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2022-12-26 03:57:14張月趙崇杰韓先磊孫楊羅學剛霍金海張同存王偉明王楠
中國現代中藥 2022年11期 關鍵詞：黃酮
張月，趙崇杰，韓先磊，孫楊，羅學剛，霍金海，張同存，王偉明，王楠*
1.天津科技大學 生物工程學院 教育部工業發酵微生物學重點實驗室，天津 300457；
2.天津市微生物代謝與發酵過程控制工程研究中心，天津 300457；
3.黑龍江省中醫藥科學院 中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036
桔梗（Platycodonis Radix）為桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，屬于藥食同源的中藥材[1]。桔梗種植廣泛，在我國主要產于安徽、河南、湖北、遼寧、吉林等地，以東北、華北產量最高[2]。桔梗始載于《神農本草經》，性微溫，味甘、苦、辛，入肺經，具有宣肺利咽、祛痰排膿之功效[1]。由于其含有豐富的黃酮、多酚、皂苷、多糖類物質，因此具有較強的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖、調血脂等功效[3-5]。除了富含這些藥效物質外，鮮桔梗中還含有蛋白質、脂肪、碳水化合物等營養成分及鈣、磷、鐵等礦物質[6]。
近年來，越來越多的研究報道了桔梗提取物的抗氧化作用[7-10]。孫曉春等[7]對安徽、吉林和陜西3個產地桔梗水提物、醇提物和桔梗多糖中主要成分的含量進行測定，分析不同提取物的抗氧化活性，發現桔梗醇提物中總黃酮含量與多糖含量均為安徽＞吉林＞陜西，同時對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥自由基的清除率也為安徽＞吉林＞陜西。劉華麗等[8]采用正交設計法優化桔梗多酚的提取工藝，并測定了其抗氧化作用。王曉林等[9]優化了利用大孔吸附樹脂純化桔梗莖總黃酮的工藝條件，同時檢測了其體外抗氧化活性。李根等[10]通過酶解法制備桔梗汁，對出汁率和多酚含量進行測定，并評價其抗氧化活性，證實酶解工藝制備的桔梗汁具有較強的體外抗氧化活性。
發酵中藥成分經微生物發酵轉化是其發揮藥理作用的關鍵過程[11]。微生物發酵中藥具有提高有效成分含量、增強療效、擴大適應證、減少不良反應、產生新的藥用資源等作用[12]。然而，目前關于微生物發酵桔梗的研究中針對適用菌種的研究較少。因此，本研究選用多個菌株對桔梗進行發酵，對比發酵前后桔梗提取液中總多酚、總黃酮、總多糖含量變化，篩選出優勢菌株并分析發酵液的抗氧化活性，為桔梗的進一步開發利用提供參考。
1 材料
1.1 菌株
巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumZY2104 和人參芽孢桿菌B.ginsengisoliZY2103 來源于新鮮桔梗根部土壤；類腸膜魏斯菌Weissella paramesenteroidesZY2101 和綠色魏斯菌W.viridescensZY2102 來源于桔梗泡菜；鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosussw01 和枯草芽孢桿菌B.SubtilisRZ001 為本實驗室自有菌株；啤酒酵母Saccharomyces pastorianusS5、釀酒酵母S.CerevisiaeAY12 和S.CerevisiaeBY14 由天津科技大學現代釀造課題組饋贈；菌株均保藏于天津科技大學工業微生物菌種資源平臺。
1.2 試藥
干燥桔梗藥材購于河北安國藥材基地，由天津科技大學王楠教授鑒定為桔?？平酃僦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根；對照品蘆?。ㄅ枺篈27GB146690，純度≥98%）、MRS 培養基、瓊脂粉、七葉苷、總抗氧化能力（TAOC）檢測試劑盒、福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；R2A液體培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；蛋白胨、酵母提取物（賽默飛世爾科技公司）；對照品沒食子酸（批號：C10271829，純度≥99%）、K3[Fe(CN)5]（上海麥克林生化科技有限公司）；鄰苯三酚、Al(NO3)3、濃硫酸、NaNO2、C2HCl3O2（天津市江天化工技術股份有限公司）；檸檬酸鐵、水楊酸（上海阿拉丁生化科技有限公司）；苯酚（上海生工生物工程有限公司）；無水乙醇（天津市立元化工有限公司）；對照品桔梗皂苷D（批號：414K024，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；FeSO4（天津市北方天醫化學試劑廠）；H2O2（山東利爾康醫療科技股份有限公司）；FeCl3（天津渤化化學試劑有限公司）；DPPH（上海吉至生化科技有限公司）；HCl、NaOH（天津市科密歐化學試劑有限公司）。
