基于傳統(tǒng)煎煮方法的吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張偉娜，李雪，劉書霞，周永康，杜守穎

1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司/中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心/北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101300；

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛 吳茱萸E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang 的干燥近成熟果實［1］。其性熱，味辛、苦，有小毒，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)。吳茱萸具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功效，臨床用于厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉、慢性膽囊炎、消化性潰瘍、慢性淺表性胃炎、神經(jīng)官能癥、眩暈、頭痛、高血壓等癥［1-2］。吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，又名吳萸、茶辣、臭辣子樹、曲藥子、伏辣子，是我國常用的大宗中藥材，在我國分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、變種多。王承南等［3］通過對3 個基原吳茱萸進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其有效成分含量有顯著差異。3 個基原中，藥用有效成分（吳茱萸堿和吳茱萸次堿）成分含量吳茱萸最高，石虎次之，疏毛吳茱萸最低。為保證成品質(zhì)量的穩(wěn)定，需對基原固化。綜合應(yīng)用歷史、產(chǎn)地分布、質(zhì)量、產(chǎn)量等因素，本研究對象為蕓香科植物吳茱萸。

吳茱萸的化學(xué)成分較復(fù)雜，主要包括生物堿類、苦味素、黃酮類、萜類、香豆素類、木脂素類、甾體類、揮發(fā)油和有機(jī)酸類化合物，其中生物堿和苦味素是吳茱萸的主要化學(xué)成分，目前對生物堿的研究較深入?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版將吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素作為吳茱萸質(zhì)量的評價指標(biāo)。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按照中醫(yī)臨床處方配方后，供患者沖服使用，其臨床療效應(yīng)當(dāng)和相應(yīng)的飲片保持一致。為加強(qiáng)中藥配方顆粒質(zhì)量管理，國家藥品監(jiān)督管理局2021 年1 月公布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［4］，明確了標(biāo)準(zhǔn)湯劑為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑為遵循中醫(yī)藥理論，由不少于15 批有代表性的原料，經(jīng)炮制加工后，分別按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮制得或經(jīng)適宜方法干燥制得。

本研究以傳統(tǒng)湯劑的煎煮方法為基準(zhǔn)，建立以出膏率和指標(biāo)成分檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的轉(zhuǎn)移率為評價指標(biāo)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為吳茱萸配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器

微電腦陶瓷煎藥壺（永達(dá)基電器廠）；ACQUITY UPLC?H-Class 型超高效液相色譜儀、TUV Detector型檢測器（Waters 公司）；ME104E 型電子天平、XP-26 型電子天平［梅特勒托利多儀器（上海）有限公司］；JY20002 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；BSA124S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ-500DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G薄層板（煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所、煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗廠）。

1.2 試藥

對照品檸檬苦素（批號：110800-201707，純度：97.9%）、吳茱萸堿（批號：110802-201710，純度：99.6%）、吳茱萸次堿（批號：110801-201608，純度：99.7%）、吳茱萸藥材（批號：120909-201510）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸均為色譜純；甲醇、乙醇均為分析純；蒸餾水。

本研究收集的3 個主產(chǎn)地和道地產(chǎn)區(qū)共15 批吳茱萸藥材經(jīng)王孝濤傳承工作室制藥工程師于立偉鑒定為中藥吳茱萸，經(jīng)過DNA 條形碼檢測均為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.。經(jīng)炮制后制成15 批吳茱萸飲片，按照《中國藥典》2020年版檢測，均符合規(guī)定。

15批吳茱萸藥材信息見表1。

表1 吳茱萸藥材產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑

依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［4］和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》［5］中相關(guān)要求制備吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

取吳茱萸，置于陶瓷煎藥壺中，浸泡30 min，一煎加入飲片8倍量水，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁熱濾過，冷卻，備用；二煎加飲片6 倍量水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱濾過，冷卻，合并兩煎濾液，作為吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑。吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑低溫減壓濃縮（50 ℃）至料液比約為1∶1，冷凍干燥，得吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

15 批吳茱萸飲片按照上述方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑和標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

2.2 薄層色譜鑒別

考慮到吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑是由吳茱萸經(jīng)水煎煮制得，水溶性成分較多，《中國藥典》2020 年版及相關(guān)文獻(xiàn)［6-8］所載方法多用于偏小極性成分分析，需增加水溶性成分的定性鑒別。本鑒別方法根據(jù)《中國藥典》2020 年版吳茱萸項下薄層鑒別方法和相關(guān)文獻(xiàn)所載方法［6-8］，經(jīng)實驗研究優(yōu)化制定，選用吳茱萸堿、吳茱萸次減、吳茱萸對照藥材水煮處理品作為對照，采用二次展開的方式進(jìn)行檢視。

