陳皮乳酸芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味與理化性質(zhì)的變化規(guī)律△

呂晨豪，李俊健，高杰賢，嚴(yán)靜，黎攀，杜冰，2*

1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；

2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

陳皮是蕓香科植物橘及其栽培變種的成熟果皮經(jīng)干燥制成，可分為“陳皮”和“廣陳皮”，是一種藥食同源的中藥[1]。陳皮含有豐富的生物活性物質(zhì)，如黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類、多糖類，具有重要的保健和醫(yī)學(xué)價(jià)值[2]。Fu 等[3]分析并鑒定了陳皮中的2 種生物堿類物質(zhì)，分別為辛弗林和水蘇堿，具有一定的抗哮喘、促進(jìn)代謝、減肥的功效。黃酮類物質(zhì)是陳皮的標(biāo)志性成分，包括橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素等[4]，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等功效[5-7]。陳皮在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[8]，但是陳皮揮發(fā)油產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及其他活性物質(zhì)的提取分離方面還有較為廣闊的研究空間。

乳酸發(fā)酵是保持或提高果蔬產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和延長(zhǎng)貨架期的最經(jīng)濟(jì)和有價(jià)值的生物技術(shù)[9]。崔欣悅等[10]使用5種乳酸菌對(duì)柑橘皮進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.170 mg·g-1上升至0.208 mg·g-1。黃艷[11]研究發(fā)現(xiàn)，利用乳桿菌對(duì)山楂進(jìn)行發(fā)酵，揮發(fā)性香氣成分與發(fā)酵前有明顯的差異，其中羰基類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了8.66%，對(duì)發(fā)酵后的山楂風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。乳酸芽孢桿菌Bacillussp.DU-106分離自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，具有良好的發(fā)酵性能，研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有降血壓、增強(qiáng)免疫和調(diào)節(jié)腸道菌群等功能，目前已成功應(yīng)用于鐵皮石斛、山藥、香蕉等多種農(nóng)產(chǎn)品加工[12-15]。

乳酸發(fā)酵能提高陳皮中營(yíng)養(yǎng)成分含量，但是發(fā)酵過(guò)程中陳皮理化特性及風(fēng)味的變化鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)接種乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵陳皮過(guò)程中的pH、總酸、亞硝酸鹽、有機(jī)酸、游離氨基酸及揮發(fā)性物質(zhì)變化進(jìn)行檢測(cè)分析，為陳皮精深加工和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

3 批新鮮陳皮藥材購(gòu)于廣東省江門(mén)市新會(huì)區(qū)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)杜冰教授鑒定為茶枝柑Citrus reticulatacv.'Chachiensis'的干燥成熟果皮；乳酸芽孢桿菌DU-106，菌粉濃度1×1012CFU·g-1，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源與功能性原料研究及評(píng)價(jià)中心保藏；鹽酸、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、5-磺基水楊酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg·mL-1，上海麥克林生化科技有限公司）；對(duì)照品酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（純度≥98%，批號(hào)分別為B25312、B20937、B21929、B30424、B21313、B20534，上海源葉生物科技有限公司）；H3PO4（色譜純，天津市東方化工廠）。

1.2 儀器

PHs-3C 型pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-1100 型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本日立公司）；7890B-5977A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、1260-G7111B 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 型萃取頭（美國(guó)Supelco 公司）；WRH-100TB1 型熱泵干燥箱（廣東威而信實(shí)業(yè)有限公司）。

2 方法

2.1 發(fā)酵陳皮的制備

將3 批新鮮陳皮洗凈、切分后，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量，按陳皮-2%鹽涼開(kāi)水（1∶2）裝入泡菜壇，再添加4%白砂糖攪拌均勻；按陳皮質(zhì)量的0.5%添加菌粉，于25 ℃下密封發(fā)酵10 d，分別取發(fā)酵過(guò)程中第0、2、4、6、8、10 天發(fā)酵液樣品測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，取樣后陳皮在40 ℃熱泵干燥至恒重，并選用3批不同批次的乳酸芽孢桿菌DU-106 重復(fù)以上發(fā)酵步驟。

2.2 pH和總酸的測(cè)定

發(fā)酵液中總酸參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》（GB 12456—2021）方法[16]，使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，折算系數(shù)以乳酸0.090計(jì)。