1.3 儀器
TMC 型恒溫孵育器（合肥艾本森科學儀器有限公司）；S.VS-840U型超凈工作臺（上海躍進醫療器械廠）；SPX-150 型生化培養箱（上海精天儀器有限公司）；S30408 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；Hybrid Technology?型多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；JIDI-18D型離心機（廣州吉迪儀器有限公司）。
2 方法
2.1 培養基配制
MRS液體培養基：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、聚山梨酯-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加蒸餾水至1 L。調節pH 至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于乳酸菌活化和培養。
MRS瓊脂固體培養基：在MRS液體培養基的基礎上添加瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于乳酸菌的分離和純化。
YPD 培養基：蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、酵母提取物10 g。加蒸餾水至1 L。調節pH 至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于酵母的活化和培養。
YPD 瓊脂固體培養基：在YPD 液體培養基的基礎上添加瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于乳酸菌的分離和純化。
E-R2A固體培養基：R2A液體3.2 g、瓊脂20 g、七葉苷1 g、檸檬酸鐵0.5 g，加蒸餾水至1 L。用于判斷微生物的β-D-葡萄糖苷酶活力。
2.2 桔梗發酵液中多酚、黃酮、多糖含量測定
2.2.1 發酵桔梗的制備 將桔梗片粉碎，過40 目篩，精確稱量桔梗粉末2.5 g 和蒸餾水50 mL，充分混勻后于121 ℃滅菌20 min，按2%的接種量分別向其中接入各菌種，未發酵組加入等量蒸餾水作為對照組。于37 ℃發酵72 h，將對照組和發酵液組離心后，取全部上清液，用蒸餾水定容到50 mL，滅菌后于4 ℃保存，用于后續實驗。
2.2.2 總多酚含量的測定 采用福林酚測定法[13]測定多酚的含量。精確稱取沒食子酸對照品5 mg，用蒸餾水溶解并定容至50 mL 量瓶中，配制成質量濃度為0.1 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液。分別將沒食子酸對照品溶液0、1、2、3、4、5、6、7 mL置于試管中，并加入蒸餾水至10 mL，配成0、10、20、30、40、50、60、70 μg·mL-1的系列沒食子酸對照品溶液。分別從上述系列對照品溶液中吸1.0 mL于試管中，分別加入蒸餾水5 mL、福林酚試劑1 mL、Na2CO3溶液（0.075 g·mL-1）3 mL，振蕩顯色1 h后，在760 nm 波長下測定吸光度（A）并繪制標準曲線。將待測樣品稀釋后取1 mL，按照上述步驟分別加入各種試劑測定A，進行3 次重復實驗取平均值，由標準曲線計算出樣品中的總多酚含量。
2.2.3 總黃酮含量的測定 用硝酸鋁分光光度法[14]測定樣品中總黃酮含量。精密稱取對照品蘆丁5 mg，用70%乙醇溶解并定容在25 mL 量瓶中，配制成0.2 mg·mL-1蘆丁對照品溶液。分別吸取蘆丁對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于試管中，分別加入70%乙醇至2 mL，再加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min 后再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min，加入4%NaOH溶液2 mL，搖勻、靜置10 min后，于510 nm 波長下測定A并繪制標準曲線。取待測樣品溶液1 mL加入70%乙醇1 mL，如果A過高，則將樣品倍數稀釋，再按照上述步驟測定，每個樣品測3次取平均值。由標準曲線計算出樣品中的總黃酮含量。
2.2.4 總多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[15]測定多糖的含量。稱取葡萄糖50 mg 放入100 mL 量瓶中，加水將葡萄糖溶解；再分別吸取葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，加蒸餾水至2.0 mL，分別加入6%苯酚1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，振蕩搖勻，沸水浴中加熱15 min 顯色，冷卻后用紫外分光光度計測490 nm 波長處的A，用水作為空白對照，制得標準曲線，將樣品倍數稀釋后，按照上述步驟測定，根據標準曲線計算多糖的含量。
