武定雞肉中鮮味肽分離鑒定及呈味特性

何 穎，呂東霖，廖國周，賈 蓉，葛長榮，黃 明，王桂瑛,*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明 650201；3.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

味道是決定食物可接受性的重要因素，其中鮮味作為5大基本味道之一，于1908年首次提出[1]。鮮味是游離氨基酸類、核苷酸類、肽類、有機酸及其衍生物等物質與鮮味受體結合而產生的，這些鮮味物質可以改善食品的總體味感[2-3]。鮮味肽是一類分子質量范圍在300～3 000 Da的肽[4]。最早從木瓜蛋白酶處理的牛肉中發現了鮮味六肽[5]，此后在多種食品中均鑒定出鮮味肽，如動物性食品中的豬肉[6]、雞湯[7]、魚肉[8]等，植物性食品中的花生[9]等，真菌界的遠東疣柄牛肝菌[10]等，以及發酵食品中的醬油[11]、白腐乳[12]等。此外，溫志鵬[13]發現海帶中的鮮味肽具有一定的抗氧化能力。由于鮮味肽獨特的呈味特性和生物學功能，人們對于食物中鮮味肽的發掘和表征越來越感興趣。

武定雞是云南省極具代表性的雞種之一[14]，位居“云南六大名雞”之首，主產于楚雄彝族自治州武定縣，具有體大、肉嫩、味鮮等特點，深受群眾喜愛[15]。目前有關武定雞的研究主要在品質性狀和風味物質上，朱仁俊等[16]對武定雞肉品質進行了研究，結果表明閹割處理可以使武定雞肉質更細嫩；本課題組前期已對武定雞肉中的風味前體物及加工過程中形成的特征風味物質開展研究[17]；Yu Yuanrui等[18]研究了天然香料對武定雞風味前體物質和揮發性風味物質的影響；Xiao Zhichao等[19]對武定雞的代謝產物進行了研究，發現有機酸和小分子肽是雞胸肉和雞腿肉的主要代謝產物。然而，對于武定雞肉中的鮮味肽仍未深入發掘。

本研究采用超濾分級、凝膠過濾色譜（gel filtration chromatography，GFC）及反相高效液相色譜（reversedphase high performance liquid chromatography，RPHPLC）對武定雞的鮮味成分進行分離與純化，結合感官評價確定鮮味最強烈的組分，以納升高效液相色譜-串聯質譜（nanoscale high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，Nano-HPLC-MS/MS）聯用技術測定肽的分子質量和氨基酸序列，并對鑒定的多肽進行合成，進一步研究其呈味特性。本研究為完善武定雞的特征風味體系和深入研究鮮味肽呈鮮機制奠定基礎，也為武定雞的精深加工及鮮味肽類調味品的開發提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

140 日齡的雌性武定雞由云南農業大學實驗雞場提供。

葡聚糖凝膠G-15 上海索萊寶生物科技有限公司；檸檬酸、蔗糖、氯化鈉、奎寧、味精 昆明賽捷生物科技有限公司；95%乙醇溶液 天津市風船化學試劑科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈 德國Merck公司；所有感官用試劑均為食品級，所有分離用有機溶劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；Milli-Q Gradient超純水系統 上海熙揚儀器有限公司；TGL-16K冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器有限公司；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；MSC超濾杯 上海摩速科學器材有限公司；79-1磁力攪拌器 天津市濱海新區大港紅杉實驗設備廠；HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；普通玻璃層析柱 上海滬西分析儀器廠；752型紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；HL-2恒流泵、BS-100A自動餾分收集器 上海青浦滬西儀器廠；1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；Nano-HPLC-MS/MS儀 美國賽默飛世爾科技公司；ZipTip C18除鹽柱 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 武定雞肉水提物（chicken water extract，CWE）的制備

參考Zhang Meixiu等[20]的方法并略有改動。取200 g雞胸肉切碎，在10 000 r/min經高速分散器均質30 s處理3次，加入800 mL超純水后得到勻漿，將其在50 ℃水浴攪拌3 h提取肽，得到肽粗提液。將肽粗提液在4 ℃、10 000 r/min離心15 min后取上清液。重復提取3次，合并上清液，即得到富含鮮味肽的呈味基料（CWE）。