2.3 亞硝酸鹽的測(cè)定

發(fā)酵陳皮干燥樣品中亞硝酸鹽的測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）方法[17]，采用鹽酸萘乙二胺法。

2.4 有機(jī)酸的測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)將酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸6 個(gè)對(duì)照品分別配制 成0.932 9、0.483 4、0.287 3、0.624 0、0.387 6 mg·mL-15個(gè)不同質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備 準(zhǔn)確稱取干燥的發(fā)酵陳皮樣品2.0 g，研磨后轉(zhuǎn)入到50 mL 離心管中，加入超純水40 mL，于超聲波清洗機(jī)中提取30 min，冷卻后在4 000 r·min-1離心20 min（離心半徑為10 cm），上清液濾過(guò)到100 mL 量瓶中，殘?jiān)尤氤兯?0 mL再提取，合并上清液，超純水定容，0.22 μm濾膜濾過(guò)后待測(cè)。

2.4.3 色譜條件 Agilent Polaris C18-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1% H3PO4水溶液，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為40 ℃。根據(jù)保留時(shí)間采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 按2.4.3 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定系列混合對(duì)照品溶液，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1 所示，所有對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的r≥0.999，表明對(duì)照品線性關(guān)系良好。

表1 陳皮中有機(jī)酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)

2.4.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的RSD 分別為0.75%、1.21%、0.83%、0.65%、1.13%、0.37%，表明精密度良好。

2.4.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取干燥的發(fā)酵陳皮樣品0.2 g，按2.4.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的RSD 分別為0.45%、0.51%、0.73%、0.58%、0.71%、0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取干燥的發(fā)酵陳皮樣品0.2 g，平行6 份，按2.4.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果顯示，酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.25、1.23、5.67、86.57、3.85、0.27 mg·g-1，RSD 分別為0.75%、1.21%、0.83%、0.65%、1.13%、0.37%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取干燥的發(fā)酵陳皮樣品0.25 g，平行9 份，分別精密加入混合對(duì)照品適量，按供試品溶液處理方法制備樣品，進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率（表2）。酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的平均回收率分別為99.50%、101.17%、100.17%、99.78%、101.45%、100.84%，RSD分別為1.4%、1.8%、1.3%、2.4%、2.5%、2.8%，表明回收率較好。

表2 陳皮中6個(gè)有機(jī)酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

2.5 游離氨基酸的測(cè)定

取干燥樣品0.1 g 于研缽中，加入體積分?jǐn)?shù)為5%磺基水楊酸溶液3 mL，充分研磨后靜置1 h，于12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，濾液采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

2.6 揮發(fā)性成分的測(cè)定

2.6.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）條件 稱取干燥樣品0.5 g 置于50 mL 頂空瓶中密封，在70 ℃水浴平衡10 min 后將萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min，萃取后將纖維頭插入氣相色譜系統(tǒng)解吸3 min，解吸溫度為250 ℃。

2.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）條件 HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），前進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為He，流速為1.0 mL·min-1，分流比30∶1。升溫程序：初始柱溫為70 ℃，保持2 min，以4 ℃·min-1升至210 ℃。離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃；離子化方式為電子轟擊離子源（EI），電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z30～450。

2.6.3 數(shù)據(jù)分析 將質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST 14譜庫(kù)檢索，結(jié)合手動(dòng)檢索校對(duì)，選取匹配度＞90（最大值為100）成分作為定性結(jié)果；用峰面積歸一化法確定各種成分的相對(duì)含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

陳皮發(fā)酵過(guò)程中的pH 和總酸變化見(jiàn)圖1。發(fā)酵前期pH 迅速下降，后期逐漸穩(wěn)定在3.2 左右；總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵前期迅速上升，后期趨于穩(wěn)定，并在發(fā)酵10 d 時(shí)達(dá)到最大值4.67 g·kg-1。這是因?yàn)榻臃N后初始乳酸菌含量豐富，在發(fā)酵初期就能大量產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH 迅速下降和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速上升；發(fā)酵后期，發(fā)酵罐內(nèi)過(guò)酸的環(huán)境抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，此時(shí)產(chǎn)酸速率減緩，pH 和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都逐漸穩(wěn)定，這與任亭等[18]的研究結(jié)果一致。

