一例3M 綜合征合并Netherton 綜合征家系的遺傳學(xué)研究

黎偉豪 黃秀靜 葉燕綢★

3M 綜 合 征（Three M syndrome，OMIM #273750）是一種常染色體隱性遺傳病，由Miller、Mukusick、Malvaux 三位遺傳學(xué)家于1975 年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，其主要癥狀為嚴(yán)重宮內(nèi)和出生后生長(zhǎng)遲緩，特殊面容，骨骼發(fā)育異常［1］。已報(bào)道3 個(gè)致病基因：CUL7（MIM 609577）基因、OBSL1（MIM 610991）基因和CCDC8（MIM 614145）基因，分別引起3M 綜合征的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種類型。CUL7基因變異導(dǎo)致3M 綜合征占77.5%，OBSL1基因變異占16%，CCDC8基因變異少于5%，其他不明確基因變異約占1.5%［2-3］。

Netherton 綜 合 征（Netherton syndrome，NS，OMIM#256500）也是一種常染色體隱性遺傳病，于1958 年由Earl Netherton 首次報(bào)道，由SPINK5（MIM 605010）基因變異引起。NS 典型的臨床表現(xiàn)包括先天性魚鱗病樣紅皮病/回旋形線狀魚鱗病、毛發(fā)異常（套疊性脆發(fā)）和特應(yīng)性過敏體質(zhì)以及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等［4］。NS臨床表現(xiàn)與其他多種皮膚病相似，可能造成漏診，估計(jì)NS約占新生兒紅皮病的20%［5］。

本文對(duì)一例產(chǎn)前超聲影像提示股骨發(fā)育速度明顯緩慢、面部發(fā)育異常、胸骨內(nèi)陷的胎兒進(jìn)行了家系全外顯子組測(cè)序（Whole Exome Sequencing ，WES），研究報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 一般資料

孕婦27 周歲，孕2 產(chǎn)1，早孕期超聲影像檢查提示胎兒頸后透明帶（Nuchal Translucency，NT）1.7 mm；早、中孕期唐氏篩查未見異常；無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查（Noninvasive Prenatal Test，NIPT）未提示異常。胎兒26+3 周產(chǎn)前超聲影像提示大小相當(dāng)于22+周，長(zhǎng)骨短，股骨、肱骨及尺橈骨、脛腓骨長(zhǎng)相當(dāng)于20～21 周（＜1%），雙頂徑（Biparietal Diameter，BPD）60.3 mm（+0.12 SD），頭圍（Head Circumference，HC）226.5 mm（+0.54 SD），腹圍（Abdominal Circumference，AC）188.8 mm（-1.01 SD），股骨長(zhǎng)（Femur Length，F(xiàn)L）33.3 mm（-4.17 SD），考慮股骨發(fā)育速度明顯緩慢，面部輪廓顯示額部較前突，鼻梁低平，胸腹部矢狀切面顯示胸骨內(nèi)陷。孕婦否認(rèn)近親結(jié)婚，孕期無(wú)放射性物質(zhì)接觸史，否認(rèn)有家族史，否認(rèn)孕期藥物服用史。孕婦夫妻無(wú)異常臨床表型，智力均正常。本研究經(jīng)孕婦及家屬的知情同意及本院倫理委員會(huì)的審批。

1.2 方法

1.2.1 家系全外顯子組測(cè)序

抽取臍帶血1 mL、胎兒父母外周血2 mL，用EDTA 抗凝劑抗凝。使用商品化核酸提取試劑盒（德國(guó)Qiagen）提取EDTA 抗凝血基因組gDNA，測(cè)定濃度及純度A260/A280 在1.8 左右，實(shí)驗(yàn)建庫(kù)采用美國(guó)Roche 公司生產(chǎn)的定制基因片段捕獲探針（KAPA HyperExome）。實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程包括基因組DNA 打斷、磁珠篩選、末端補(bǔ)平、3'端加堿基“A”、PCR 擴(kuò)增及純化、目標(biāo)基因外顯子及臨近剪切區(qū)捕獲及雜交、洗滌和洗脫、文庫(kù)單鏈環(huán)化、高通量測(cè)序。測(cè)序類型為PE100+10，測(cè)序完成后，得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的讀長(zhǎng)。將得到的可分析讀長(zhǎng)用BWA 軟件（Burrows Wheeler Aligner）與hg19（GRch37：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/）進(jìn)行序列比對(duì)。用GATK 軟件進(jìn)行SNV（single nucletide variant）和Indel（insertion and deletion）查詢，生成目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進(jìn)行多種數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，參考數(shù)據(jù)庫(kù)有：NCBI dbSNP v147，dbNSDP v2.9.1，ESP6500 v2 HapMap，1000 human genome dataset 和database of 100 Chinese healthy adults，尋找出可疑的基因變異位點(diǎn)。結(jié)合ClinVar（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ ）、OMIM（https：//www.omim.org/）、HGMD（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/）等疾病數(shù)據(jù)，參考《美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南2015》［6］規(guī)則對(duì)變異致病性進(jìn)行解讀。以上檢測(cè)過程由深圳華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.2 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)于在樣本發(fā)現(xiàn)的CUL7基因、SPINK5基因致病、可能致病變異，在每個(gè)變異所在片段的上下游50 bp 附近區(qū)域設(shè)計(jì)引物。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序，所得結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中CUL7（NM_014780.5）、SPINK5（NM_006846.4）基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，從而驗(yàn)證家系外顯組測(cè)序的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 家系全外顯子組測(cè)序結(jié)果