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉研細(xì)，稱取0.5 g，加乙醇10 mL，靜置30 min，超聲處理30 min，濾過，作為供試品溶液。取吳茱萸對照藥材1 g，加水25 mL，煮沸30 min，濾過，蒸干，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，作為對照藥材溶液。取吳茱萸次堿對照品、吳茱萸堿對照品，加乙醇分別制成質(zhì)量濃度為0.2、1.5 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。取對照品溶液2 μL、對照藥材溶液及供試品溶液各5 μL分別點于同一硅膠G 板上，以正己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇-三乙胺（24∶9∶5.5∶1∶0.4）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，再以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液，在105 ℃加熱，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.3 指標(biāo)成分含量測定

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～4 min，4%A；4～9 min，4%～11%A；9～10 min，11%A；10～14 min，11%～18%A；14～20 min，18%～35%A；20～26 min，35%～40%A；26～30 min，40%A；30～31 min，40%～80%A；31～33 min，80%A；33～34 min，80%～4%A）；檢測波長為225 nm；柱溫為35 ℃；流速為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為160、25、15 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取研細(xì)的樣品約0.2 g，精密稱定，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 含量測定方法學(xué)

2.3.4.1 精密度試驗 取吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（WZY-07）6 份，按2.3.1 項下方法測定。結(jié)果檸檬苦素含量的RSD 為0.98%，吳茱萸堿含量的RSD 為0.62%，吳茱萸次堿含量的RSD 為0.56%，表明精密度良好。

不同分析人員在不同時間取吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（WZY-07）6 份，用不同儀器按照2.3.1 項下方法進(jìn)行中間精密度試驗。結(jié)果檸檬苦素含量的RSD 為1.08%，吳茱萸堿含量的RSD 為1.47%，吳茱萸次堿含量的RSD 為3.38%，符合方法學(xué)驗證精密度要求。

2.3.4.2 加樣回收率試驗 精密稱取已知指標(biāo)成分含量的吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉0.1 g，分別精密加入0.5、1、1.5 倍量檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件測定，計算平均加樣回收率，結(jié)果檸檬苦素平均回收率為97.44%，RSD 為3.86%，吳茱萸堿的平均回收率為100.30%，RSD為3.49%，吳茱萸次堿的平均回收率為102.14%，RSD為2.99%（表2）。

表2 吳茱萸中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.4.3 線性關(guān)系考察 取檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為600、100、32 μg·mL-1的溶液，作為混合對照品母液。分別精密吸取對照品母液1、3、5、10 mL，置于20 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過；精密吸取上述續(xù)濾液及母液1 μL，注入超高效液相色譜儀，按2.3.1項下條件分別測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得檸檬苦素回歸方程：Y=586.17X+1 939.5（r=0.999 80），在29.705～594.096 μg·mL-1線性良好；吳茱萸堿回歸方程：Y=34 566X+11 015（r=1.000 0），在5.139～102.787 μg·mL-1線性良好；吳茱萸次堿回歸方程：Y=18 198X+8 317.7（r=0.999 9），在1.566～31.316 μg·mL-1線性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗 取吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按照2.3.1 項下方法進(jìn)行測定。24 h 內(nèi)檸檬苦素峰的峰面積RSD 為1.74%；吳茱萸堿峰的峰面積RSD 為0.91%；吳茱萸次堿的峰面積RSD為0.69%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品測定

2.4.1 出膏率及pH 將2.1 項下標(biāo)準(zhǔn)湯劑稱質(zhì)量，搖勻后稱取出總藥液質(zhì)量的約1/10，稱定質(zhì)量，置于質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中，干燥6 h后，取出，于干燥器中放至室溫，稱質(zhì)量，計算出膏率。15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為26.15%～28.79%，平均出膏率為27.75%，見表3。

表3 吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉3個成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)移率

使用pH 計測定2.1 項下標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH，15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH 均值為5.39，RSD 為3.92%，各批次間差異不大，均為酸性溶液。

2.4.2 薄層色譜鑒別

2.4.2.1 不同溫、濕度考察 分別吸取吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉供試品、吳茱萸對照藥材、吳茱萸堿對照品及吳茱萸次堿對照品溶液，點于同一硅膠G 薄層板上，分別在5～15、20～35 ℃ 2 個溫度區(qū)間，10%～30%、75%～90%2 個相對濕度條件下展開，取出，晾干，顯色，在紫外燈下（365 nm）檢視，薄層色譜圖見圖1～4。

圖1 常溫常濕下吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉薄層鑒別

圖2 低溫常濕下吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉薄層鑒別

圖3 常溫低濕下吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉薄層鑒別

圖4 常溫高濕下吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉薄層鑒別

2.4.2.2 不同廠家薄層板考察 分別采用不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板，按薄層條件展開，結(jié)果見圖5～6。

圖5 不同硅膠G薄層板（煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗廠）薄層鑒別圖

圖6 不同硅膠G薄層板（青島海洋）薄層鑒別

2.4.2.3 樣品測定 15 批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉按照2.2 項下方法檢測，薄層色譜圖信息全面，斑點清晰，第一次展開在與對照品相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點，第二次展開在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點。各批均能實現(xiàn)良好的分離效果。結(jié)果見圖7～8。