2.3 桔梗發酵液皂苷含量、體外抗氧化能力測定
2.3.1 七葉苷顯色平板法確定產酶菌 分別取不同微生物，采用三區劃線方法接種于含有E-R2A 固體培養基的平板上，37 ℃倒置培養48 h。利用七葉苷顯色原理，根據顏色變化（變黑）評估其β-D-葡萄糖苷酶的活性。
2.3.2 菌株生長曲線 取活化后的巨大芽孢桿菌ZY2014 在37 ℃培養24 h，每隔2 h 取1 次樣品，以空白培養基為對照，600 nm 下測得樣品的A。以生長時間為橫坐標，A為縱坐標繪制生長曲線。
2.3.3 皂苷含量的測定 采用香草醛-濃硫酸法[16]，精密稱取桔梗皂苷D 對照品3 mg，溶于70%甲醇1 mL，充分溶解。分別吸取對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，水浴蒸發至干燥，分別加入10%香草醛甲醇溶液0.5 mL 和60%硫酸5 mL，60 ℃水浴加熱15 min，冰水浴冷卻3 min。于472 nm 波長測定A并繪制標準曲線。取待測樣品1 mL，按照上述步驟測定，根據標準曲線計算出樣品中桔梗皂苷D的含量。
2.3.4 T-AOC 的測定 桔梗發酵液的T-AOC 檢測方法參照試劑盒說明書進行。
2.3.5 DPPH 自由基清除率測定 加入稀釋0、2、4、8 倍樣品4 mL 和0.15 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液4 mL，混勻避光后靜止30 min。以蒸餾水為空白組，于517 nm 處測A，按照公式（1）計算DPPH 自由基清除率。
式中A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度，A2為對照組吸光度（以乙醇代替DPPH-乙醇溶液）。
2.3.6 羥自由基清除率測定 配制稀釋0、2、4、8 倍樣品，取2 mL 置于試管中，加入6 mmol·L-1FeSO4溶液和6 mmol·L-1H2O2溶液各2 mL，室溫下靜置10 min后，再加入6 mmol·L-1水楊酸溶液2 mL，搖勻；室溫下靜置30 min，于510 nm 處測A。以蒸餾水為空白組，按照公式（2）計算羥自由基清除率。
式中A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度，A2為對照組吸光度（以蒸餾水代替水楊酸）。
2.3.7 Fe3+還原能力測定 配制不同質量濃度的樣品，分別取1 mL 于試管中。加入pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，搖勻后加入K3[Fe(CN)5] 水溶液2.5 mL，充分混勻后于50 ℃反應20 min。再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4 cm）。取上清液5 mL，加入蒸餾水5 mL 和0.1% FeCl3溶液1 mL。反應30 min 后，于700 nm 處測定A，以蒸餾水作為空白組，每個樣品測3次取平均值，按照公式（3）計算還原能力。
式中A為樣品的吸光度，A0為空白組吸光度。
2.4 數據處理
3 結果
3.1 桔梗發酵前后提取液中總多酚含量
微生物發酵對桔梗提取液中總多酚含量的影響如圖1 所示，其中巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵組總多酚質量濃度最高，為（5.06±0.05）mg·mL-1，其次是枯草芽孢桿菌RZ001、啤酒酵母S5 發酵組，分別為（4.83±0.01）、（4.37±0.01）mg·mL-1，而其他發酵組總多酚質量濃度與對照組比較差異無統計學意義。
圖1 不同菌株發酵前后桔梗提取液中總多酚質量濃度變化（,n=3）
3.2 桔梗發酵前后提取液中總黃酮含量
微生物發酵對桔梗提取液中總黃酮含量的影響如圖2 所示，其中巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵組的總黃酮質量濃度最高，為（5.83±0.06）mg·mL-1，其次是釀酒酵母AY12、類腸膜魏斯菌ZY2101、枯草芽孢桿菌RZ001、人參芽孢桿菌ZY2103發酵組，總黃酮質量濃度分別為（5.66±0.03）、（5.65±0.01）、（5.60±0.05）、（5.57±0.06）mg·mL-1，而釀酒酵母BY14、鼠李糖桿菌sw01、綠色魏斯菌ZY2102、啤酒酵母S5 發酵組總黃酮含量與對照組相比差異無統計學意義。
圖2 不同菌株發酵前后桔梗提取液中總黃酮質量濃度變化（,n=3）
3.3 桔梗發酵前后提取液中總多糖含量
微生物發酵對桔梗提取液中總多糖含量的影響如圖3 所示，其中鼠李糖桿菌sw01 發酵組的多糖質量濃度最高，為（11.84±0.87）mg·mL-1，其次是釀酒酵母AY12、釀酒酵母BY14、類腸膜魏斯菌ZY2101發酵組，分別為（10.95±0.37）、（10.89±0.49）、（10.85±1.02）mg·mL-1。而巨大芽孢桿菌ZY2104發酵組多糖質量濃度為（8.96±0.14）mg·mL-1，也顯著高于對照組 [（5.55±0.43）mg·mL-1]?？莶菅挎邨U菌RZ001 發酵組多糖含量與對照組相比差異無統計學意義。
