濃香型大曲與生產環境微生物群落間的溯源性分析

劉英杰，黃 鈞，秦 輝，張宿義，董 異，王 超，王小軍，周榮清,2,*

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

傳統發酵食品不僅生產歷史悠久，也是食品及現代生物產業的重要組成部分，且白酒產業與民族生物產業息息相關[1-2]。大曲是傳統白酒生產過程中必需的發酵劑、酶制劑與獨特的原料，其微生物群落的多樣性對基酒的品質和風味影響顯著[3]。大曲因原料、過程調控參數不同，主要分為濃、醬、清3種主要類型，在白酒的生產中，賦予其獨特工藝和風味特點。這些大曲生產工藝的共同特點是自然接種、生料發酵、控溫調濕定向馴化和調控其群落與代謝[4]。類似眾多的傳統發酵食品生產，棲息在環境中的微生物與大曲群落多樣性和演替密切相關[5-6]。大曲坯是天然培養基[3]，原料、生產環境及設施等微生物群落結構與大曲的密切相關[7-9]，且影響大曲發酵過程。如棲息在空氣和發酵設施的耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）是清香大曲酒發酵的主要菌源[10-11]，從釀造車間和曲房空氣中分離到了產特征風味的功能酵母和產酶細菌[12-13]，大曲生產環境空氣中棲息的微生物與大曲細菌群落的變遷關系密切[14-15]。生產環境與大曲間優勢菌群相互交換，驅動大曲微生物群落結構的演替[16-18]，營造了獨特的微生態，是生產高質量大曲的重要基礎。然而，大曲微生物群落來源和形成機制的研究仍然較少，且生產環境與成曲間群落互作關系迄今鮮見報道。

本研究以同企業使用周期差異顯著的新老制曲基地及生產的大曲為對象，應用高通量測序技術探討生產環境（空氣、設施）、原料與大曲微生物群落結構特點，通過溯源分析解析其微生物菌群對大曲群落組成的貢獻，旨在揭示濃香型大曲微生物群落的來源，為解析大曲群落定向馴化和驅動作用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fast DNA SPIN基因提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司；Q5 DNA高保真聚合酶 美國New England Biolabs公司；瓊脂糖、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液TAE 美國Invitrogen公司；Marker DL2000 日本TaKaRa公司；Agencourt AMPure Beads 美國Beckman Coulter公司；PicoGreen dsDNA檢測試劑盒 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設備

PSW-Y液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器 常州普森電子儀器廠；GL-20G-II立式高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器有限公司；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計美國Thermo Fisher公司；2720聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國ABI公司；Gel DocTMXR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 空氣樣品的收集和處理

采樣時間正值大曲生產，采樣地點為石堡灣的瀘州老窖制曲生態園區（簡稱老廠，28°55'22''N、105°28'36''E）和黃艤的瀘州老窖制曲中心（簡稱新廠，28°51'46''N、105°34'14''E），前者使用周期長達25 a，采用機械制曲工藝；后者使用周期僅2 a，過程參數等控制與老廠一致，采用智能化制曲工藝，且將陳曲粉撒在曲房內營造優勢微生物的小生境。

環境設施表面參考Du Hai等[9]方法，磷酸鹽緩沖液預先潤濕的無菌脫脂棉球，均勻涂抹制曲車間地面、制曲機器、制曲工具、運輸推車和曲架等環境后，放入50 mL無菌離心管后密封。環境空氣采用液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器收集于15 mL無菌的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，采樣流量控制為12 L/min，采樣時間為15 min，然后裝入50 mL無菌離心管，于4 ℃保存待處理。隨后，0.22 μm硝酸纖維素濾膜真空抽濾，收集富集菌體的濾膜，置于50 mL離心管中，-80 ℃保藏用于DNA的提取、擴增。

在老廠和新廠的曲坯、制曲車間空氣及地面、原料、成曲（剛轉房的大曲）取平行樣，老廠制曲機器、制曲工具、手推車各取3個平行樣，新廠陳曲（存放3個月以上）[19]和曲架各取3個平行樣。因系多層制曲，老廠和新廠的成曲分別在上、中、下層各取3個平行樣，除老廠原料取了兩份平行樣外，其余樣品均為3個平行樣，樣品標簽參見表1。

表1 老廠和新廠樣品的名稱和標簽Table 1 Information about microbial samples from old and new Daqu production bases

