不同銨鹽對(duì)山豆根組培苗的影響△

范沾濤，劉寒，梁瑩，秦雙雙，韋范，李林軒，陸恒，吳廣秀，韋坤華*

1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心，廣西 南寧 530023；

2.中國(guó)藥科大學(xué) 江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211198

在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域中，培養(yǎng)基是培養(yǎng)物生長(zhǎng)分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，其組成成分對(duì)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和次生代謝物的形成和積累有至關(guān)重要的影響[1]。培養(yǎng)基中大量元素和微量元素都是生物必需的營(yíng)養(yǎng)成分，大量元素中的氮是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成部分，在生命活動(dòng)中占有首要位置，又稱生命元素[2]。氮素對(duì)植物生命活動(dòng)及作物產(chǎn)量、品質(zhì)均有極其重要的影響[3]。硝酸銨是一種重要的氮源，被廣泛用作激發(fā)劑以刺激植物生長(zhǎng)和發(fā)育，在受控條件下誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物[4]，可顯著促進(jìn)葉綠素合成和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累[5]。MS 培養(yǎng)基是目前廣泛應(yīng)用的植物組織培養(yǎng)基，其重要組分硝酸銨在高溫、高壓、有可被氧化的物質(zhì)（還原劑）存在及電火花下會(huì)發(fā)生爆炸，特別是在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸、使用過程中，如處理不當(dāng)或不采取相應(yīng)預(yù)防措施，有可能導(dǎo)致嚴(yán)重的爆炸事故，存在巨大安全隱患。近年來，國(guó)家對(duì)此類物品的監(jiān)管越來越嚴(yán)格，其市場(chǎng)流通受到限制，實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買硝酸銨的難度很大，給科研和生產(chǎn)帶來不便，有必要尋找硝酸銨的替代品。硝態(tài)氮（NO3--N）和銨態(tài)氮（NH4+-N）是植物吸收的主要氮源[6]，氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素可能為植物生長(zhǎng)提供氮源。因此，本研究以山豆根組培苗為供試材料，評(píng)價(jià)不同種類銨鹽物質(zhì)對(duì)硝酸銨的替代效果。

1 材料

供試材料由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室離體庫(kù)提供，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室韋坤華研究員鑒定為山豆根的基原植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep。

LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；YP202N 型電子天平（上海舍巖儀器有限公司）；SKIH-1214 型可調(diào)式垂直單向潔凈工作臺(tái)（上海天恒醫(yī)療器械有限公司）；JZ-II型接種器械滅菌器（濟(jì)南普朗特生物科技有限公司）；DL91150型數(shù)顯游標(biāo)卡尺（寧波得力工具有限公司）；GZX-GF101-1S 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

硫酸銨（批號(hào)：20200116）、氯化鈣（批號(hào)：20200103）、硫酸鎂（批號(hào)：20201203）、碘化鉀（批號(hào)：20210325）、鉬酸鈉（批號(hào)：20200320）、硫酸亞鐵（批號(hào)：20191203）、乙二胺四乙酸二鈉（批號(hào)：20200303）、煙酸（批號(hào)：20201029）、煙酸硫銨素（批號(hào)：20201014）、鹽酸吡哆醇（批號(hào)：20201025）、甘氨酸（批號(hào)：20210311）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠；氯化銨（批號(hào)：20210401）、碳酸氫銨（批號(hào)：20210104）、尿素（批號(hào)：20210115）、磷酸二氫鉀（批號(hào)：20191206）、硫酸錳（批號(hào)：20191108）、硫酸鋅（批號(hào)：20200112）、氯化鈷（批號(hào)：20201012）、硫酸銅（批號(hào)：20201025）、肌醇（批號(hào)：20200915）均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑工廠；硝酸銨（批號(hào)：20170515）、硝酸鉀（批號(hào)：20170503）均購(gòu)自西隴化工股份有限公司；蔗糖（批號(hào)：20210413）、硼酸（批號(hào)：20201022）均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；6-芐氨基嘌呤（6-BA，批號(hào)：B0015K0803011）、吲哚乙酸（IAA，批號(hào)：B0012K0323022）、激動(dòng)素（KT，批號(hào)：B0017K0414012）、萘乙酸（NAA，批號(hào)：B0018K0321017）、瓊脂（批號(hào)：B0018K0628001）均購(gòu)自北京康倍斯科技有限公司。

