燈心草煅炭前后UPLC指紋圖譜研究及菲類成分含量測定△

趙夢輝，鞠成國，2*，王巍，孟則敬，賈天柱，2

1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；

2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600

燈心草為燈心草科植物燈心草Juncus effususL.的干燥莖髓，具有清心火、利小便的作用，用于心煩失眠、尿少澀痛、口舌生瘡[1]，煅炭后具有止血作用[2]。現代藥理研究表明，燈心草具有抗炎、抗氧化、降血壓、抗焦慮、鎮靜等作用[3-7]。燈心草提取物中發現多種菲類化合物，以9,10-二氫菲及二聚體菲類化合物為主。菲類成分具有聯苯骨架結構，被認為是植物燈心草的分類特征成分[4]，其中以去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚3 個成分含量最高[8]。中藥普遍存在道地性，不同產地的燈心草質量各異。色譜指紋圖譜技術從中藥整體入手，以色譜特征峰構成該藥材特有的色譜指紋圖譜全貌，可為藥材質量分析與控制提供參考[8]。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（包括QSM 型四元高壓梯度泵、FTN 型樣品管理器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 2數據處理工作站，Waters公司）；AE240 型十萬分之一電子分析天平（Mettler-Toledo 公司）；FA1004B 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；Milli-Q Integral 型純水儀（Millipore 公司）；KQ-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-100 型高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試藥

對照品去氫厄弗酚（批號：MB13634）、厄弗酚（批號：MB13633）、燈心草酚（批號：MB13637）均購自大連美侖生物技術有限公司，純度均大于98%；甲醇為色譜純；無水乙醇為分析純；水為超純水。

10 批燈心草經遼寧中醫藥大學中藥鑒定室王添敏教授鑒定為燈心草科植物燈心草Juncus effususL.的干燥莖髓。生品樣品編號為S1～S10，炭品樣品編號為T1～T10，樣品信息見表1。燈心炭的制備：按本課題組前期優選的最佳工藝（控制投藥質量與容器容積比為3 g·L-1，250 ℃密閉煅制15 min，待冷后取出）制得。

表1 燈心草樣品信息

2 方法與結果

2.1 燈心草炮制前后指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UHPLC HSS-T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，3%～30%A；5～6 min，30%～35%A；6～7 min，35%～40%A；7～20 min，40%～100%A）；柱溫為27 ℃；檢測波長為265 nm；流速為0.2 mL·min-1；樣品室溫度為10 ℃；分析時間為20 min；進樣量為1.0 μL，理論板數按燈心草酚計算應不低于3000[9]。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚對照品，加甲醇完全溶解，制得質量濃度分別為68.35、81.60、82.41 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取燈心草粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質量，以95%乙醇補足減失質量，搖勻，定量濾紙濾過，取續濾液，用0.22 μm微濾膜濾至進樣小瓶，即得。

2.1.4 精密度試驗 取供試品（S10、T10）溶液，按照2.1.1項下的色譜條件測定，連續進樣6次，測定生品各個共有峰相對保留時間的RSD 為0.02%～0.83%，測定炭品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.67%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取供試品（S10、T10）溶液，按照2.1.1 項下的色譜條件測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定生品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.20%，測定炭品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.18%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取供試品（S10、T10）粉末0.3 g，各6 份，精密稱定，按2.1.3 項下方法制成供試品溶液，按照2.1.1 項下的色譜條件測定，分別進樣，以燈心草酚為參照峰，測定生品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.07%～0.41%，各共有峰相對峰面積的RSD為1.89%～2.86%；測定炭品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.58%，各共有峰的相對峰面積的RSD為0.87%～1.92%，表明方法重復性良好。

2.1.7 燈心草、燈心炭指紋圖譜的建立 取10 批燈心草和燈心炭樣品，按2.1.3 項下的方法制成供試品溶液，按照2.1.1 項下的色譜條件測定。使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）分別建立10 批燈心草和燈心炭樣品指紋圖譜，并生成指紋圖譜的對照圖譜（圖1～3）[10]。根據“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）的譜峰匹配數據，10批生品色譜圖中可標定15個共有峰，炭品色譜圖中可標定16個共有峰。