圖1 陳皮發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化（,n=3）

3.2 發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的變化

亞硝酸鹽在蔬菜腌制品中廣泛存在，食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)《食品污染物中污染物限量》（GB 2762—2017）[19]中明確規(guī)定，腌漬蔬菜中亞硝酸鹽限量為20 mg·kg-1。陳皮發(fā)酵過(guò)程中的亞硝酸鹽含量變化見(jiàn)圖2。在陳皮發(fā)酵過(guò)程中，亞硝酸鹽含量先升高后降低，在發(fā)酵2 d 時(shí)達(dá)到峰值，為0.54 mg·kg-1，后續(xù)亞硝酸鹽含量逐漸降低并穩(wěn)定在0.1 mg·kg-1左右。發(fā)酵初期乳酸菌活力水平較低，部分雜菌分泌硝酸還原酶將陳皮內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，形成亞硝峰；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)酵液pH降低，抑制雜菌代謝產(chǎn)生亞硝酸鹽的同時(shí)加快了亞硝酸鹽的降解速度，直到亞硝酸鹽含量達(dá)到平衡。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中陳皮的亞硝酸鹽含量均低于20 mg·kg-1，具有很高的食用安全性。

圖2 陳皮發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的變化（,n=3）

3.3 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化

有機(jī)酸是評(píng)價(jià)腌漬蔬菜風(fēng)味的重要指標(biāo)，每種有機(jī)酸呈現(xiàn)出的酸味特征均不一樣。陳皮發(fā)酵過(guò)程中6 個(gè)有機(jī)酸均被檢測(cè)到，發(fā)酵10 d 陳皮中有機(jī)酸含量大小為乳酸＞乙酸＞酒石酸＞琥珀酸＞檸檬酸＞蘋(píng)果酸（表3）。乳酸酸味柔和，在陳皮發(fā)酵過(guò)程中占主導(dǎo)地位，發(fā)酵10 d 乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)166.29 mg·g-1，主要原因是乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)大量產(chǎn)生乳酸。乙酸酸味刺激，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在異型發(fā)酵過(guò)程中逐漸升高，最后可達(dá)127.52 mg·g-1，初始含量高主要是因?yàn)殛惼ぴ媳旧砗写罅康囊宜帷我凰嵛犊诟袉握{(diào)，多種有機(jī)酸的共同作用更有利于提升發(fā)酵陳皮的風(fēng)味[20]，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸均出現(xiàn)了不同程度的變化，對(duì)發(fā)酵后陳皮的口感產(chǎn)生重要影響。

表3 陳皮發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（,n=3）

表3 陳皮發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（,n=3）

注：同列不同小寫(xiě)字母表示P＜0.05；表4～5同。

3.4 發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化

食品中的游離氨基酸是重要的風(fēng)味物質(zhì)，陳皮發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化如表4 所示，發(fā)酵過(guò)程共檢測(cè)出16 種氨基酸，其中包括7 種必需氨基酸和9種非必需氨基酸。由表4可知，陳皮發(fā)酵過(guò)程中氨基酸種類相同，但含量不同，發(fā)酵后游離氨基酸含量顯著降低，其中變化較為明顯的有天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、組氨酸和脯氨酸等。根據(jù)Kato等[21]對(duì)氨基酸的分類，谷氨酸為鮮味氨基酸，發(fā)酵后其含量顯著升高，有利于提高發(fā)酵陳皮的鮮美滋味；苦味氨基酸則因?yàn)殚撝递^高，同時(shí)受到酸味和咸味的掩蓋而不易被嘗出。發(fā)酵過(guò)程中陳皮中的蛋白質(zhì)被分解成氨基酸，但在乳酸發(fā)酵中微生物生長(zhǎng)繁殖大量消耗游離氨基酸，同時(shí)氨基酸作為酯類、醛類香氣物質(zhì)的前體[22]，部分氨基酸溶出至發(fā)酵液，使發(fā)酵后陳皮游離氨基酸含量顯著降低。