圖3 不同菌株發酵前后桔梗提取液中總多糖質量濃度變化（,n=3）
相對于對照組及其他微生物發酵組，巨大芽孢桿菌ZY2104發酵組總多酚、總黃酮含量均最高，總多糖含量也處于較高水平。有研究報道[5,7]，桔梗皂苷是桔梗中的主要成分，具有抗氧化作用，因此后續實驗測定了對照組及發酵組中桔梗皂苷D的含量，并對巨大芽孢桿菌ZY2104是否具有β-D-葡萄糖苷酶活性進行了驗證，同時也對巨大芽孢桿菌ZY2104發酵桔梗提取液進行抗氧化活性測定。
3.4 巨大芽孢桿菌ZY2104的基本形態和生長曲線
菌落呈圓形、灰白色，表面光滑濕潤（圖4A）。革蘭染色呈紫色，棒狀桿菌，單個或呈短鏈排列（圖4B）。巨大芽孢桿菌ZY2104 的生長曲線如圖5所示，培養至18 h時，菌體生長進入穩定期。
圖4 巨大芽孢桿菌ZY2104的形態
圖5 巨大芽孢桿菌ZY2104的生長曲線
3.5 巨大芽孢桿菌ZY2104 產β-D-葡萄糖苷酶活性檢測
利用七葉苷顯色培養基對生物菌株產β-D-葡萄糖苷酶的情況進行分析，發現巨大芽孢桿菌ZY2104 可以在七葉苷顯色培養基中產黑色水解斑，且顏色較深，說明其β-D-葡萄糖苷酶活性較強（圖6）。
圖6 七葉苷顯色培養基中的巨大芽孢桿菌ZY2104
3.6 巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵前后桔梗提取液中桔梗皂苷D含量
對照組桔梗提取液中桔梗皂苷D 質量濃度為（34.07±1.47）μg·mL-1，巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵后桔梗提取液桔梗皂苷D 質量濃度降至（26.70±1.57）μg·mL-1（P＜0.05）。
3.7 發酵前后桔梗提取液抗氧化活性
巨大芽孢桿菌ZY2104發酵前后桔梗提取液的抗氧化能力變化情況見表1。不同的稀釋倍數下，發酵組T-AOC、DPPH 自由基的清除率與對照組比較均顯著提高（P＜0.05）；發酵組羥自由基清除率與對照組比較均提高。在未稀釋情況下，發酵組TAOC、還原能力與對照組比較顯著提高（P＜0.05），其他稀釋倍數下均有提高的趨勢。說明巨大芽孢桿菌ZY2104發酵能夠提高桔梗的抗氧化能力。
表1 發酵對桔梗提取液抗氧化能力的影響（,n=3）
表1 發酵對桔梗提取液抗氧化能力的影響（,n=3）
注：同列不同字母代表與相同稀釋倍數的對照組比較P＜0.05。
4 討論
中藥發酵主要是指在一定的環境條件下（如濕度、溫度等）借助微生物的作用使中藥的藥性、活性成分和功效應用均發生了變化，從而達到增強療效、減少不良反應、擴大用藥品種，適應臨床用藥的需要[17]。微生物發酵可以提高中藥有效成分的溶出，同時模擬體內微生物轉化過程，在體外把藥物轉化為人體能迅速吸收的有效成分，并產生豐富的次生代謝產物。
微生物含有多種豐富酶系，可以利用中藥中的蛋白質、多糖、微量元素、維生素等多種營養成分對中藥成分進行轉化。微生物可以通過利用降解苷類物質產生的糖類作為碳源，為其發酵生長提供能量。微生物發酵也可以提升多種中藥中黃酮、多酚類物質的含量。劉鋒等[18]研究表明，淡豆豉發酵過程中總黃酮和多糖含量隨發酵時間累積呈上升趨勢，總黃酮含量在發酵9 d 達到最高，多糖含量在發酵13 d 達到峰值。曾玲等[19]發現利用貝萊斯芽孢桿菌和庫德里阿茲威畢赤酵母菌株2 種菌株發酵桔梗提取液后，總黃酮、總酚含量均顯著升高，同時發酵液的抗氧化活性也顯著提升，其中貝萊斯芽孢桿菌菌株發酵后的體外抗氧化能力最強。Wang 等[20]利用鼠李糖乳桿菌217-1發酵桔梗根，制備的發酵液中桔梗皂苷D、類黃酮和多酚的質量濃度均顯著增加，同時DPPH 自由基清除率顯著提高，并且這種桔梗根發酵液可以降低葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的發生。
本研究中篩選出的活性較好的巨大芽孢桿菌ZY2104 是從新鮮桔梗的土壤中獲得，屬于植株內生菌。與其他菌株相比，其發酵桔梗提取液顯示了較高的多酚、黃酮和多糖含量。同時七葉苷平板實驗中也展示了巨大芽孢桿菌ZY2104 具有較高的β-D-葡萄糖苷酶活性。巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵桔梗后，提取液中桔梗皂苷D 質量濃度從（34.07±1.47）μg·mL-1下降到（26.70±1.57）μg·mL-1。已有研究報道，五環三萜皂苷類成分由于口服吸收較差及機體代謝作用致使其生物利用度普遍較低[21-22]。大多數皂苷主要經各種酶系、菌群等轉化為次級苷、苷元及氧化還原產物等而產生生物活性[23-25]。已知β-D-葡萄糖苷酶可以將桔梗中桔梗皂苷E 依次通過去掉1 個葡萄糖基分別生成桔梗皂苷D3和桔梗皂苷D，而桔梗皂苷D 在β-D-葡萄糖苷酶的作用下繼續生成去糖基化桔梗皂苷D[26-27]。桔梗皂苷D 在細胞酶PCL5 的作用下也可以通過去除1 個芹糖基和1 個木糖基分別生成去芹糖桔梗皂苷D 和脫脂木糖桔梗皂苷D[28]。本研究發現，在巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵桔梗后提取液中桔梗皂苷D 的含量降低，可能是由于其在β-D-葡萄糖苷酶或其他酶的作用下繼續轉化生成了其他有功能活性的物質。
