補肺活血膠囊UPLC指紋圖譜建立及質(zhì)量評價△

任慧，郭盛*，許小雪，張祎盈，李全，王恒斌，耿婉麗，尚爾鑫，錢大瑋*，段金廒

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；

2.雷允上藥業(yè)集團有限公司，江蘇 蘇州 215003；

3.廣東雷允上藥業(yè)有限公司，廣東 云浮 527300

補肺活血膠囊收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版，具有益氣活血、補肺固腎功效，用于肺心病（緩解期）屬氣虛血瘀癥的治療[1]。藥理研究顯示，補肺活血膠囊可有效改善肺通氣功能[2-3]，緩解由慢性阻塞性肺疾病（COPD）所致的咳喘胸悶、心悸氣短等癥狀。近期研究表明，補肺活血膠囊可用于新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者康復(fù)期治療，可促進COVID-19康復(fù)期患者肺部病灶的吸收，防止肺部感染的惡化，同時增加康復(fù)期患者運動耐量，提高機體健康水平[4-6]。目前，補肺活血膠囊已列入《中成藥防治新型冠狀病毒肺炎專家共識》，并受到世界衛(wèi)生組織（WHO）的關(guān)注。

補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂3 味中藥組成，所含化學(xué)成分種類豐富[7-9]，如黃酮類、皂苷類、萜類、鞣質(zhì)類、香豆素類等，但《中國藥典》2020 年版中關(guān)于補肺活血膠囊的質(zhì)量標準僅對組方中黃芪含有的黃芪甲苷、赤芍中含有的芍藥苷、補骨脂中含有的補骨脂素及異補骨脂素作出了明確要求，指標成分較單一，無法全面評價藥品整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜是一種依賴于不同提取方法所得的活性成分半定量鑒別技術(shù)[10]，強調(diào)對圖譜共有峰的歸屬及相似度評價，可較為全面、系統(tǒng)地評價中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性。為了更好地評價補肺活血膠囊的整體質(zhì)量，本研究在相關(guān)研究基礎(chǔ)上[11-12]，采用超高效液相色譜法（UPLC）優(yōu)化建立了補肺活血膠囊指紋圖譜，縮短了儀器運行時間，提高了檢測效率。此外，通過UPLC 串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF-MS）對指紋圖譜中20 個共有峰進行了分析鑒定，并采用主成分分析（PCA）對20 個共有成分中批間差異較大的成分進行篩選，以期全面評價補肺活血膠囊整體質(zhì)量，為產(chǎn)品質(zhì)量均一性及臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY-UPLC 型超高效液相色譜儀、光二極管陣列檢測器（PDA）、Synapt? Q-TOF 質(zhì)譜儀［含Lock-spay 接口、電噴霧離子源（ESI）、MassLynx?型質(zhì)譜工作站，Waters公司］；Milli-Q型超純水制備儀（Millipore 公司）；KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；MS105 型、ML204 型電子分析天平（Mettler-Toledo 公司）；AnkeGL-16 GⅡ型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WH-微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.2 試藥

對照品氧化芍藥苷（批號：Z14J9S63652）、芍藥內(nèi)酯苷（批號：Y15D8H50784）、補骨脂苷（批號：Y07A7S12664）、芍藥苷（批號：X12A8C33672）、異補骨脂苷（批號：Y27A9S60238）、毛蕊異黃酮苷（批號：Y27F9H54731）、沒食子酰芍藥苷（批號：P08A10S85131）、芒柄花苷（批號：R28O8F46957）、毛蕊異黃酮（批號：Y24N9Y75652）、補骨脂素（批號：C22A9Q68562）、異補骨脂素（批號：C05M10Q82078）、苯甲酰芍藥苷（批號：P02D7F26004）、芒柄花素（批號：F27J7S18516）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；超純水為實驗室自制。