1.3.2 DNA的提取和擴增

按照He Guiqiang[4]和Tang Qiuxiang[20]等方法提取總DNA并完成PCR擴增。按照Fast DNA SPIN提取試劑盒供應商提供的操作程序提取各種樣品的總DNA，使用Nanodrop ND-1000初檢測其濃度和純度后，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其分子大小和純度。隨后分別按以下條件完成細菌和真菌的PCR擴增：細菌V3-V4區采用通用引物338F/806R，真菌ITS1區采用通用引物ITS5F/ITS1R。PCR擴增體系（25 μL）：5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL，0.25 μL DNA聚合酶（5 U/μL，Q5 High-Fidelity），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），正反引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。細菌PCR參數：98 ℃預熱2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環，最后72 ℃保持5 min。真菌PCR參數：95 ℃預熱3 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環，最后72 ℃保持10 min。PCR擴增產物用Agencourt AMPure Beads純化，使用PicoGreen dsDNA檢測試劑盒定量。

1.3.3 高通量測序和序列分析

PCR純化產物送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq基因測序試劑盒v3進行2×300 bp雙端測序。采用QIIME pipeline對原始序列進行處理，依據Caporaso等[21]方法去除一些低質量序列，包括長度＜150 bp、序列平均質量＜20、單堿基重復數＞8 bp以及模糊的堿基。最后利用UCLUST算法將高質量的序列以97%的序列相似度聚成不同的可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[22]。隨后在Greengenes和UNITE數據庫中檢索比對這些序列，最后生成OTU表，記錄每個樣本中各OTU的豐度和分類。

1.4 數據處理

原始數據采用IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素方差分析，P＜0.05表示有統計學意義。序列數據分析主要使用QIIME（v1.8.0），使用R軟件（v4.0.5）進行聚類分析和非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析，并采用貝葉斯算法軟件SourceTracker（v1.0）[23]追溯曲坯微生物群落的來源，其他統計分析使用Origin 2021。

2 結果與分析

2.1 生產環境、原料及大曲的微生物群落多樣性差異

圖1 大曲及其潛在微生物來源的細菌（A、B）和真菌（C、D）α多樣性差異Fig. 1 Difference in α-diversity of bacteria (A, B) and fungi (C, D) from Daqu from old and new production bases and its potential microbial sources

所有樣品真菌和細菌的有效序列在53 979～103 223和55 328～120 392之間，其高質量序列在47 331～101 111和38 476～107 863之間，稀疏曲線結果表明，測序深度可以表征微生物群落的多樣性。各種樣品的細菌和真菌α多樣性差異如圖1所示。

在老廠的曲坯細菌豐富度小于成曲，多樣性則略高，原料的α多樣性低于成曲。因長期粉塵沉降和富集，制曲車間地面的細菌豐富度和多樣性最高，真菌的豐富度亦最高。高溫定向馴化的作用降低了成曲的真菌豐富度和多樣性。原料的真菌多樣性最高，而制曲車間空氣的最低。在新廠中，曲坯微生物α多樣性與原料相當，發酵后細菌的α多樣性增高，真菌則降低。新廠車間空氣的α多樣性最低，且低于老廠。曲架因反復接觸曲坯，細菌和真菌α多樣性較高。因老廠使用周期長，空氣和環境中的α多樣性高于新廠，老廠曲坯的多樣性也高于原料和成曲。類似已報道的結果，兩個制曲基地的成曲真菌α多樣性低于原料及環境等[9,24]。

圖2 細菌（A）和真菌（B）的NMDSFig. 2 Bacterial (A) and fungal (B) NMDS

如圖2所示，老廠中的曲坯與原料、機器、工具等群落結構相似度高，與制曲車間空氣則距離較遠。與老廠類似的是，新廠曲坯細菌和真菌群落與原料的距離都很近，而與車間空氣、地面等和曲架距離都較遠，新廠曲坯群落與環境的差異較老廠大，成曲和經3個月存放的大曲（陳曲）群落結構相似，說明通過撒陳曲粉營造了適合大曲生產的環境。

2.2 生產環境、原料及大曲的微生物群落結構的差異

圖3 老廠優勢細菌（A）和真菌（B）分布Fig. 3 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from old production base

老廠各種樣品中前16個優勢細菌屬（至少在兩個樣品中相對豐度＞2%）的結果如圖3A所示。與原料聚為一簇的曲坯的優勢細菌為Weissella（70.17%）、Pantoea（10.09%）、Leuconostoc（5.79%）和Lactobacillus（3.79%）。與曲坯聚為一亞簇的成曲中除Weissella（49.91%）、Lactobacillus（13.04%）和Leuconostoc（2.28%）是優勢細菌外，Staphylococcus（21.64%）、Bacillus（3.29%）和Pediococcus（2.32%）也占優勢。如圖3B所示，曲坯與除空氣外的環境樣品聚為一簇，其優勢真菌包括Pichia（32.24%）、Hyphopichia（4.89%）、Wickerhamomyces（1.94%）。Thermoascus（46.90%）、Thermomyces（12.35%）、Rhizopus（9.90%）、Hyphopichia（9.30%）以及Aspergillus（8.71%）則是成曲中的優勢真菌。車間空氣以Phialemoniopsis（97.58%）為主。曲坯中的3種優勢真菌并不主要來自原料而可能源于地面、工具和機器等環境設施。