圖1 燈心草、燈心炭UPLC指紋圖譜

燈心炭與燈心草相比，新增8 個峰（圖3 中峰3～5、7、9、12～14）；缺失5 個峰（圖2 中峰9～11、14、15），其中峰11 為厄弗酚；一些成分的量發生了明顯的變化，如圖2中峰12、13的含量顯著降低，分別為去氫厄弗酚、燈心草酚。這說明燈心草在炮制后，化學成分的種類及含量發生了明顯的變化。

圖2 燈心草UPLC指紋圖譜對照圖譜

圖3 燈心炭UPLC指紋圖譜對照圖譜

2.1.8 指紋圖譜相似度評價 使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），采用平均數法計算10 批燈心草和燈心炭樣品的相似度[11]。結果燈心草（S1～S10）與對照圖譜的相似度分別為0.995、0.999、0.995、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998、0.996、0.999。燈心炭（T1～T10）與對照圖譜的相似度分別為0.905、0.924、0.894、0.975、0.967、0.965、0.970、0.938、0.899、0.904。樣品與對照指紋圖譜的相似度均大于0.89，說明不同產地燈心草飲片質量一致性良好且煅炭工藝穩定，炮制后飲片質量仍具有一致性（表2～3）。

表2 10批燈心草樣品與對照指紋圖譜的相似度

表3 10批燈心炭樣品與對照指紋圖譜的相似度

2.1.9 主成分分析（PCA）將燈心草與燈心炭指紋圖譜的共有峰峰面積的數據導入SPSS 26.0 軟件，因子分析檢驗結果顯示，KMO 檢驗系數為0.565，Bartlett 球形檢驗近似卡方值為278.574（P＜0.001），適合做因子分析；采用降維-因子分析技術，以特征值＞1 為提取原則[12]，共提取到4 個主因子，累積方差貢獻率為95.256%，說明前4 個因子能夠揭示燈心草在炮制過程中大多數的變異信息，可以反映樣品主要特征，具有良好的代表性，結果見表4。采用Origin 2019 軟件PCA 對10 批燈心草、燈心炭樣品共有峰峰面積進行PCA，以觀察炮制前后燈心草的差異，結果見圖4。由圖4 可知，燈心草和燈心炭的主成分空間分布有各自特定的區域，表明兩者化學成分存在差異，PCA 能夠將燈心草和燈心炭區分開。

圖4 10批燈心草、燈心炭樣品PCA得分

表4 10批燈心草、燈心炭樣品因子分析特征值及方差貢獻率結果

2.1.10 聚類分析（CA）運用SPSS 26.0 軟件，以燈心草與燈心炭指紋圖譜的共有峰峰面積為變量進行系統聚類，采用瓦德爾聯接法，以平方歐氏距離作為樣品相似度的距離公式，結果見圖5。CA 將10 批燈心草樣品S1～S10 聚為一類，10 批燈心炭樣品T1～T10 聚為一類。由此可見，CA 既能全面反映燈心草、燈心炭UPLC 圖的相似性，又能反映燈心草與燈心炭的差異。

圖5 10批燈心草、燈心炭樣品CA樹狀圖

2.2 不同產地燈心草中3個菲類成分含量測定

2.2.1 色譜條件 ACQUITY UHPLC HSS-T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，55%～60%A；3～5 min，60%～75%A；5～7 min，75%～90%A；7～10 min，90%～95%A；10～11 min，95%A）；柱溫為27 ℃；檢測波長為270 nm；流速為0.2 mL·min-1；樣品室溫度為10 ℃；進樣量為1.0 μL，理論板數按燈心草酚計算應不低于3000[13-14]。

2.2.2 對照品溶液制備 同2.1.2 項下方法，UPLC結果見圖6。

圖6 厄弗酚、去氫厄弗酚、燈心草酚混合對照品UPLC圖

2.2.3 供試品溶液制備 同2.1.3 項下方法，UPLC結果見圖7。

圖7 燈心草飲片UPLC圖

2.2.4 線性關系考察 精密量取2.1.2 項下混合對照品溶液，分別以不同體積分數的甲醇稀釋，得一系列混合對照品溶液。按照2.2.1 項下的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y），以對照品的進樣量為橫坐標（X），計算得回歸方程，見表5。

