。

κ-卡拉膠酶屬于糖苷水解酶家族，是一種通過水解κ-卡拉膠內部的β-1,4-糖苷鍵降解卡拉膠的酶[9]。κ-卡拉膠酶主要來源于海洋動物和海洋微生物[2]，其中微生物來源包括假單胞菌、假交替單胞菌、噬細胞菌、弧菌、坦拉氏菌和芽孢桿菌等[10]。κ-卡拉膠酶除用于制備卡拉膠寡糖，還可以用于藻類原生質體制備、用作洗滌劑添加劑、用作生物乙醇燃料的生物催化劑、解析卡拉膠多糖的結構等，廣泛應用于食品、醫藥、生物燃料等領域[9-10]。

大多數κ-卡拉膠酶在30～40 ℃范圍內顯示出良好的酶活力和溫度穩定性[9]，熱穩定性不高。在前期研究中克隆、表達和鑒定了假交替單胞菌JMUZ2的κ-卡拉膠酶[11]，發現該酶的熱穩定性不高。κ-卡拉膠具有熱可逆凝膠化性能，當溫度在55 ℃以下時，κ-卡拉膠溶液具有很強的黏度，而當溫度在55 ℃以上時，黏度隨溫度升高而降低[12]。因此，在κ-卡拉膠酶的應用中，為了提高水解效率，需要κ-卡拉膠酶具有良好的熱穩定性。研究具有良好熱穩定性的κ-卡拉膠酶對κ-卡拉膠的高值化利用具有重要意義。

蛋白質折疊自由能是蛋白質熱穩定性的重要指標[13]，一些計算機算法用于預測突變對蛋白質折疊自由能的影響[14-17]。不同酶之間的結構差異使酶結構與功能構效關系復雜，需要針對酶的特性進行研究。目前尚鮮見改良κ-卡拉膠酶熱穩定性的分子改造研究報道。本研究擬利用基于折疊自由能分析的PoPMuSiC在線服務器，通過理性設計以提高假交替單胞菌JMUZ2的κ-卡拉膠酶熱穩定性，以期擴大該酶的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）以及pET-28a載體均由本實驗室保存。

質粒小提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；蛋白質分子質量標準、核酸分子質量標準、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、卡那霉素 生工生物工程（上海）股份有限公司；定點突變試劑盒Mut ExpressII Fast Mutagenesis Kit V2 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow美國GE Healthcare Life Sciences公司；κ-卡拉膠 深圳恒生生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

雙層全溫度恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；GEAI 600多色熒光凝膠成像儀 美國GE公司；Avanti?J-25冷凍離心機 美國Beckman公司；Epoch2T微量酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1κ-卡拉膠酶的同源建模及突變位點選取

將假交替單胞菌κ-卡拉膠酶蛋白序列利用SWISSMODEL（http://swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，模板為來自Pseudoalteromonas carrageenovora的κ-卡拉膠酶晶體結構（PDB登錄號5ocq.1.A），覆蓋范圍為2～272位氨基酸，覆蓋率達68%。將κ-卡拉膠酶的三維結構提交至在線軟件PoPMuSiC[18]，預測κ-卡拉膠酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG），選擇ΔΔG為負值并且變化顯著的氨基酸殘基作為突變位點。經分析，選擇G113Y、G113C、G113F、G113I、G113W、K155A、K155C、K155I、K155L、K155V作為突變位點。參照Mut ExpressII Fast Mutagenesis Kit V2定點突變試劑盒的說明書，依據選定的擬突變氨基酸位點，設計的引物序列如表1所示。

表1 突變引物Table 1 Primer sequences used for amplification of mutant genes

1.3.2 突變酶重組表達工程菌株的構建

在前期研究中，構建了野生型（WT）假交替單胞菌κ-卡拉膠酶重組質粒pET-28a-car。利用PCR分別擴增得到包含載體序列和突變基因序列的線性片段，PCR擴增條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，30次循環，72 ℃延伸5 min。擴增產物經DpnI酶處理后進行消化，消化產物在重組酶催化下將突變位點進行重組反應，重組產物轉化至大腸桿菌DH5α，利用卡那霉素抗性平板篩選轉化子，經測序鑒定突變酶基因序列。將含有突變酶序列的重組質粒分別轉到大腸桿菌BL21感受態細胞中，獲得突變酶重組表達工程菌株。