圖4 新廠優勢細菌（A）和真菌（B）分布Fig. 4 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from new production base

新廠各種樣品中，前17個不同屬的細菌的聚類分析結果如圖4A所示。聚為同簇的曲坯、原料、成曲和陳曲中，Weissella和Leuconostoc為優勢細菌，但各樣品間的豐度差異顯著，在曲坯中為98.22%和0.58%、原料中為87.37%和11.36%、成曲中為27.85%和12.55%，而在陳曲中則為47.03%和5.85%。成曲中的Bacillus和Lactobacillus分別增至2.50%和14.60%，Weissella顯著降低，而與陳曲聚類為同亞簇。新廠各樣品中的優勢真菌屬如圖4B所示。曲坯與原料聚為同亞簇，Pichia（5.29%）、Hyphopichia（0.07%）和Alternaria（0.07%）為優勢真菌，原料中檢出的Alternaria（5.83%）為優勢真菌。成曲和陳曲中的優勢真菌則為Thermoascus（44.20%和44.33%）、Thermomyces（31.25%和8.94%）、Pichia（4.55%和37.16%）以及Aspergillus（10.06%和5.67%）。地面和曲架的Aspergillus等豐度較高而聚類為同亞簇，制曲空氣仍為Phialemoniopsis（99.31%）占絕對優勢。

兩個制曲基地中曲坯和成曲檢出的優勢微生物都是曾報道大曲與白酒發酵的優勢功能菌[9,16,25]。這些微生物包括合成多種風味前體物質的Staphylococcus、產多種功能酶的Bacillus[26]及Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Weissella等乳酸菌[27]，發酵初期的窖泥和糟醅中的優勢酵母Pichia和Hyphopichia[28]。Pichia可能來源于環境，在白酒發酵中具有關鍵作用[29]，是乙醇、有機酸和酯類等多種芳香化合物的貢獻者[9,30]。而Pantoea和Alternaria在小麥原料中為優勢細菌和真菌[8]，Thermoascus和Thermomyces等為高效降解碳水化合物的嗜熱真菌[31-32]。此外，環境設施與大曲群落間相互交換，所以在空氣和環境設施中也都有檢出這些種屬。

2.3 大曲微生物群落的溯源性分析

進一步對兩廠大曲微生物進行溯源分析，以確定大曲中的微生物來源以及具體菌屬的貢獻。

老廠的20個樣本（不含成曲）檢出215個屬的細菌和137個屬的真菌，樣品曲坯設定為Sink，其余樣品設為不同Source，SourceTracker結果表明曲坯中細菌屬源于原料（49.3%）和制曲工具（40.3%），細菌的未知來源（0.8%）較少，車間空氣（0.1%）和地面（0.2%）貢獻度最低（圖5B）。進一步對曲坯屬水平細菌群落溯源分析，結果表明曲坯優勢細菌如Weissella、Pantoea、Leuconostoc、Lactobacillus以及Bacillus等都主要來源于原料和制曲工具，而Rothia、Gluconobacter、Escherichia-Shigella和Rhodococcus等主要來源于制曲工具和機器，車間空氣和地面對曲坯細菌貢獻較低。曲坯中真菌屬主要來源于原料（56.1%），其次是制曲工具（16.7%）、制曲機器（5.3%）等環境設施樣品，車間空氣等其他環境樣品對曲坯微生物貢獻較少（圖5A）。原料可能并未對曲坯的優勢真菌有較大貢獻。曲坯屬水平真菌群落的溯源分析結果表明曲坯優勢真菌Hyphopichia和Wickerhamomyces來源于環境設施樣品，Alternaria主要來源于原料，而Pichia來源于原料與環境樣品，Trichosporon、Rhizopus和Aspergillus主要來源于原料和制曲工具，而車間空氣對曲坯真菌貢獻較少，主要貢獻了Pichia、Kazachstania和Phialemoniopsis。