表4 陳皮發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（,n=3）

表4 陳皮發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（,n=3）

3.5 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的變化

采用HS-SPME-GC-MS 檢測(cè)發(fā)酵陳皮中的揮發(fā)性成分，具體揮發(fā)性成分總離子流圖見(jiàn)圖3，種類和相對(duì)含量見(jiàn)圖4和表5。不同發(fā)酵時(shí)間陳皮共檢測(cè)出75個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)，其中發(fā)酵0、2、4、6、8、10 d的樣品分別鑒定出74、66、73、70、73、72 個(gè)，包括萜烯、酯、醛、醇、酮、酚、酸和醚共8 個(gè)種類，其中萜烯類和酯類種類和相對(duì)含量最多。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間的陳皮揮發(fā)性成分種類相對(duì)含量

表5 不同發(fā)酵時(shí)間的陳皮揮發(fā)性香氣成分及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）

表5 不同發(fā)酵時(shí)間的陳皮揮發(fā)性香氣成分及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）

續(xù)表5

續(xù)表5

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間的陳皮揮發(fā)性成分總離子流圖

6 個(gè)發(fā)酵時(shí)間樣品中萜烯類物質(zhì)相對(duì)含量分別為67.53%、70.62%、67.34%、80.63%、76.71%和77.02%，其中D-檸檬烯、γ-萜品烯和α-法尼烯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。萜烯類化合物多具有檸檬、藥草、干木等香氣，是柑陳皮中的特征性香氣組分[23]。酯類物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.29%、17.96%、18.92%、12.18%、14.66% 和14.44%；其中2-(甲氨基)-苯甲酸甲酯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，2-(甲氨基)-苯甲酸甲酯為茶枝柑果皮特有的一種香氣成分[24]，通常被描述為具有塵味和發(fā)霉味，發(fā)酵后2-(甲氨基)-苯甲酸甲酯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，有助于減少陳皮的塵味和發(fā)霉味；壬酸乙酯只在發(fā)酵后樣品被檢出，具有令人愉悅的水果和玫瑰香味[25]，可能有助于發(fā)酵后陳皮帶有果香花香味且香氣輪廓更飽滿。醇類物質(zhì)具有柑橘、干木、薄荷、玫瑰香氣；在不同發(fā)酵時(shí)間陳皮中的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.37%、1.86%、2.00%、1.81%、1.92%、1.94%，其中松油醇為主要成分，是一種比檸檬烯香氣更濃、應(yīng)用更廣泛的香料[23]。酮類物質(zhì)在不同發(fā)酵時(shí)間的陳皮樣品中分別占0.20%、0.14%、0.12%、0.11%、0.13%、0.11%，具有薄荷、樟腦、草藥等香味，其中右旋香芹酮為主要物質(zhì)。酚類物質(zhì)發(fā)酵期間相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.03%、0.87%、0.89%、0.59%、0.71%、0.78%，具有草藥、樟腦味。酸類和醚類物質(zhì)是化合物數(shù)量和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的，分別具有酸醋味和燒焦木味。

雖然醛類、醇類等物質(zhì)相對(duì)含量較低，但由于此類物質(zhì)閾值較低，故其也是發(fā)酵陳皮香氣的重要貢獻(xiàn)者。結(jié)果表明，陳皮在不同的發(fā)酵時(shí)間中揮發(fā)性物質(zhì)存在明顯差異。

4 結(jié)論

本研究探究了陳皮發(fā)酵過(guò)程中pH、總酸、亞硝酸鹽、有機(jī)酸、游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)的變化，所得發(fā)酵陳皮酸味柔和，具有泡菜的風(fēng)味和口感。接種乳酸芽孢桿菌DU-106 發(fā)酵能迅速降低發(fā)酵液pH，維持較高的總酸含量；亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于限量標(biāo)準(zhǔn)中的20 mg·kg-1，具有很高的食用安全性。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，以乳酸為主的多種有機(jī)酸含量不斷升高，豐富了陳皮的口感，游離氨基酸不斷下降。HS-SPME-GC-MS 共鑒定出76 個(gè)揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括萜烯類、酯類、醛類等8 個(gè)種類，其中含量最多的是萜烯類化合物；不同發(fā)酵時(shí)間檢測(cè)的揮發(fā)性化合物差異較明顯，發(fā)酵后期萜烯類化合物相對(duì)含量不斷增加，酯類、醛類、醇類化合物逐漸下降；這些化合物構(gòu)成了發(fā)酵陳皮獨(dú)特的檸檬、草藥、花果香味。本研究結(jié)果為新型陳皮發(fā)酵食品的生產(chǎn)研究和純種發(fā)酵技術(shù)提供了參考。