1.3.3κ-卡拉膠酶的表達與純化

分別取WT和突變型κ-卡拉膠酶重組表達工程菌株的單菌落，37 ℃過夜培養，再轉接至含有卡那霉素的LB液體培養基中，培養至OD600nm達到0.8后加入IPTG誘導劑至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃誘導表達18 h。將誘導表達的菌液于4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用預冷的緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、15 mmol/L咪唑，pH 8.0）懸浮。在冰浴條件下利用超聲波破碎菌體，將裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，獲得的上清液即為粗酶液。參照Ni Sepharose 6 Fast Flow使用說明書，利用親和層析對κ-卡拉膠酶進行分離純化。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析蛋白樣品的純度和分子質量。在后續的酶學性質比較分析中，WT和突變型κ-卡拉膠酶的質量濃度保持一致。

1.3.4κ-卡拉膠酶活力測定

參照張成昊等[11]方法進行κ-卡拉膠酶活力測定。每分鐘釋放1 μmoL半乳糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.3.5 溫度對κ-卡拉膠酶活力和穩定性的影響

分別在不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）下測定酶活力，以最高酶活力為100%，研究酶的最適反應溫度。將酶分別置于不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）下處理40 min后，測定酶的殘余活力，以未經處理的酶活力為100%，研究酶的熱穩定性。

1.3.6 pH值對κ-卡拉膠酶活力和穩定性的影響

分別在不同pH值條件下測定κ-卡拉膠酶活力，研究酶的最適反應pH值，所用緩沖液為50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 3.0～6.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0～11.0）。將酶分別置于pH 8.0～11.0的緩沖液中，25 ℃放置1 h后，測定酶的殘余活力，以未經處理的酶活力為100%，研究酶的pH值穩定性。

1.3.7 金屬離子對κ-卡拉膠酶活力的影響

分別添加終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L的不同金屬離子，25 ℃溫浴1 h后，測定突變κ-卡拉膠酶的活力，以不加金屬離子的酶活力為100%，研究金屬離子對突變酶活力的影響。

1.3.8κ-卡拉膠酶的動力學參數測定

分別配制不同質量濃度的κ-卡拉膠溶液（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.0 mg/mL），測定酶在不同底物質量濃度下的酶活力。利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，計算酶的動力學參數，包括米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）。

1.3.9κ-卡拉膠酶的結構分析

κ-卡拉膠酶的三維結構使用PyMOL軟件顯示和分析。利用AutoDock Vina軟件進行κ-卡拉膠酶與κ-卡拉膠四糖底物的分子對接。利用Discovery Studio軟件顯示分子對接后的相互作用力。通過Ligplot軟件統計顯示κ-卡拉膠酶與κ-卡拉膠四糖結合狀態下的疏水氨基酸殘基。利用蛋白質相互作用計算器（Protein Interaction Calculator，PIC，http://pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html）分析κ-卡拉膠酶的分子內相互作用。

1.3.10κ-卡拉膠酶的分子動力學模擬

采用軟件Gromacs進行分子動力學模擬分析。使用CHARMM27全原子力場，先進行100 ps的NVT平衡和100 ps的NPT平衡，最后進行溫度323 K、時長20 ns的自由分子動力學模擬。蛋白的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）和軌跡中原子位置的均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）分別采用gmx rmsd和gmx rmsf程序計算，分子的回旋半徑（radius gyration，Rg）則通過gmx gyrate程序計算。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 κ-卡拉膠酶突變體的構建與篩選

將同源建模后的κ-卡拉膠酶結構提交至在線軟件PoPMuSiC，計算κ-卡拉膠酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG）輔助設計酶蛋白的定點突變。一般認為，ΔΔG為負值表示突變后能量下降，預測酶的穩定性提高。根據突變后每個突變點ΔΔG的變化，選擇Gly113Try（ΔΔG：-1.35 kcal/mol）、Gly113Cys（ΔΔG：-1.31 kcal/mol）、Gly113Phe（ΔΔG：-1.30 kcal/mol）、Gly113Ile（ΔΔG：-1.00 kcal/mol）、Gly113Trp（ΔΔG：-1.20 kcal/mol）、Lys155Ala（ΔΔG：-0.95 kcal/mol）、Lys155Cys（ΔΔG：-0.92 kcal/mol）、Lys155Ile（ΔΔG：-0.98 kcal/mol）、Lys155Leu（ΔΔG：-1.04 kcal/mol）、Lys155Val（ΔΔG：-1.09 kcal/mol）作為突變位點。將所設計的突變體全部進行誘導表達后，突變體和WT的SDS-PAGE分析結果如圖1所示，可以看出蛋白條帶清晰且單一，突變體大小為48.8 kDa，與WT一致。測定κ-卡拉膠酶活力，發現大部分突變體的酶活力都有不同程度下降，突變體K155A的酶活力與WT相當（圖2）。選擇突變體K155A進行進一步的酶學性質研究。