對于新廠，18個樣本（不含成曲）共檢出183個屬細菌和76個屬真菌，陳曲因新廠撒陳曲粉而作為來源樣本分析。SourceTracker結果表明新廠曲坯中細菌屬主要來源于原料（96.5%），其次是陳曲（2.6%），而車間空氣（0.01%）貢獻最低（圖5C）。新廠曲坯中真菌屬主要來源于原料（96.4%），其次是陳曲（3.5%），車間地面等其他環境樣品對曲坯真菌貢獻較少。與老廠相比，原料貢獻度更高，結合前述分析表明撒陳曲粉強化發酵對曲坯細菌和真菌都有所貢獻且對后者貢獻更大。對屬水平真菌和細菌群落進行溯源分析（圖5C），結果表明，對于真菌，原料主要為曲坯貢獻了Alternaria、Aspergillus、Wickerhamomyces及其他菌屬，而陳曲貢獻了Thermoascus、Thermomyces、Trichosporon和Mucor等耐高溫菌屬以及Pichia、Hyphopichia、Candida等酵母菌屬。對于細菌，原料主要為曲坯貢獻了Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus以及Staphylococcus、Acetobacter等，陳曲主要貢獻了Pediococcus和Bacteroides，這些細菌在大曲已檢出，也是白酒發酵過程中的重要功能菌[9,16,25]。

環境等對老廠曲坯的貢獻度更高，特別是細菌群落。與老廠相比，新廠空氣和環境對曲坯微生物的貢獻度很小，且原料對新廠曲坯的貢獻更高，新廠可能由于新建其曲坯群落與環境的差異較老廠大。由此可見，生產環境在濃香型大曲的制造過程中起到關鍵作用，同時通過撒陳曲粉的強化方式可快速營造適合大曲生產的環境。

圖5 老廠和新廠不同來源微生物對曲坯的平均貢獻率及屬水平溯源分析Fig. 5 Average contribution rates of microorganisms from different sources to microbial community in raw starter brick before incubation and genus-level traceability

經過中高溫發酵過程，大曲的群落組成發生了顯著變化，進一步以相同的制曲環境和原料作為微生物來源，對成曲進行溯源分析，SourceTracker結果顯示，制曲環境和原料對老廠成曲細菌群落的貢獻度較高，尤其是制曲工具（76.3%），而對真菌群落的貢獻度較小且真菌未知來源較多（95.4%），如嗜熱真菌屬等（圖6A），并且新廠成曲細菌和真菌群落主要來源于原料（13.3%和0.6%）和陳曲（40.8%和14.8%），而受環境影響較小，真菌的未知來源仍較多（73.8%）（圖6B）。這些結果說明環境對老廠成曲細菌群落的貢獻度同樣較高，而真菌群落相對穩定，受環境微生物的影響較小，這可能是大曲微生物群落受溫、濕度等環境參數調控和馴化所致[33]，尤其是真菌。新廠可能不如老廠環境微生物豐富和穩定，撒陳曲粉強化營造了適合大曲生產的環境，有利于新廠大曲的定向馴化，對維持大曲品質穩定性具有十分重要的作用。

圖6 老廠（A）和新廠（B）不同來源微生物對成曲的平均貢獻率Fig. 6 Average contribution rates of microorganisms from different sources to mature Daqu from old (A) and new (B) production bases

3 結 論

以同企業的新老制曲基地及生產的大曲為對象，應用高通量測序技術探討了生產環境（空氣、設施）及原料與大曲的群落結構特點，通過溯源分析解析了其微生物菌群對大曲群落組成的貢獻。結果表明，在新老兩廠，大曲中檢出的優勢微生物都是白酒發酵過程的重要功能菌，曲坯都以Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc等乳酸菌和Pichia、Hyphopichia為主，而成曲中Bacillus、Lactobacillus增加，相應地，Weissella減少，真菌則以Thermoascus和Thermomyces等嗜熱真菌為主。生產環境在濃香型大曲的制造過程中起著關鍵作用。環境設施與大曲微生物群落間相互交換，驅動大曲微生物群落結構的演替，且長期使用的生產環境的群落多樣性更高。SourceTracker結果顯示，老廠曲坯中微生物主要來源于原料和制曲工具，且老廠環境對曲坯和成曲細菌群落組成的貢獻度都更高，但真菌群落相對穩定，受環境微生物的影響較小。新廠曲坯微生物主要來源于原料，陳曲對新廠成曲的微生物貢獻高于對曲坯的貢獻，通過適當強化方式營造適合大曲生產的環境，可以使生產環境乃至大曲本身朝著有利于大曲品質的方向發展。研究結果揭示了濃香型大曲微生物群落的來源，為解析大曲群落定向馴化和驅動作用提供參考依據。