阿克蘇地區部分規模化豬場豬圓環病毒3型的感染情況調查

莫紹江 ，孫鵬亮 ，李虎，劉祥杰，李蓮瑞 *

（1塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV），是已知最小的動物病毒之一，為單鏈環狀DNA病毒，長度2 000 bp，粒子大小在17～20 nm之間。有二十面體的對稱結構，無囊膜，對外界的理化環境具有較強的抵抗能力［1-4］。PCV按其基因型的差異分為四種類型，即 PCV1、PCV2、PCV3和 PCV4，其中 PCV2和PCV3是最具感染力和致病力的兩型［5］。據報道PCV3比PCV2對仔豬的致病力更強［6］。PCV3感染豬群可引起豬群全系統的炎癥反應，嚴重者可導致母豬流產［7］。由于PCV2病毒已被廣泛研究，國內關于PCV2的疫苗早已普遍應用于各個豬場，使用之后大大降低了PCV2的感染率［8］，因此本次研究以PCV3為主。任敏等［9］通過對新疆PCV3的全基因組進行測序并分析，發現所得的PCV3分離毒株與美國報告的毒株同屬于3b亞群，首次證實了新疆規模化豬場中已經存在PCV3感染的情況。魏其［10］通過對新疆最具代表性的13個地區進行牛PCV3的分子流行病學調查和基因特征分析，發現PCV3已在新疆地區牛養殖場中廣泛存在。前人對新疆株PCV3Cap基因序列研究雖然相對較多，但關于阿克蘇地區PCV3感染情況的研究鮮有報道，所以本研究對新疆阿克蘇4個規模化豬場的能繁母豬、仔豬和育肥豬的采樣樣本進行PCV3檢測，以期知曉新疆阿克蘇地區PCV3感染與流行情況，為該地區PCV3感染防控工作打下理論基礎。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

2020—2021年對新疆阿克蘇地區4個規模化豬場的能繁母豬、仔豬和育肥豬共采584份全血樣本，詳情見表1。

表1 樣本列表

1.2 試驗試劑

表2 試驗試劑

1.3 試驗儀器與設備

表3 儀器與設備

2 試驗方法

2.1 樣品的預處理

吸取抗凝管中的全血樣品1 000μL加入到1.5 mL無菌離心管中，編號后置于-20℃冰箱保存備用。

2.2 豬圓環病毒3型DNA提取

按照EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書對全血樣本總DNA進行提取，并將提取到的DNA放入-20℃冰箱保存備用。

2.3 豬圓環病毒3型PCR擴增檢測

引物選取參照王雪濤等［11］研究結果，由上海生工生物股份有限公司合成，引物序列和反應體系及擴增條件見表4、表5。

表4 PCV3 PCR引物序列

表5 PCV3 PCR反應體系及擴增條件

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

配制1%的瓊脂糖凝膠，用PCV3(Cap)-F/R PCR擴增產物點樣，設置電壓（120 V）、電流（110 mA）、時間（25～30 min），使用凝膠成像系統于電泳后拍照保存。

2.5 PCR產物回收與純化

將PCV3(Cap)-F/R PCR擴增基因片段的凝膠，按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說明操作，對擴增基因片段的凝膠進行切膠回收，將回收的目的基因置于-20℃冰箱保存備用。

2.6 PCV3 Cap基因序列測定及同源性分析

使用純化后的PCR產物送上海生工測序，利用DNAStar軟件，將PCR產物測得的序列與GenBank選取的國內15株PCV3Cap基因參考序列進行同源性比對，參考序列見表6。

表6 PCV3 Cap基因參考序列

3 結果

3.1 臨床樣品中PCV3 PCR擴增結果

以新疆阿克蘇地區4家規模化豬場采集的584份豬全血樣本的DNA為模板，采用PCV3Cap基因的特異性引物，利用PCR進行PCV3Cap基因的擴增，共測出44份陽性樣本，擴增的目的條帶與預期大小一致，部分電泳圖見圖1。

圖1 部分樣本的PCV3 Cap基因PCR擴增檢測結果

3.2 PCV3 Cap基因序列同源性分析

在NCBI上對測序結果進行比對分析，將44份陽性樣本PCR產物測序后進行同源性比對，獲得2種PCV3Cap基因序列，分別命名為AKesuCap-1（育肥場）和AKesuCap-2（繁育場）。通過DNAStar軟件對2種檢測出的PCV3Cap基因序列與15株國內流行株Cap基因序列進行同源性比較，并制作PCV3Cap基因同源性表（圖2）及基因系統發育進化樹（圖3）。