圖7 15批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉一次展開薄層鑒別

圖8 15批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉二次展開薄層鑒別

2.4.3 指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率 15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉按照2.3 項下方法檢測，計算各樣品中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量及轉(zhuǎn)移率。15 批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉中檸檬苦素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60%，實測為0.45%～0.71%，吳茱萸堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.19%，實測為0.11%～0.29%。吳茱萸次堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.058%，實測為0.049%～0.062%，結(jié)果見圖9、表3。

圖9 吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定色譜圖

3 分析與討論

吳茱萸屬于蕓香科植物的果實，味辛，氣芳香。本課題組在研究前，對15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑提取液進(jìn)行提取，均未收集到揮發(fā)油，可能與吳茱萸本身揮發(fā)油含量不高有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道，吳茱萸中揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～3.80%［9］，經(jīng)過煎煮后揮發(fā)油受熱揮發(fā)，水煎液中幾乎不含揮發(fā)油，而且吳茱萸中揮發(fā)油常被認(rèn)為具急性毒性，且主要是肝毒性［10-13］，是需要去除的。綜上分析，吳茱萸仍按照一般果實種

子類標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法制備，即2.1項下方法。

經(jīng)SPSS Statistics 20 數(shù)理統(tǒng)計分析，15 批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)均無離散值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。出膏率均值為27.75%，RSD 為2.59%，檸檬苦素轉(zhuǎn)移率均值為26.10%，RSD 為15.80%；吳茱萸堿轉(zhuǎn)移率均值為2.82%，RSD 為19.64%；吳茱萸次堿轉(zhuǎn)移率均值為3.76%，RSD 為26.18%。15 批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉出膏率分布范圍相對集中；檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿轉(zhuǎn)移率分布范圍相對離散，表明不同產(chǎn)地、不同規(guī)格的吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率差別不大，含量及轉(zhuǎn)移率差異較大。

15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH 為5.1～6.0，說明吳茱萸水煎液為弱酸性溶液。推測與其他藥物配伍可能有助于其中堿性成分溶出。

吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑為吳茱萸的水煎液，薄層色譜鑒別時先選用正己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇-三乙胺展開系統(tǒng)，展開，以吳茱萸堿、吳茱萸次堿為對照，檢視其中小極性成分，再以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水為展開系統(tǒng)，展開，以吳茱萸對照藥材為對照，檢視其中等極性和大極性成分。按照該方法檢測，指標(biāo)成分分離度較好，比移值（Rf）適當(dāng)，供試品與對照品、對照藥材斑點對應(yīng)、耐用性好，對比《中國藥典》2020 年版薄層色譜鑒別方法，該方法可同時鑒別小極性、中等極性和大極性成分。吳茱萸堿對照品在第二次展開中有時會有3 個熒光斑點，分析造成這一現(xiàn)象的原因有以下幾點：1）吳茱萸堿物理性質(zhì)為微溶于乙醇，配制對照品時需超聲處理1 h左右才能全部溶解，超聲過程中產(chǎn)熱可能會導(dǎo)致其分解。2）對照品溶液為1 個月前配制，推測有可能在儲存過程中已有部分分解。3）二次展開系統(tǒng)為酸性系統(tǒng)，不穩(wěn)定，但在液相色譜中未檢測到其他色譜峰，因此吳茱萸堿存儲過程中分解的可能性不大。推測是吳茱萸堿與展開劑發(fā)生了反應(yīng)或在展開劑中分布不均勻，需進(jìn)一步研究確定。

色譜條件考察中嘗試了乙腈-0.1%甲酸系統(tǒng)，峰堆積較嚴(yán)重，更換甲醇-0.1%甲酸系統(tǒng)，基線波動較大，更換乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)，基線波動小，調(diào)整流動相梯度，最終所得色譜圖峰譜信息量較大，分離效果較佳，3 個指標(biāo)成分峰形好，分離效果好。而且該方法可同時檢視吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉中小極性、中極性、大極性成分，也是吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的特征圖譜檢測方法。供試品制備方法中考察了提取溶劑的種類和提取時間、提取方式，分別比較了以甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水為溶劑時的提取效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑提取效果最好，而回流和超聲提取方式及超聲時間對提取效果影響不大，因此確定供試品溶液的制備方法為甲醇超聲30 min。

15批吳茱萸標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下按照傳統(tǒng)湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮制得或經(jīng)適宜方法干燥制得的。15批吳茱萸藥材來自不同的主產(chǎn)區(qū)和道地產(chǎn)區(qū)，標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮選用傳統(tǒng)陶瓷煎藥壺，熱源選用微電腦控制面板的電爐，煎煮工藝統(tǒng)一。選用出膏率、薄層色譜鑒別和檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿3個指標(biāo)成分含量作為吳茱萸配方顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)，方法嚴(yán)謹(jǐn)。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究可為吳茱萸配方顆粒的質(zhì)量控制、工藝研究和含吳茱萸的中藥經(jīng)典名方開發(fā)提供參考。