2.1.1CUL7基因的復(fù)合雜合變異

CUL7；c.3291_3294delTCAC（p.His1098Cysfs*42）雜合變異，依據(jù)ACMG 指南被評(píng)判為致病，評(píng)判證據(jù)為PVS1+PM2+PM3，遺傳自母親。CUL7；c.4717C＞T（p.Arg1573*）雜合變異，依據(jù)ACMG 指南被評(píng)判為致病，評(píng)判證據(jù)為PVS1+PM2+PM3+PP4，遺傳自父親。見表1。

表1 胎兒家系全外顯子組測(cè)序結(jié)果Table 1 The results of the WES

2.1.2SPINK5基因的復(fù)合雜合變異

SPINK5；c.2474_2475delAG（p.Glu825Glyfs*2）雜合變異，依據(jù)ACMG 指南被評(píng)判為致病，評(píng)判證據(jù)為PVS1+PM2+PM3，遺傳自父親。SPINK5；c.2870delT（p.Leu957Gln*46）雜合變異，依據(jù)ACMG指南被評(píng)判為可能致病，評(píng)判證據(jù)為PVS1+PM2，遺傳自母親。見表1。

2.2 Sɑnger 測(cè)序結(jié)果

胎兒CUL7；c.3291_3294delTCAC 變異位點(diǎn)為雜合型，母親為雜合型，父親為野生型。見圖1。胎兒CUL7；c.4717C＞T 變異位點(diǎn)為雜合型，母親為野生型，父親為雜合型。見圖2。胎兒SPINK5；c.2474_2475delAG 變異位點(diǎn)為雜合型，母親為野生 型，父親為雜合型。見圖3。胎兒SPINK5；c.2870delT 變異位點(diǎn)為雜合型，母親為雜合型，父親野生型。見圖4。

圖1 胎兒及其家系CUL7 基因c.3291_3294delTCAC變異位點(diǎn)Sanger 測(cè)序圖Figure 1 Sanger sequencing showing the c.3291_3294delTCAC of the CUL7 gene in the fetus and parents

圖2 胎兒及其家系CUL7 基因c.4717C＞T 變異位點(diǎn)Sanger 測(cè)序圖Figure 2 Sanger sequencing showing the c.4717C＞T of the CUL7 gene in the fetus and parents

圖3 胎兒及其家系SPINK5 基因c.2474_2475delAG 變異位點(diǎn)Sanger 測(cè)序圖Figure 3 Sanger sequencing showing the c.2474_2475delAG of the SPINK5 gene in the fetus and parents

圖4 胎兒及其家系SPINK5 基因c.2870delT 變異位點(diǎn)Sanger 測(cè)序圖Figure 4 Sanger sequencing showing the c.2870delT of the SPINK5 gene in the fetus and parents

3 討論

據(jù)ACMG2020 年發(fā)布的胎兒全外顯子組測(cè)序在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用顯示［7］，通過超聲鑒定出結(jié)構(gòu)性缺陷的胎兒有30%可能為染色體核型異常，染色體微陣列可以額外檢出4%～6%的基因異常；產(chǎn)前全外顯子組測(cè)序在染色體核型和染色體微陣列正常的情況下額外檢出8%～10%的基因異常［8］。宮內(nèi)發(fā)育遲緩是一種胎兒期非特異性的表現(xiàn)，大約占所有活產(chǎn)兒的0.17%，可由多種不同類型的遺傳病引起，應(yīng)在產(chǎn)前進(jìn)行全外顯子組測(cè)序提高診斷率［9］。本研究胎兒全外顯子組測(cè)序結(jié)果提示CUL7基因和SPINK5基因分別存在致病/可能致病復(fù)合雜合變異，其父母進(jìn)行變異位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證后，證實(shí)其父母分別為CUL7基因和SPINK5基因雜合變異攜帶者。