圖1 突變體和WT的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of mutants and WT κ-carrageenase

圖2 κ-卡拉膠酶突變體的酶活力Fig. 2 Activities of mutant κ-carrageenases

2.2 溫度對酶活力和穩定性的影響

分別測定WT和K155A的最適溫度，結果見圖3A。WT的最適溫度為50 ℃，突變體K155A的最適溫度沒有發生變化。在所有檢測溫度下，K155A酶活力均不低于WT。酶的熱穩定性分析顯示，在40、45、50、55、60 ℃處理40 min后，K155A分別保留了80%、49%、46%、41%、18%的殘余酶活力，而WT分別保留了74%、41%、25%、15%、4%的殘余酶活力，在50、55 ℃和60 ℃處理后，K155A的殘余酶活力分別是WT的1.8、2.7 倍和4.5 倍（圖3B），這些結果表明，K155A比WT具有更好的熱穩定性。通過PoPMuSiC計算自由能變化輔助設計的突變體可能改變酶分子局部區域氨基酸殘基之間的相互作用，已成為提高蛋白質穩定性或酶活力的有效方法[19]。

圖3 溫度對K155A和WT κ-卡拉膠酶活力（A）和穩定性（B）的影響Fig. 3 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of K155A and WT κ-carrageenase

2.3 pH值對酶活力和穩定性的影響

不同pH值下K155A和WT的酶活力呈現相似的變化趨勢，在pH 8.0時活力均為最高，為最適反應pH值，當pH值高于8.0時，K155A和WT的酶活力均急劇降低（圖4A）。酶的pH值穩定性分析顯示，在不同pH值條件下處理后，K155A和WT在pH 8.0～11.0范圍內殘余酶活力保留在30%以上（圖4B）。

圖4 pH值對K155A和WT κ-卡拉膠酶活力（A）和穩定性（B）的影響Fig. 4 Effect of pH on the activity (A) and stability (B) of K155A and WT κ-carrageenase

2.4 金屬離子對酶活力的影響

如圖5所示，高濃度的Na+和K+對酶活力有促進作用。Ca2+在低濃度下對酶活力沒有影響，在高濃度下有抑制作用。Mn2+、Mg2+、Al3+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+和Co2+對突變酶具有不同程度的抑制作用，其中高濃度的Cu2+對K155A的抑制作用最顯著。

圖5 金屬離子對突變κ-卡拉膠酶K155A活力的影響Fig. 5 Effects of metal ions on the activity of mutant κ-carrageenase K155A

2.5 突變酶的動力學參數

以κ-卡拉膠為底物測定酶的動力學參數，對WT和突變體K155A，Km分別為1.3 mg/mL和1.9 mg/mL，Vmax分別為64.5 U/mg和65.2 U/mg，說明突變導致酶對κ-卡拉膠的親和力略有下降，Vmax基本沒有差異。

2.6 突變酶的結構分析

將K155A與κ-卡拉膠四糖進行分子對接，分析酶與底物的相互作用機理。結果顯示，K155A與κ-卡拉膠四糖的結合自由能為-13.4 kcal/mol，突變酶的整體結構類似于彎曲的β-三明治，其中β-折疊片兩兩反向堆積形成催化腔，隧道狀結構鑲嵌在三明治狀的結構中，在催化中心位置的隧道內裂縫處即為酶的底物結合處；該突變位點距離活性中心遠，這可能是該突變體不影響酶活力的原因（圖6A）。催化腔中起催化作用的氨基酸預測為E163、D165和E168，其中E163起親核催化作用，E168起酸堿催化作用，D165促進中間轉換狀態的解體，催化腔中的精氨酸殘基R260能夠特異性結合κ-卡拉膠上的硫酸酯基，起著底物識別的功能[20]。酸堿催化殘基Glu168和親核催化殘基Glu163分布于糖環兩側（圖6B、C），Arg151、Trp194、Asn269、Arg196、Ser256、Asp165和His183與κ-卡拉膠四糖形成氫鍵，Tyr64與κ-卡拉膠四糖形成Pi-Sigma型作用力，Try64、Trp67和Trp194與κ-卡拉膠四糖形成Pi-硫型作用力，Arg151和Arg260與κ-卡拉膠四糖形成鹽橋，Tyr161與κ-卡拉膠四糖形成Pi-烷基型作用力（圖6B）。