2 方法

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽繼代增殖的影響

從原叢生芽繼代培養(yǎng)基上，取1 簇（含3 個(gè)芽）叢生芽接入以下5 種叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種5 簇，每種培養(yǎng)基接種9 瓶，接種后置于溫度為（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照強(qiáng)度為1500～2000 lx的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)；40 d 后統(tǒng)計(jì)其長(zhǎng)葉枝條數(shù)（增殖的長(zhǎng)葉枝條）、增殖芽苗數(shù)和鮮質(zhì)量。

5 種叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基：1）對(duì)照培養(yǎng)基為MS+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；2）MS2 為MS（20.63 mmol·L-1氯化銨代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；3）MS3為MS（20.63 mmol·L-1碳酸氫銨代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；4）MS4為MS（20.63 mmol·L-1硫酸銨代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；5）MS5 為MS（20.63 mmol·L-1尿素代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT。氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素的用量根據(jù)對(duì)照培養(yǎng)基MS中銨鹽（硝酸銨）的氮量加入。所有培養(yǎng)基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊脂，pH為5.8～6.0。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽壯苗的影響

從原叢生芽壯苗培養(yǎng)基上，取2～3 cm 的莖段接入以下5種叢生芽壯苗培養(yǎng)基中，每瓶接種6株，每種培養(yǎng)基接種9 瓶，接種后置于溫度為（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照強(qiáng)度為1500～2000 lx 的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)；40 d 后統(tǒng)計(jì)其枝條數(shù)（增殖的枝條數(shù)）、株高（植株主莖最大高度）、莖粗（植株最下端莖部直徑）、葉數(shù)（增殖的葉數(shù)）和鮮質(zhì)量。

5 種叢生芽壯苗培養(yǎng)基：1）對(duì)照培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1IAA；2）MS2為MS（20.63 mmol·L-1氯化銨代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA；3）MS3 為MS（20.63 mmol·L-1碳酸氫銨代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA；4）MS4 為MS（20.63 mmol·L-1硫酸銨代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA；5）MS5 為MS 培養(yǎng)基（20.63 mmol·L-1尿素代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA。氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素的用量根據(jù)對(duì)照培養(yǎng)基MS 中銨鹽（硝酸銨）的氮量加入。所有培養(yǎng)基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊 脂，pH 為5.8～6.0。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

從原叢生芽壯苗培養(yǎng)基上，取2～3 cm 的頂尖莖段接入以下5 種生根培養(yǎng)基中，每瓶接種6 株，每種培養(yǎng)基接種9瓶，接種后置于溫度為（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照強(qiáng)度為1500～2000 lx 的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)；60 d 后統(tǒng)計(jì)其葉數(shù)（增殖的葉數(shù)）、株高（植株主莖最大高度）、平均根長(zhǎng)、平均根系直徑、平均根干質(zhì)量和生根率。平均根長(zhǎng)、平均根系直徑、平均根干質(zhì)量和生根率按公式（1）～（4）計(jì)算。

5 種生根培養(yǎng)基：1）對(duì)照培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；2）MS2 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1氯化銨 代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；3）MS3 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1碳酸氫銨代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；4）MS4 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1硫酸銨代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；5）MS5 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1尿素代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA。氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素的用量根據(jù)對(duì)照培養(yǎng)基1/2 MS 里銨鹽（硝酸銨）里的氮量加入。所有培養(yǎng)基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊脂，pH為5.8～6.0。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016 處理數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析。數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素（one-way ANOVA）和最小顯著差異（LSD）法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽繼代增殖的影響

由表1 和圖1 可知，山豆根叢生芽在MS2、MS3、MS4 和MS5 培養(yǎng)基均能繼代增殖。在MS4和MS5 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的叢生芽在接種20 d 后開始發(fā)黃，長(zhǎng)勢(shì)不好，長(zhǎng)葉枝條數(shù)、增殖芽苗數(shù)和鮮質(zhì)量都顯著低于對(duì)照組。山豆根叢生芽在MS2和MS3 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，長(zhǎng)葉枝條數(shù)和增殖芽苗數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合山豆根叢生芽繼代增殖培養(yǎng)，氯化銨或碳酸氫銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽繼代增殖培養(yǎng)。