巨大芽孢桿菌具有廣泛的應用價值。李秀穎等[29]將提取完皂苷后的黃姜藥渣、沸石粉、豆餅、過硫酸鈣等制成的固體培養基為原料，通過添加巨大芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、圓褐固氮菌等多種益生菌進行發酵，得到的生物有機肥料不僅生產成本低，還減少了藥渣對環境的污染。劉虎等[30]篩選出的1 株巨大芽孢桿菌具有高產β-D-葡萄糖苷酶能力，該酶可選擇性地將甜菊苷轉化，進而使甜菊糖（RA）的純度得到提高。本研究中也發現巨大芽孢桿菌ZY2104 顯著提高了桔梗發酵液的T-AOC、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力。
綜上所述，本研究利用多種不同來源的微生物對桔梗提取物進行發酵，結果發現內生菌巨大芽孢桿菌ZY2104是發酵桔梗的優勢菌種，可以顯著提高桔梗提取物中有效成分的含量，提高其抗氧化活性，為桔梗發酵研究與應用開發提供參考。
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巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumZY2104 和人參芽孢桿菌B.ginsengisoliZY2103 來源于新鮮桔梗根部土壤；類腸膜魏斯菌Weissella paramesenteroidesZY2101 和綠色魏斯菌W.viridescensZY2102 來源于桔梗泡菜；鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosussw01 和枯草芽孢桿菌B.SubtilisRZ001 為本實驗室自有菌株；啤酒酵母Saccharomyces pastorianusS5、釀酒酵母S.CerevisiaeAY12 和S.CerevisiaeBY14 由天津科技大學現代釀造課題組饋贈；菌株均保藏于天津科技大學工業微生物菌種資源平臺。
1.2 試藥
干燥桔梗藥材購于河北安國藥材基地，由天津科技大學王楠教授鑒定為桔?？平酃僦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根；對照品蘆?。ㄅ枺篈27GB146690，純度≥98%）、MRS 培養基、瓊脂粉、七葉苷、總抗氧化能力（TAOC）檢測試劑盒、福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；R2A液體培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；蛋白胨、酵母提取物（賽默飛世爾科技公司）；對照品沒食子酸（批號：C10271829，純度≥99%）、K3[Fe(CN)5]（上海麥克林生化科技有限公司）；鄰苯三酚、Al(NO3)3、濃硫酸、NaNO2、C2HCl3O2（天津市江天化工技術股份有限公司）；檸檬酸鐵、水楊酸（上海阿拉丁生化科技有限公司）；苯酚（上海生工生物工程有限公司）；無水乙醇（天津市立元化工有限公司）；對照品桔梗皂苷D（批號：414K024，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；FeSO4（天津市北方天醫化學試劑廠）；H2O2（山東利爾康醫療科技股份有限公司）；FeCl3（天津渤化化學試劑有限公司）；DPPH（上海吉至生化科技有限公司）；HCl、NaOH（天津市科密歐化學試劑有限公司）。
1.3 儀器
TMC 型恒溫孵育器（合肥艾本森科學儀器有限公司）；S.VS-840U型超凈工作臺（上海躍進醫療器械廠）；SPX-150 型生化培養箱（上海精天儀器有限公司）；S30408 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；Hybrid Technology?型多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；JIDI-18D型離心機（廣州吉迪儀器有限公司）。
2 方法
2.1 培養基配制
MRS液體培養基：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、聚山梨酯-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加蒸餾水至1 L。調節pH 至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于乳酸菌活化和培養。
MRS瓊脂固體培養基：在MRS液體培養基的基礎上添加瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于乳酸菌的分離和純化。