1.3.2 CWE的超濾分級

一般食源性蛋白中呈味肽的分子質量均小于5 000 Da[21]。本實驗選用1 000、3 000 Da及5 000 Da的超濾膜對CWE在4 ℃進行超濾分級：首先將樣品通過5 000 Da的超濾膜，隨后將透過液分別透過3 000 Da和1 000 Da的超濾膜，分級后得到3個組分，分別命名為CWE-I（分子質量＜1 000 Da），CWE-II（1 000 Da＜分子質量＜3 000 Da），CWE-III（3 000 Da＜分子質量＜5 000 Da），濃縮后冷凍干燥成粉末，用于感官評價，收集鮮味最強烈的組分用于下一步分離純化。

1.3.3 CWE超濾組分的GFC分離

選擇葡聚糖凝膠G-15作為柱填料，稱取60 g葡聚糖凝膠干粉浸泡于400 mL超純水中至少24 h，不斷攪拌使凝膠充分溶脹。平衡后去除多余的顆粒和懸浮液進行裝柱（1.6 cm×80 cm），待穩定后便可上樣。

將上述鮮味最佳的超濾組分凍干粉加超純水配制成25 mg/mL的溶液，經0.45 μm水相濾膜過濾后，以凝膠層析柱進行分離純化。以超純水為流動相，流速為0.8 mL/min，上樣量為1 mL，紫外檢測波長為220 nm。樣品經GFC分離后得到不同的分離組分，用自動餾分收集器收集并凍干備用。通過對分離組分進行感官評價，篩選出鮮味感官分數最強烈的組分用于后續純化。

1.3.4 GFC分離組分的RP-HPLC分離純化

將GFC分離得到的鮮味較強的肽組分凍干粉與蒸餾水配成質量濃度為10 mg/mL的溶液，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后，濾液進入RP-HPLC系統進一步分離純化得到不同的分離組分，收集并合并各組分，經真空濃縮、冷凍干燥后，貯藏在-20 ℃。對各凍干組分進行感官評價分析，對鮮味得分最高的組分進行結構鑒定。

分離條件：Thermo GOLD C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；流動相A：含0.05% TFA的乙腈溶液；流動相B：含0.05% TFA的超純水；等度洗脫程序：5% A+95% B，25 ℃洗脫20 min，流速0.8 mL/min。檢測波長220 nm，進樣量10 μL。

1.3.5 RP-HPLC分離純化組分的Nano-HPLC-MS/MS鑒定

以Nano-HPLC-MS/MS分析鮮味得分最高的RP-HPLC分離純化組分的分子質量和氨基酸序列。上樣前取適量樣本采用ZipTip C18除鹽柱（10 μL）進行除鹽，共上樣3 μL樣品。

色譜條件：Acclaim PepMap C18色譜柱（75 μm×25 cm）；柱流量300 nL/min；柱溫40 ℃；電噴霧電壓2 kV；流動相A：含0.1%甲酸的水溶液；流動相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，98%～94% A、2%～6% B；3～42 min，94%～80% A、6%～20% B；42～47 min，80%～65% A、20%～35% B；47～48 min，65%～0% A、35%～100% B；48～60 min，0% A、100% B。

質譜儀在數據依賴采集模式下運行，在MS和MS/MS采集間自動切換。質譜條件：MS：掃描范圍m/z200～1 500；分辨率70 000；自動增益控制目標3×10-6；最大注入時間60 ms；掃描電荷2～6。高能碰撞解離MS/MS：分辨率1 7500；隔離窗口m/z2；自動增益控制目標5×10-4；最大注入時間50 ms；碰撞能量27 eV，動態排除時間20 s。

串聯質譜圖經過PEAKS Studio X+軟件分析，使用PEAKS DB算法對Uniprot-Gallus數據庫（版本201907，18 124 條目）搜庫，設置None酶解。碎片離子質量容許誤差0.02 Da，母離子質量容許誤差7×10-6；最大漏切數為2；可變修飾：氧化修飾15.99，脫酰胺化0.98。蛋白卡值為-10 lgP≥0，至少含1個特異性肽段；肽段卡值為-10 lgP≥15。