圖1 不同培養(yǎng)基上繼代的山豆根叢生芽

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)山豆根叢生芽繼代增殖的影響（,n=5）

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)山豆根叢生芽繼代增殖的影響（,n=5）

注：同列不同小寫字母表示P＜0.05；表2～3同。

3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽壯苗的影響

由表2 和圖2 可知，MS2、MS3、MS4 和MS5培養(yǎng)基對(duì)山豆根枝條數(shù)、葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質(zhì)量有不同影響。在MS4 和MS5 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根長(zhǎng)勢(shì)不好，枝條數(shù)、葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質(zhì)量都顯著低于對(duì)照組。在MS3 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根枝條數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質(zhì)量都顯著低于對(duì)照組。在MS2 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根枝條數(shù)、葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質(zhì)量與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，碳酸氫銨、硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合山豆根叢生芽壯苗的培養(yǎng)，氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽壯苗的培養(yǎng)。

圖2 不同培養(yǎng)基上山豆根叢生芽壯苗情況

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)山豆根叢生芽壯苗的影響（,n=5）

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)山豆根叢生芽壯苗的影響（,n=5）

3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

由表3 和圖3 可知，在MS2 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根生根率最高，其次為對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根；在MS4 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根平均根系直徑最大；對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根的葉數(shù)、株高和平均根長(zhǎng)最好。在MS2、MS3、MS4 和MS5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根根干質(zhì)量顯著低于對(duì)照組。在MS2、MS3、MS4 和MS5 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的山豆根長(zhǎng)勢(shì)差，長(zhǎng)出來的根少，葉數(shù)、株高和平均根長(zhǎng)都顯著低于對(duì)照組。因此，氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合誘導(dǎo)山豆根生根。

圖3 不同培養(yǎng)基上山豆根生根情況

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)山豆根生根誘導(dǎo)的影響（,n=5）

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)山豆根生根誘導(dǎo)的影響（,n=5）

4 討論

氮素是植物的最基本營(yíng)養(yǎng)元素，并且是自然陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要限制性元素，在植物生長(zhǎng)過程中的各種生理代謝活動(dòng)中發(fā)揮了十分重要的作用[7-9]。氮元素的施用在植物生態(tài)系統(tǒng)過程中會(huì)引起多種元素耦合關(guān)系效應(yīng)，對(duì)多重化學(xué)元素的平衡關(guān)系有重要作用[10-12]。是植物吸收氮素的2 種離子形態(tài)，大量研究表明，NO3-有利于陽(yáng)離子運(yùn)輸，NH4+則抑制陽(yáng)離子運(yùn)輸[13-14]。與單純的硝態(tài)氮相比，硝酸銨的施用可增加作物的干物質(zhì)積累和蛋白質(zhì)含量[15]。銨態(tài)氮在不同環(huán)境脅迫條件下，不同作物品種會(huì)引發(fā)不盡相同的一系列調(diào)節(jié)作用[16-17]。氮素是影響植物生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累的重要因素[18]。在MS 培養(yǎng)基中，氮源是重要的組成成分，硝酸銨是培養(yǎng)基中氮元素的主要來源，硝酸銨在MS 培養(yǎng)基中占大量元素質(zhì)量的36.4%[19]。硝酸銨是危險(xiǎn)管制試劑，純品硝酸銨在市場(chǎng)上禁止流通，這嚴(yán)重影響著組培產(chǎn)業(yè)的生存和正常生產(chǎn)，尋找硝酸銨有效替代品非常必要。有研究報(bào)道，以尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適于蘋果、草莓和葡萄組培苗的生長(zhǎng)，以硫酸銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基中，蘋果、草莓和葡萄組培苗生長(zhǎng)正常，這3 種植物葉片平展，葉色嫩綠，植物幼嫩組織含水量高，植株生長(zhǎng)旺盛[20]。賈思振等[21]研究發(fā)現(xiàn)，用硫酸銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適于火焰南天竹再生。在本研究中，氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素代替硝酸銨的改良培養(yǎng)基對(duì)山豆根組培苗有著不同的影響。硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合山豆根組培苗的生長(zhǎng)。碳酸氫銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽的繼代增殖。氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽的繼代增殖和叢生芽壯苗培養(yǎng)。氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基對(duì)山豆根誘導(dǎo)生根有很大影響，原因有待進(jìn)一步研究。氯化銨試劑相對(duì)安全、易獲取，在缺少硝酸銨的情況下，可將氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基用于山豆根叢生芽的繼代增殖和叢生芽壯苗培養(yǎng)。