YPD 培養基：蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、酵母提取物10 g。加蒸餾水至1 L。調節pH 至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于酵母的活化和培養。
YPD 瓊脂固體培養基：在YPD 液體培養基的基礎上添加瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于乳酸菌的分離和純化。
E-R2A固體培養基：R2A液體3.2 g、瓊脂20 g、七葉苷1 g、檸檬酸鐵0.5 g，加蒸餾水至1 L。用于判斷微生物的β-D-葡萄糖苷酶活力。
2.2 桔梗發酵液中多酚、黃酮、多糖含量測定
2.2.1 發酵桔梗的制備 將桔梗片粉碎，過40 目篩，精確稱量桔梗粉末2.5 g 和蒸餾水50 mL，充分混勻后于121 ℃滅菌20 min，按2%的接種量分別向其中接入各菌種，未發酵組加入等量蒸餾水作為對照組。于37 ℃發酵72 h，將對照組和發酵液組離心后，取全部上清液，用蒸餾水定容到50 mL，滅菌后于4 ℃保存，用于后續實驗。
2.2.2 總多酚含量的測定 采用福林酚測定法[13]測定多酚的含量。精確稱取沒食子酸對照品5 mg，用蒸餾水溶解并定容至50 mL 量瓶中，配制成質量濃度為0.1 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液。分別將沒食子酸對照品溶液0、1、2、3、4、5、6、7 mL置于試管中，并加入蒸餾水至10 mL，配成0、10、20、30、40、50、60、70 μg·mL-1的系列沒食子酸對照品溶液。分別從上述系列對照品溶液中吸1.0 mL于試管中，分別加入蒸餾水5 mL、福林酚試劑1 mL、Na2CO3溶液（0.075 g·mL-1）3 mL，振蕩顯色1 h后，在760 nm 波長下測定吸光度（A）并繪制標準曲線。將待測樣品稀釋后取1 mL，按照上述步驟分別加入各種試劑測定A，進行3 次重復實驗取平均值，由標準曲線計算出樣品中的總多酚含量。
2.2.3 總黃酮含量的測定 用硝酸鋁分光光度法[14]測定樣品中總黃酮含量。精密稱取對照品蘆丁5 mg，用70%乙醇溶解并定容在25 mL 量瓶中，配制成0.2 mg·mL-1蘆丁對照品溶液。分別吸取蘆丁對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于試管中，分別加入70%乙醇至2 mL，再加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min 后再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min，加入4%NaOH溶液2 mL，搖勻、靜置10 min后，于510 nm 波長下測定A并繪制標準曲線。取待測樣品溶液1 mL加入70%乙醇1 mL，如果A過高，則將樣品倍數稀釋，再按照上述步驟測定，每個樣品測3次取平均值。由標準曲線計算出樣品中的總黃酮含量。
2.2.4 總多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[15]測定多糖的含量。稱取葡萄糖50 mg 放入100 mL 量瓶中，加水將葡萄糖溶解；再分別吸取葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，加蒸餾水至2.0 mL，分別加入6%苯酚1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，振蕩搖勻，沸水浴中加熱15 min 顯色，冷卻后用紫外分光光度計測490 nm 波長處的A，用水作為空白對照，制得標準曲線，將樣品倍數稀釋后，按照上述步驟測定，根據標準曲線計算多糖的含量。
2.3 桔梗發酵液皂苷含量、體外抗氧化能力測定
2.3.1 七葉苷顯色平板法確定產酶菌 分別取不同微生物，采用三區劃線方法接種于含有E-R2A 固體培養基的平板上，37 ℃倒置培養48 h。利用七葉苷顯色原理，根據顏色變化（變黑）評估其β-D-葡萄糖苷酶的活性。
2.3.2 菌株生長曲線 取活化后的巨大芽孢桿菌ZY2014 在37 ℃培養24 h，每隔2 h 取1 次樣品，以空白培養基為對照，600 nm 下測得樣品的A。以生長時間為橫坐標，A為縱坐標繪制生長曲線。
2.3.3 皂苷含量的測定 采用香草醛-濃硫酸法[16]，精密稱取桔梗皂苷D 對照品3 mg，溶于70%甲醇1 mL，充分溶解。分別吸取對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，水浴蒸發至干燥，分別加入10%香草醛甲醇溶液0.5 mL 和60%硫酸5 mL，60 ℃水浴加熱15 min，冰水浴冷卻3 min。于472 nm 波長測定A并繪制標準曲線。取待測樣品1 mL，按照上述步驟測定，根據標準曲線計算出樣品中桔梗皂苷D的含量。
2.3.4 T-AOC 的測定 桔梗發酵液的T-AOC 檢測方法參照試劑盒說明書進行。