表5 燈心草3個菲類成分的線性關系考察結果

2.2.5 精密度試驗 取2.1.2項下混合對照品溶液，按照2.2.1項下的色譜條件測定，連續進樣6次，測定去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚對照品的峰面積RSD 分別為0.02%、0.01%、0.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取2.1.3 項下供試品溶液（S10），按照2.2.1項下的色譜條件測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚峰面積RSD 分別為0.05%、0.08%、0.03%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取供試品（S10）粉末0.3 g，共6份，精密稱定，按2.1.3項下的方法制成供試品溶液，按照2.2.1 項下的色譜條件測定，分別進樣，測定去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚含量的RSD分別為0.08%、0.03%、0.09%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取供試品（S10）粉末，精密稱定，分別加入一定量的對照品粉末，按2.1.3 項下的方法制成供試品溶液，按2.2.1 項下的色譜條件測定，計算回收率。結果去氫厄弗酚的平均回收率為98.67%，RSD 為0.83%，厄弗酚的平均回收率為98.95%，RSD 為0.42%，燈心草酚的平均回收率為98.74%，RSD 為0.90%，回收率均為95%～105%。

2.2.9 10批次燈心草中3個菲類成分含量測定 取不同產地的10 批燈心草飲片（S1～S10），按2.1.3項下方法制成供試品溶液，按2.1.1 項下的色譜條件測定，根據線性回歸方程計算含量及3 個菲類成分的總含量[15]，并對結果降序排列，結果見表6。

表6 不同產地的燈心草3個菲類成分質量分數

3 討論與結論

中藥指紋圖譜技術作為一種質量檢測手段，可有效反映色譜峰信息量較大的中藥質量。本研究通過建立燈心草與燈心炭對照指紋圖譜，各批次的燈心草指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.89，初步判斷，市售燈心草質量無明顯差異。藥材中化學成分種類基本一致，但含量有所不同，可能與藥材道地性有關；不同產地的氣候、土壤、溫度不同；此外采集與凈制條件的差別都有可能對藥材質量產生影響。燈心炭（T1～T10）與對照圖譜的相似度較高，則說明燈心炭煅制工藝穩定，與燈心草（S1～S10）相似度相比均存在不同程度下降，差值依次分別為0.090、0.075、0.101、0.024、0.032、0.034、0.029、0.060、0.097、0.095，說明在煅炭過程中化學成分發生量變，且與生品飲片原產地有關。

本研究建立的CA、PCA方法均能夠很好地將燈心草與燈心炭樣品區分開來。CA結果表明，燈心草生品和炭品各自聚為一類，說明燈心草和燈心炭在化學成分含量上差異較大，可初步證實炮制對化學成分的影響，PCA 篩選得到影響樣品分類的4 個主因子，能夠揭示燈心草在炮制過程中大多數的變異信息，燈心草和燈心炭的主成分空間分布有各自特定的區域，CA 和PCA 都可將炮制前后樣品進行區分，表明燈心草與燈心炭存在差異。

指紋圖譜比較發現，燈心炭與燈心草相比，新增8 個峰，缺失5 個峰，其中峰11 為厄弗酚。一些成分的量發生了明顯的變化，如圖2 中峰12、峰13的含量顯著降低，分別為去氫厄弗酚、燈心草酚，推測可能是在高溫煅制過程中，分子內的酚羥基進攻分子內或分子間芐位的碳碳雙鍵，發生加成反應，導致成分含量降低，目前不能確定新增峰所對應的具體成分，推測新增成分可能為含量降低的成分在高溫缺氧條件下反應所得產物。

目前，對中藥燈心草的指紋圖譜研究中，多以燈心草為研究對象，暫沒有對燈心炭指紋圖譜的研究。本研究建立的燈心草及燈心炭UPLC 指紋圖譜，能真實反映燈心草飲片炮制前后差異，相對于目前燈心草HPLC 指紋圖譜研究更加高效、快速、靈敏，可為燈心草炮制前后化學成分比較及其臨床使用及資源開發提供參考。

煅制得到的燈心炭經UPLC 檢測，3個菲類成分含量過少，在標準曲線定量限外無法積分，故未標注燈心炭中3 個菲類成分含量。本課題組將會在后續研究中尋找生品與炭品所共有、均能用同種方法檢測到、能夠區分生品與炭品、能夠指導藥材質量判別的成分或其他指標。