通過Ligplot軟件統計κ-卡拉膠四糖與突變酶結合狀態下的疏水氨基酸殘基，發現Trp95、Ile149、Tyr146、Glu163、Tyr64、Trp67、Trp144、Ala142、Glu168、His183、Tyr161殘基與κ-卡拉膠四糖形成了疏水相互作用（圖6D）。將這些殘基對應于三維空間模型，可以發現它們在β右旋隧道催化結構域底部形成了一個疏水性口袋，底物被包裹在該口袋中（圖6E）。為了進一步探索突變酶的結構變化，利用PIC分析了酶的分子內相互作用，κ-卡拉膠酶突變后引入額外的疏水相互作用（表2）。突變體K155A用暴露在溶劑中的疏水殘基Ala取代了WT中的極性殘基Lys，突變后κ-卡拉膠酶表現出更強的疏水相互作用。突變體K155A的熱穩定性提高可能歸因于酶分子內疏水相互作用的增強。中溫型和熱穩定型蛋白質結構研究表明，蛋白質結構與熱穩定性之間存在重要關系。在蛋白質一級結構水平，熱穩定蛋白質中存在大量的疏水殘基、帶電殘基、脯氨酸[21-23]。疏水相互作用在蛋白質折疊和空間結構穩定中起著重要作用[24-25]，是蛋白質熱穩定性的關鍵因素之一，研究表明通過增加蛋白質的疏水相互作用提高酶的熱穩定性是一種可行的策略[26-27]。

圖6 突變酶K155A與κ-卡拉膠四糖的分子對接Fig. 6 Molecular docking of K155A with κ-neocarratetraose

表2 K155A和WT κ-卡拉膠酶的分子內相互作用Table 2 Intramolecular interactions of K155A and WT κ-carrageenase

2.7 突變酶的分子動力學模擬

對WT和突變酶進行分子動力學模擬，RMSD反映出兩個分子結構相同原子間的距離以及模擬軌跡中蛋白構象的變化，用來評價體系穩定性，若RMSD隨時間的變化較小，則表明體系達到平衡狀態。圖7A顯示了在20 ns模擬過程中RMSD隨時間變化的結果，K155A在17.0 ns左右達到了平衡狀態，并且維持在0.35 nm左右進行波動。WT在15.0 ns左右達到了平衡狀態，并且維持在0.3 nm左右進行波動。進一步計算整個軌跡的RMSF變化，RMSF是指每個氨基酸殘基在整個分子動力學模擬過程中的偏振，殘基的位置偏移越大，說明該區域的構象越不穩定。如圖7B所示，WT和突變體的大部分殘基RMSF值都小于0.3 nm，而WT 150～250位氨基酸大部分高于突變體，說明突變減小了這些位置的氨基酸柔性，表明突變后酶蛋白的剛性增加，突變酶的剛性增加可能有助于其熱穩定性的提高[13]。Rg值可以研究蛋白質結構在模擬過程中密實度的波動變化，Rg值與蛋白質密實度呈反比關系。如圖7C所示，κ-卡拉膠酶整體結構的密實度在突變前后變化不大，說明突變未對酶的結構造成太大的影響。

圖7 K155A和WT在20 ns的運動軌跡和結構變化Fig. 7 Motion trajectory and structure changes of K155A and WT within 20 ns

3 結 論

通過在線預測軟件PoPMuSiC成功篩選到假交替單胞菌κ-卡拉膠酶熱穩定性提高突變體K155A。該突變酶的最適反應溫度和最適反應pH值與WT相同，K155A對κ-卡拉膠的親和力略有下降，在pH 8.0～11.0范圍內穩定，在40～60 ℃，突變體K155A的熱穩定性優于WT酶。酶的結構及動力學模擬分析顯示，突變酶疏水相互作用和剛性的增強可能是其熱穩定提高的原因。熱穩定性改良提高了該突變κ-卡拉膠酶在工業應用上的價值。