2.3.5 DPPH 自由基清除率測定 加入稀釋0、2、4、8 倍樣品4 mL 和0.15 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液4 mL，混勻避光后靜止30 min。以蒸餾水為空白組，于517 nm 處測A，按照公式（1）計算DPPH 自由基清除率。
式中A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度，A2為對照組吸光度（以乙醇代替DPPH-乙醇溶液）。
2.3.6 羥自由基清除率測定 配制稀釋0、2、4、8 倍樣品，取2 mL 置于試管中，加入6 mmol·L-1FeSO4溶液和6 mmol·L-1H2O2溶液各2 mL，室溫下靜置10 min后，再加入6 mmol·L-1水楊酸溶液2 mL，搖勻；室溫下靜置30 min，于510 nm 處測A。以蒸餾水為空白組，按照公式（2）計算羥自由基清除率。
式中A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度，A2為對照組吸光度（以蒸餾水代替水楊酸）。
2.3.7 Fe3+還原能力測定 配制不同質量濃度的樣品，分別取1 mL 于試管中。加入pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，搖勻后加入K3[Fe(CN)5] 水溶液2.5 mL，充分混勻后于50 ℃反應20 min。再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4 cm）。取上清液5 mL，加入蒸餾水5 mL 和0.1% FeCl3溶液1 mL。反應30 min 后，于700 nm 處測定A，以蒸餾水作為空白組，每個樣品測3次取平均值，按照公式（3）計算還原能力。
式中A為樣品的吸光度，A0為空白組吸光度。
2.4 數據處理
3 結果
3.1 桔梗發酵前后提取液中總多酚含量
微生物發酵對桔梗提取液中總多酚含量的影響如圖1 所示，其中巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵組總多酚質量濃度最高，為（5.06±0.05）mg·mL-1，其次是枯草芽孢桿菌RZ001、啤酒酵母S5 發酵組，分別為（4.83±0.01）、（4.37±0.01）mg·mL-1，而其他發酵組總多酚質量濃度與對照組比較差異無統計學意義。
圖1 不同菌株發酵前后桔梗提取液中總多酚質量濃度變化（,n=3）
3.2 桔梗發酵前后提取液中總黃酮含量
微生物發酵對桔梗提取液中總黃酮含量的影響如圖2 所示，其中巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵組的總黃酮質量濃度最高，為（5.83±0.06）mg·mL-1，其次是釀酒酵母AY12、類腸膜魏斯菌ZY2101、枯草芽孢桿菌RZ001、人參芽孢桿菌ZY2103發酵組，總黃酮質量濃度分別為（5.66±0.03）、（5.65±0.01）、（5.60±0.05）、（5.57±0.06）mg·mL-1，而釀酒酵母BY14、鼠李糖桿菌sw01、綠色魏斯菌ZY2102、啤酒酵母S5 發酵組總黃酮含量與對照組相比差異無統計學意義。
圖2 不同菌株發酵前后桔梗提取液中總黃酮質量濃度變化（,n=3）
3.3 桔梗發酵前后提取液中總多糖含量
微生物發酵對桔梗提取液中總多糖含量的影響如圖3 所示，其中鼠李糖桿菌sw01 發酵組的多糖質量濃度最高，為（11.84±0.87）mg·mL-1，其次是釀酒酵母AY12、釀酒酵母BY14、類腸膜魏斯菌ZY2101發酵組，分別為（10.95±0.37）、（10.89±0.49）、（10.85±1.02）mg·mL-1。而巨大芽孢桿菌ZY2104發酵組多糖質量濃度為（8.96±0.14）mg·mL-1，也顯著高于對照組 [（5.55±0.43）mg·mL-1]?？莶菅挎邨U菌RZ001 發酵組多糖含量與對照組相比差異無統計學意義。
圖3 不同菌株發酵前后桔梗提取液中總多糖質量濃度變化（,n=3）
相對于對照組及其他微生物發酵組，巨大芽孢桿菌ZY2104發酵組總多酚、總黃酮含量均最高，總多糖含量也處于較高水平。有研究報道[5,7]，桔梗皂苷是桔梗中的主要成分，具有抗氧化作用，因此后續實驗測定了對照組及發酵組中桔梗皂苷D的含量，并對巨大芽孢桿菌ZY2104是否具有β-D-葡萄糖苷酶活性進行了驗證，同時也對巨大芽孢桿菌ZY2104發酵桔梗提取液進行抗氧化活性測定。
3.4 巨大芽孢桿菌ZY2104的基本形態和生長曲線
菌落呈圓形、灰白色，表面光滑濕潤（圖4A）。革蘭染色呈紫色，棒狀桿菌，單個或呈短鏈排列（圖4B）。巨大芽孢桿菌ZY2104 的生長曲線如圖5所示，培養至18 h時，菌體生長進入穩定期。
圖4 巨大芽孢桿菌ZY2104的形態
圖5 巨大芽孢桿菌ZY2104的生長曲線
3.5 巨大芽孢桿菌ZY2104 產β-D-葡萄糖苷酶活性檢測
利用七葉苷顯色培養基對生物菌株產β-D-葡萄糖苷酶的情況進行分析，發現巨大芽孢桿菌ZY2104 可以在七葉苷顯色培養基中產黑色水解斑，且顏色較深，說明其β-D-葡萄糖苷酶活性較強（圖6）。