1.3.6 多肽的合成及活性預測

采用固相合成法對鑒定的已知結構的肽段進行合成，脫鹽處理后使其純度在95%以上，委托上海吉爾生化有限公司合成，并通過BIOPEP呈味肽和氨基酸數據庫預測所鑒定肽的潛在生物活性。

1.3.7 感官評價分析

1.3.7.1 感官評價小組培訓

感官培訓參考Liu Ziyuan等[22]的方法并有少許改動。共招募10 名成員（4 名男性和6 名女性，年齡為20～28 歲），所有小組成員均健康、不吸煙、無味覺和嗅覺障礙，在感官評價方面都有一定的經驗，并知情同意參加本研究的感官測試。酸味、甜味、苦味、鮮味和咸味的參考標準分別為檸檬酸、蔗糖、奎寧、谷氨酸鈉、氯化鈉。感官評價小組經訓練后記住以下標準物質的味道[23-24]：5 mmol/L 檸檬酸、10 mmol/L蔗糖、1 mmol/L奎寧、10 mmol/L谷氨酸鈉和12 mmol/L氯化鈉，所有感官實驗均在（23±2） ℃的環境下進行。

1.3.7.2 CWE及其超濾組分的感官評價

將CWE以及超濾分離后各凍干組分溶于超純水中，得到質量濃度為5 mg/mL的溶液進行感官評價。小組成員根據標準物質味道對實驗樣品（約1 mL）的味道進行評分，酸、甜、苦、鮮和咸的強度均為0～7 分，評價標準如表1所示[25]。在鮮味評分中，將超純水的鮮味值定為0 分，1 mg/mL和2 mg/mL谷氨酸鈉溶液分別定為4 分和7 分。

表1 感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.7.3 GFC分離組分的感官評價

參照Frank等[26]的滋味稀釋分析法并略有改動。將超濾組分和GFC各分離組分用超純水配成5 mg/mL的溶液，按體積比1∶1逐步稀釋，每次取5 mL逐步稀釋的樣液，按質量濃度遞減的順序遞給感官評價者，每個樣品品嘗約5 s。當某一稀釋水平的溶液與兩個空白（超純水）之間的味道差異剛好能被分辨出來，此時稀釋倍數即稀釋因子。對評估人員的評價結果進行記錄，評價過程不允許討論和交流，結果為3次重復實驗的平均值。同時，感官評價員還對各組分的味覺特征進行了描述。

1.3.7.4 RP-HPLC分離組分的感官評價

參照1.3.7.2節的方法對各RP-HPLC分離組分的鮮味進行感官評價。

1.3.7.5 合成肽的鮮味閾值測定和感官描述

合成肽鮮味閾值測定采用三角試驗法[27]：將合成肽溶解在超純水中配制為1 mg/mL溶液，以1∶1（V/V）逐漸稀釋，直至溶液鮮味無法識別出為止。將倒數第2個溶液的質量濃度記為合成肽的鮮味閾值，同時，感官評價員評價了合成肽溶液的感官特性，包括酸、甜、苦、鮮和咸味。

1.4 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件處理數據并進行單因素方差分析（P＜0.05，差異顯著），并使用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 CWE的超濾分級與感官分析

如圖1所示，隨著CWE的逐步超濾分級，分離組分的鮮味逐漸增強；與CWE-II和CWE-III相比，CWE-I表現出較強的鮮味強度（P＜0.05），而咸味強度稍高但無差異顯著性（P＞0.05）；并且CWE-I和CWE具有相似的整體風味輪廓，即組分CWE-I的鮮味評分最高，也就是說低分子質量組分CWE-I是關鍵的風味活性組分[28]，并具有較強的鮮味[29-30]。這些結果與之前的研究高度一致，Su Guowan等[9]將花生粕酶解液超濾后發現，低于1 000 Da的組分鮮味較強烈，而1 000～3 000 Da的組分有較好的鮮味增強效果；另外，丁奇[7]的研究結果表明無論是雞湯還是酶解液中，均是分子質量小于1 000 Da的組分具有更強的鮮味。因此，收集鮮味最強烈的是CWE-I組分，使用GFC進行下一步的分離純化。

圖1 CWE超濾組分的感官雷達圖Fig. 1 Radar map of sensory evaluation of CWE and its ultrafiltration fraction