圖2 PCV3 Cap基因序列與國內毒株核苷酸同源性分析

圖3 PCV3 Cap基因序列與國內毒株的系統發育進化樹分析

將AKesuCap-1（育肥場）、AKesuCap-2（繁育場）和15株中國PCV3Cap基因參考序列構建同源性表及基因系統發育進化樹分析發現，AKesuCap-1和15株中國PCV3Cap基因參考序列的同源性在98.9%～100%之間，且與CN/Xinjiang-AK16/2018株同源性達到了100%，反映了該育肥場存在CN/Xinjiang-AK16/2018毒株感染的情況。同時，AKesuCap-2和15株中國PCV3Cap基因參考序列的同源性介于98.5%～99.6%之間，與NWHEB21、PCV3-CN-ZJ-QZ-2-2017同源性為99.6%。而且，AKesuCap-1和AKesuCap-2同源性為98.5%。由此可知，2株PCV3Cap基因核苷酸序列與國內15株PCV3Cap基因參考核苷酸序列具有高度同源性。而基因系統發育進化樹則揭示了AKesuCap-1（育肥場）和AKesuCap-2（繁育場）具有明顯的遺傳距離，AKesuCap-1與CN/Xinjiang-AK16/2018（MK562412.1）屬于同一分支，AKesuCap-2與 NWHEB21（MG564174.1）在同一分支上。

3.3 PCV3感染情況調查

3.3.1 2020—2021年樣品中PCV3感染情況

經過對2020—2021年新疆阿克蘇地區4個規模化豬場的584份樣本進行PCV3檢測，共檢出PCV3陽性樣品44份，總陽性檢出率為7.53%。

3.3.2 不同類型豬場PCV3感染情況

通過PCR技術對來自不同豬場的共584份樣品進行PCV3檢測，結果顯示，繁育場PCV3平均陽性率為14.07%（19/135），而育肥場（1、2和3）平均陽性率為5.57%（25/449）。經過對比可以發現，繁育場的PCV3檢出率較育肥場要高，詳情見表7。

表7 不同類型豬場PCV3檢測情況

3.3.3 不同生長階段的豬群PCV3感染情況

不同生長階段的豬群對PCV3的感染情況不同，能繁母豬和仔豬的感染陽性率分別為9.09%和17.50%，而育肥豬（1、2、3）的感染陽性率分別為3.33%、5.14%和7.79%。由此可知仔豬的PCV3感染陽性率最高，其次是能繁母豬，育肥豬最低，詳見表8。

表8 不同生長階段的豬群PCV3 PCR抗原檢測情況

4 討論

PCV3是近些年來新發現的一類豬圓環病毒，自2016年在美國報道后，其逐漸在世界范圍內傳播開來［12-13］。中國作為全球最大的豬肉生產和消費大國也有PCV3的相關報道［14］。阿克蘇地處我國西部邊陲，通過對該地區四個規模化養豬場展開調查，發現PCV3各豬場陽性發生率為100%，平均陽性率達7.53%，表明該地區的養豬場已經普遍存在PCV3感染。

通過數據分析可知，阿克蘇地區部分豬場PCV3陽性率結果與李靜等［15］研究結果相比要更低，推測可能與樣品來源的差異有關。所有陽性數據中，仔豬陽性率最高，育肥豬陽性率最低，且能繁母豬和仔豬的PCV3陽性率要高于育肥豬群。這與黃翠琴等［16］研究結果一致。

通過對44份陽性樣本PCR產物測序進行同源性比對分析，得到2種PCV3Cap基因序列。測序結果表明，AKesuCap-1、AKesuCap-2和15株中國PCV3Cap基因參考序列同源性較高，且與2018年QIAO M F等［17］在新疆阿克蘇地區商品豬場所發現的PCV3毒株相一致，推測可能PCV3的Cap基因在當地進化具有相對穩定性，要想進一步證實，還需要開展更廣泛的針對PCV3的研究。

5 結論

新疆阿克蘇地區部分規模化豬場存在PCV3感染，繁育場豬比育肥場豬感染率更高。