圖6 七葉苷顯色培養基中的巨大芽孢桿菌ZY2104
3.6 巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵前后桔梗提取液中桔梗皂苷D含量
對照組桔梗提取液中桔梗皂苷D 質量濃度為（34.07±1.47）μg·mL-1，巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵后桔梗提取液桔梗皂苷D 質量濃度降至（26.70±1.57）μg·mL-1（P＜0.05）。
3.7 發酵前后桔梗提取液抗氧化活性
巨大芽孢桿菌ZY2104發酵前后桔梗提取液的抗氧化能力變化情況見表1。不同的稀釋倍數下，發酵組T-AOC、DPPH 自由基的清除率與對照組比較均顯著提高（P＜0.05）；發酵組羥自由基清除率與對照組比較均提高。在未稀釋情況下，發酵組TAOC、還原能力與對照組比較顯著提高（P＜0.05），其他稀釋倍數下均有提高的趨勢。說明巨大芽孢桿菌ZY2104發酵能夠提高桔梗的抗氧化能力。
表1 發酵對桔梗提取液抗氧化能力的影響（,n=3）
表1 發酵對桔梗提取液抗氧化能力的影響（,n=3）
注：同列不同字母代表與相同稀釋倍數的對照組比較P＜0.05。
4 討論
中藥發酵主要是指在一定的環境條件下（如濕度、溫度等）借助微生物的作用使中藥的藥性、活性成分和功效應用均發生了變化，從而達到增強療效、減少不良反應、擴大用藥品種，適應臨床用藥的需要[17]。微生物發酵可以提高中藥有效成分的溶出，同時模擬體內微生物轉化過程，在體外把藥物轉化為人體能迅速吸收的有效成分，并產生豐富的次生代謝產物。
微生物含有多種豐富酶系，可以利用中藥中的蛋白質、多糖、微量元素、維生素等多種營養成分對中藥成分進行轉化。微生物可以通過利用降解苷類物質產生的糖類作為碳源，為其發酵生長提供能量。微生物發酵也可以提升多種中藥中黃酮、多酚類物質的含量。劉鋒等[18]研究表明，淡豆豉發酵過程中總黃酮和多糖含量隨發酵時間累積呈上升趨勢，總黃酮含量在發酵9 d 達到最高，多糖含量在發酵13 d 達到峰值。曾玲等[19]發現利用貝萊斯芽孢桿菌和庫德里阿茲威畢赤酵母菌株2 種菌株發酵桔梗提取液后，總黃酮、總酚含量均顯著升高，同時發酵液的抗氧化活性也顯著提升，其中貝萊斯芽孢桿菌菌株發酵后的體外抗氧化能力最強。Wang 等[20]利用鼠李糖乳桿菌217-1發酵桔梗根，制備的發酵液中桔梗皂苷D、類黃酮和多酚的質量濃度均顯著增加，同時DPPH 自由基清除率顯著提高，并且這種桔梗根發酵液可以降低葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的發生。
本研究中篩選出的活性較好的巨大芽孢桿菌ZY2104 是從新鮮桔梗的土壤中獲得，屬于植株內生菌。與其他菌株相比，其發酵桔梗提取液顯示了較高的多酚、黃酮和多糖含量。同時七葉苷平板實驗中也展示了巨大芽孢桿菌ZY2104 具有較高的β-D-葡萄糖苷酶活性。巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵桔梗后，提取液中桔梗皂苷D 質量濃度從（34.07±1.47）μg·mL-1下降到（26.70±1.57）μg·mL-1。已有研究報道，五環三萜皂苷類成分由于口服吸收較差及機體代謝作用致使其生物利用度普遍較低[21-22]。大多數皂苷主要經各種酶系、菌群等轉化為次級苷、苷元及氧化還原產物等而產生生物活性[23-25]。已知β-D-葡萄糖苷酶可以將桔梗中桔梗皂苷E 依次通過去掉1 個葡萄糖基分別生成桔梗皂苷D3和桔梗皂苷D，而桔梗皂苷D 在β-D-葡萄糖苷酶的作用下繼續生成去糖基化桔梗皂苷D[26-27]。桔梗皂苷D 在細胞酶PCL5 的作用下也可以通過去除1 個芹糖基和1 個木糖基分別生成去芹糖桔梗皂苷D 和脫脂木糖桔梗皂苷D[28]。本研究發現，在巨大芽孢桿菌ZY2104 發酵桔梗后提取液中桔梗皂苷D 的含量降低，可能是由于其在β-D-葡萄糖苷酶或其他酶的作用下繼續轉化生成了其他有功能活性的物質。
巨大芽孢桿菌具有廣泛的應用價值。李秀穎等[29]將提取完皂苷后的黃姜藥渣、沸石粉、豆餅、過硫酸鈣等制成的固體培養基為原料，通過添加巨大芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、圓褐固氮菌等多種益生菌進行發酵，得到的生物有機肥料不僅生產成本低，還減少了藥渣對環境的污染。劉虎等[30]篩選出的1 株巨大芽孢桿菌具有高產β-D-葡萄糖苷酶能力，該酶可選擇性地將甜菊苷轉化，進而使甜菊糖（RA）的純度得到提高。本研究中也發現巨大芽孢桿菌ZY2104 顯著提高了桔梗發酵液的T-AOC、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力。
綜上所述，本研究利用多種不同來源的微生物對桔梗提取物進行發酵，結果發現內生菌巨大芽孢桿菌ZY2104是發酵桔梗的優勢菌種，可以顯著提高桔梗提取物中有效成分的含量，提高其抗氧化活性，為桔梗發酵研究與應用開發提供參考。
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