2.2 CWE超濾組分的GFC分離與感官分析

CWE經過超濾后，雖然去除了比較多的大分子物質，但仍是復雜的混合肽樣品，為了找出鮮味最強烈的武定雞肉蛋白肽的分子質量范圍，使用GFC對鮮味最強的超濾組分CWE-I進行進一步分離純化。由圖2可知，CWE-I組分經過GFC分離后得到了4個組分（F1、F2、F3、F4）。如表2所示，CWE-I，F1和F2組分的滋味以鮮味為主，咸、甜次之。由于鮮味、咸和甜的相互作用，咸和甜可以增強鮮味[31]，且鮮味物質含量高的組分也有較高的甜味物質含量[32,22]。此外，F2組分表現出僅次于超濾組分CWE-I的鮮味強度，稀釋因子為64；并且隨著組分不斷分離，F3和F4組分的咸味有所降低，從側面反映出凝膠過濾有一個較好的脫鹽效果。根據感官評價結果，將F2組分用于后續的分離純化。

圖2 武定雞肉超濾組分CWE-I的GFC圖Fig. 2 GFC chromatogram of ultrafiltration fraction CWE-I

表2 超濾組分CWE-I和GFC分離組分的感官評價Table 2 Sensory evaluation of CWE-I and subfractions from it separated by GFC

2.3 GFC分離組分的RP-HPLC分離純化與感官分析

收集GFC分離的鮮味最強烈的F2組分進行RP-HPLC分離純化。如圖3所示，在3～6 min保留時間內，F2分離后得到了4個在220 nm波長處有明顯吸收的組分，將這些組分分別命名為F2-1、F2-2、F2-3、F2-4。極性強（疏水性弱）的物質先被洗脫出來，所以武定雞中的鮮味肽極性都很強。研究表明，疏水性強弱與氨基酸性質有關[33]，多數的苦味氨基酸如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為疏水性氨基酸，多數的甜鮮味氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸為親水性氨基酸[34]，這代表組分中可能會含有親水性的甜鮮氨基酸。如圖4所示，F2-3的鮮味得分顯著高于F2-1、F2-2和F2-4（P＜0.05）。因此，鮮味最佳的組分為F2-3，其鮮味強度是未經RP-HPLC分離純化的F2的1.14 倍，故選擇F2-3組分進行結構鑒定，測定肽的氨基酸序列組成。

圖3 武定雞肉GFC分離組分F2的RP-HPLC圖Fig. 3 RP-HPLC chromatogram for F2 fractionation

圖4 武定雞肉GFC分離組分F2及其RP-HPLC分離純化組分的鮮味強度Fig. 4 Umami intensity of F2 and its subfractions obtained by RP-HPLC

2.4 RP-HPLC分離純化組分的Nano-HPLC-MS/MS結構鑒定

采用Nano-HPLC-MS/MS對RP-HPLC分離純化的鮮味最佳F2-3組分中鮮味肽的氨基酸序列和分子質量進行分析。由表3可知，通過質譜鑒定出8種主要肽段，包括2 條三肽、1 條九肽、1 條十肽、1 條十一肽、1 條十二肽、1 條十三肽和1 條十五肽，這些肽段的分子質量范圍為365.20～1 735.92 Da。

表3 武定雞肉RP-HPLC分離純化組分F2-3中鑒定的特征肽段Table 3 Signature peptide sequences identified in F2-3

2.5 武定雞肉中鮮味肽的活性預測及呈味特性

為了研究多肽的呈味特性與氨基酸的組成之間的關系，采用生物活性肽數據庫BIOPEP建立蛋白質片段的潛在感覺輪廓[35]。已鑒定的肽段通過BIOPEP數據庫得到的感官活性預測結果如表4所示。該結果由A＝a/N計算所得（a為目標肽序列中具有特定味覺活性片段的片段數；N為肽段中含有的氨基酸殘基數）。

表4 生物活性片段在鑒定肽中的出現頻率Table 4 Frequency of occurrence of bioactive fragments in identified peptides