胎兒CUL7基因c.3291_3294delTCAC 變異和c.4717C＞T 變異，其中c.3291_3294delTCAC 為首次報(bào)道的致病變異，依據(jù)ACMG 指南評(píng)判為致病，評(píng)判證據(jù)項(xiàng)為PVS1+PM2+PM3，SIFT（http：//sift.jcvi.org）、MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org）、PolyPhen（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph）等多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)/功能和進(jìn)化保守性軟件預(yù)測(cè)該變異有害，導(dǎo)致蛋白功能缺陷。3M 綜合征患者影像學(xué)檢查表現(xiàn)為骨骼畸形，包括長(zhǎng)骨細(xì)長(zhǎng)、脊柱前凸、椎體高等，表明CUL7參與了骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。迄今為止，3M 綜合征的基因型與表型關(guān)系仍未完全清楚，有待進(jìn)一步的科學(xué)研究［10］。

胎兒SPINK5基因c.2474_2475delAG 變異和c.2870delT 變異，其中c.2870delT 變異為首次報(bào)道的致病變異，依據(jù)ACMG 指南被評(píng)判為可能致病，評(píng)判證據(jù)項(xiàng)為PVS1+PM2，多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)/功能和進(jìn)化保守性軟件預(yù)測(cè)該變異有害，導(dǎo)致蛋白功能缺陷。SPINK5基因位于5q31-32，含有33 個(gè)外顯子，編碼含有1 064 個(gè)氨基酸的上皮和粘膜表面的淋巴上皮Kazal 型抑制物（Lymphoepithelial Kazal-Type-Related Inhibitor，LEKTI）蛋白，屬于一種多結(jié)構(gòu)域絲氨酸蛋白激酶。有研究表明絲氨酸蛋白酶在脫屑、上皮的抗炎抗菌和皮膚屏障調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［11］。NS 患兒在出生時(shí)皮膚障礙就嚴(yán)重受損且伴有炎癥信號(hào)分子顯著上升，破壞了皮膚的屏障功能［12］。NS 胎兒出生時(shí)即存在彌漫性鱗屑性紅皮病樣皮損，新生兒期經(jīng)常出現(xiàn)危及生命的并發(fā)癥，大多數(shù)患兒可以對(duì)癥治療，悉心照顧可活至成年［13-15］。

3M 綜合征與NS 都是罕見的遺傳病，3M 綜合征發(fā)病率不詳；NS 發(fā)病率約為1/20 萬(wàn)［16］。胎兒同時(shí)發(fā)生3M 綜合征及NS 的概率極低，本研究為全球首次報(bào)道，并且分別增加了一個(gè)CUL7基因和一個(gè)SPINK5基因新的致病變異，從而擴(kuò)大了3M 綜合征及NS 的基因型譜。NS 患兒的臨床表型大多是是出生后才能被發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前很難通過超聲影像檢查發(fā)現(xiàn)。引產(chǎn)胎兒外觀全身皮膚彌漫性魚鱗病樣紅皮，與NS 新生兒皮膚特征相符，但家屬拒絕行相關(guān)的皮膚檢查，所以缺乏NS 疾病的詳細(xì)臨床表型資料。胎兒NS 疾病的發(fā)現(xiàn)是因“胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、特殊面容”做基因診斷時(shí)的額外發(fā)現(xiàn)，在遺傳咨詢過程中，應(yīng)結(jié)合胎兒的宮內(nèi)發(fā)育狀況、基因結(jié)果、家族史進(jìn)行客觀全面的分析，進(jìn)行個(gè)體化解讀，為患者做出最準(zhǔn)確的診斷和優(yōu)生優(yōu)育咨詢。

單基因隱性遺傳病的發(fā)生，通常是因患兒父母同為遺傳病致病基因的攜帶者。3M 綜合征和NS 為不連鎖的兩種單基因隱性遺傳病。按照孟德爾遺傳規(guī)律，一種隱性遺傳病攜帶的父母生出患兒的概率為1/4，本研究的胎兒父母生出兩種疾病患兒的概率為1/16，生出其中一種遺傳病患兒的概率為6/16，生出攜帶者的概率為8/16，生出完全健康的胎兒的概率只有1/16。該孕婦再次妊娠，胎兒為綜合征患者的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大大增加，必須進(jìn)行產(chǎn)前診斷，也可以考慮借助單基因疾病植入前檢測(cè)（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic，PGT-M）輔助生殖技術(shù)進(jìn)行診斷［17］。