由表4可知，鮮味活性片段出現頻率最高的肽段是LDF，其具有的鮮味片段為D，其次是FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL（包含D、DA和DD的鮮味活性片段），出現頻率最低的是RKGFPSRIL，Toda等[36]報道天冬氨酸等鮮味氨基酸可以激活味覺受體T1R1/T1R3，所以LDF很有可能呈現鮮味。苦味活性片段出現頻率最高的肽段是LLLYVRIYLVLR，其次是LLYVRIYLVLR、RKGFPSRIL、LYVRIYLVLR，最低的是FAGDDAPRAVFPS。對目前已報道的鮮味肽進行分析，發現一些具有苦味的氨基酸如組氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸等均是鮮味肽的組成成分[37]。酸味活性片段出現頻率最高的肽段是LDF，其次是DLAGRDLTDYLMKIL，酸性氨基酸被認為是重要的鮮味刺激物質，它們通常包含在鮮味肽的氨基酸序列中[10]。丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸等甜味氨基酸也有助于鮮味[38]，甜味活性片段出現頻率較高的肽段有FAGDDAPRAVFPS、FVT和RKGFPSRIL。因此，不能直接判斷所鑒定肽的味覺活性，也不能僅憑味覺活性片段在所鑒定肽中出現的頻率判斷，綜合以上分析推測LDF、FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL可能具有鮮味。

表5 合成肽水溶液的滋味特性Table 5 Taste characteristics of synthetic peptides in aqueous solution

為了更全面地研究肽的滋味特性，采用固相合成法對上述所有已鑒定的多肽進行合成，對純度大于95%的肽進行了味道描述和閾值分析。如表5所示，LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL這3 條肽具有明顯鮮味，鮮味閾值分別為0.250、0.062、0.125 mg/mL。之前通過生物活性肽數據庫BIOPEP預測LDF、FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL可能具有鮮味，但感官結果卻顯示FAGDDAPRAVFPS不具有鮮味，其原因可能是空間結構的差異，具體還需要進一步研究。莫加利等[39]從風干武昌魚中分離出一條鮮味肽P2a-2，發現其二級結構以β-轉角為主，相對含量高達90.16%，推測肽的鮮味與β-轉角有關。RKGFPSRIL苦味強烈的原因可能是因為苦味氨基酸比例高或者是N端是堿性氨基酸（精氨酸）。Dang Yali等[40]的研究表明，精氨酸殘基對肽和受體相互作用的活性位點有非常重要的影響。Liang Jiaming等[10]發現合成肽YNEYPPLGR具有強烈的鮮味很可能是因為C端含有精氨酸殘基，Tamura等[41]研究堿性和酸性氨基酸的位置對呈鮮效果的影響時，發現肽的N端為帶負電的酸性氨基酸，C端為帶正電的堿性氨基酸時，二肽才有呈味特性，反之則沒有呈味效果。LYVRIYLVLR、LLYVRIYLVLR、LLLYVRIYLVLR這3 條肽，它們沒有鮮味和苦味，可能是不同感官特性氨基酸之間相互影響的結果。然而，FVT含有苯丙氨酸和纈氨酸兩個疏水性氨基酸但仍呈現鮮味。之前有研究表明，疏水性氨基酸也可能會影響鮮味肽的呈味效果：如從魚露中鑒定的鮮味肽MEREQEESTMR和LLDAFFFDNK，它們的氨基酸序列中含有呈苦味的甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等疏水氨基酸，但是總體仍呈現鮮味[42]。可見，鮮味肽的呈味效果與肽鏈長度、氨基酸的組成和排列順序以及空間結構密切相關。

綜上，肽的呈味特性受到很多因素的影響，將生物活性肽數據庫BIOPEP的預測結果和感官分析結果相結合，有助于更全面地研究多肽的呈味效果與其結構之間的關系。

3 結 論

CWE經過超濾分級、GFC及RP-HPLC分離純化并結合感官評價得到具有較強鮮味的組分F2-3，經Nano-HPLC-MS/MS鑒定出8 條多肽，分子質量范圍為365.20～1 735.92 Da，氨基酸序列分別為RKGFPSRIL、LDF、FAGDDAPRAVFPS、FVT、LYVRIYLVLR、LLYVRIYLVLR、DLAGRDLTDYLMKIL和LLLYVRIYLVLR。采用BIOPEP數據庫對其感官活性進行預測，并通過固相合成確定其味道特征，發現LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL這3 條肽具有鮮味。本研究豐富了武定雞的風味體系，為進一步闡明武定雞肉中鮮味肽的構效關系提供參考。