對照藥材黃芪（批號：120974-201813）、赤芍（批號：121093-201804）、補骨脂（批號：121056-201605）均購自中國食品藥品檢定研究院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心段金廒教授鑒定，均符合《中國藥典》2020 年版各項要求。11 批補肺活血膠囊均由廣東雷允上藥業(yè)有限公司提供，批號分別為012001（S1）、012007（S2）、012048（S3）、012049（S4）、012053（S5）、012054（S6）、012112（S7）、022004（S8）、022014（S9）、022102（S10）、202007（S11）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～1 min，5%A；1～5 min，5%～12%A；5～8 min，12%A；8～14 min，12%～30%A；14～17 min，30%～45%A；17～18 min，45%～85%A；18～20 min，85%A）；檢測波長為246 nm；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為4 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI，正、負離子模式下分別掃描；錐孔電壓：40 V；毛細管電壓：4 kV；脫溶劑氣溫度：400 ℃；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流量：500 L·h-1；錐孔氣流量：50 L·h-1；碰撞能量：10～40 eV；質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1000；準確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽（ESI+：m/z556.277 1,ESI-：m/z555.261 5）溶液為鎖定質(zhì)量溶液。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 稱取氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、補骨脂苷、芍藥苷、異補骨脂苷、毛蕊異黃酮苷、沒食子酰芍藥苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、補骨脂素、異補骨脂素、苯甲酰芍藥苷、芒柄花素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容，配制成一定質(zhì)量濃度的對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，以50%甲醇稀釋，定容，制成氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、補骨脂苷、芍藥苷、異補骨脂苷、毛蕊異黃酮苷、沒食子酰芍藥苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、補骨脂素、異補骨脂素、苯甲酰芍藥苷、芒柄花素質(zhì)量濃度分別為2.144、4.440、1.560、4.040、2.680、1.312、2.032、1.744、1.640、3.672、3.616、2.364、2.280 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品及單味藥溶液的制備 精密稱取補肺活血膠囊內(nèi)容物粉末0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲處理1 h（400 W，40 kHz），溫度為50 ℃，放至室溫，稱質(zhì)量，以50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取黃芪、赤芍、補骨脂單味對照藥材適量，按上述供試品溶液制備方法制備各單味藥供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取補肺活血膠囊（S1）供試品溶液連續(xù)進樣測定6 次，記錄色譜圖。其中補骨脂素出峰時間適中，與其他成分分離度良好，峰面積較大，因此選擇補骨脂素（峰14）為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別計算其RSD。結(jié)果顯示，連續(xù)進樣測定6 次各共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.08%，相對峰面積的RSD均小于1.42%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取用于精密度試驗的補肺活血膠囊供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后進樣測定，記錄色譜圖。以補骨脂素（峰14）作為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別計算其RSD。結(jié)果顯示，24 h 內(nèi)進樣分析的色譜圖各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.18%，相對峰面積RSD 均小于2.31%，表明室溫條件下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取補肺活血膠囊（S1），平行6 份，分別制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以補骨脂素（峰14）作為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別計算其RSD。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.12%，相對峰面積的RSD 均小于1.76%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 指紋圖譜建立 取11 批供試品（S1～S11），分別制備供試品溶液并進樣測定，分別記錄色譜圖，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）。截取1～20 min 色譜圖進行分析，選取S1樣品色譜圖為參照（參照圖譜生成方法：中位數(shù)法，時間窗寬度：0.2），多點校正后進行自動匹配分析，標定共有峰，計算相似度[13]。11 批補肺活血膠囊樣品的UPLC 指紋圖譜疊加圖及對照圖譜見圖1，共有20個共有峰被標定。S1～S11號樣品的指紋圖譜與對照圖譜的相似度分別為0.969、0.998、0.982、0.996、0.997、0.997、0.990、0.985、0.998、0.996、0.987，均≥0.969，表明各批次間補肺活血膠囊質(zhì)量均一穩(wěn)定。

圖1 11批補肺活血膠囊的UPLC疊加圖譜和對照指紋圖譜

2.5 共有峰的定性分析

采用UPLC-Q-TOF-MS 對11 批補肺活血膠囊中的20 個共有峰進行定性分析。取供試品溶液及混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件和2.2項下質(zhì)譜條件進行正、負離子掃描并采集數(shù)據(jù)，得到總離子流色譜圖（圖2）。由對照品保留時間和質(zhì)譜信息，結(jié)合相關(guān)文獻數(shù)據(jù)比對[14-17]，進行化學(xué)成分確認，共鑒定了其中18個共有峰的化學(xué)成分信息，其中13個成分經(jīng)對照品比對確認，另有5個成分為依據(jù)質(zhì)譜裂解信息推測，具體結(jié)果見表1。

表1 補肺活血膠囊樣品中20個共有峰UPLC-Q-TOF-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖2 補肺活血膠囊供試品溶液與混合對照品溶液UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖

2.6 共有峰的歸屬

取供試樣品、混合對照品及單味藥供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖（圖3）。根據(jù)混合對照品各色譜峰保留時間并結(jié)合紫外光譜，指認出其中13 個色譜峰，分別為氧化芍藥苷（3號峰）、芍藥內(nèi)酯苷（4號峰）、補骨脂苷（5號峰）、芍藥苷（6號峰）、異補骨脂苷（7號峰）、毛蕊異黃酮苷（10號峰）、沒食子酰芍藥苷（11號峰）、芒柄花苷（12號峰）、毛蕊異黃酮（13號峰）、補骨脂素（14號峰）、異補骨脂素（15號峰）、苯甲酰芍藥苷（16號峰）、芒柄花素（18號峰）。將供試品溶液、混合對照品溶液、黃芪單味藥材溶液、赤芍單味藥材溶液及補骨脂單味藥材溶液色譜圖比對分析，結(jié)果顯示峰10、12、13、18 歸屬于黃芪藥材，峰1、3、4、6、9、11、16 歸屬于赤芍藥材，峰2、5、7、8、14、15、17、19、20 歸屬于補骨脂藥材。

圖3 補肺活血膠囊供試品溶液、混合對照品溶液及各單味藥材溶液的UPLC圖

2.7 PCA

補肺活血膠囊指紋圖譜相似度結(jié)果表明，11批樣品相似度較高、質(zhì)量均一性較好，但不同批次間成分峰面積仍存在差異。為進一步分析造成這種偏差的原因，本研究采用SIMCA 14.1 軟件，以20 個共有峰峰面積為變量進行PCA 及樣品和變量載荷圖繪制（圖4）。結(jié)果顯示，2 個主成分方差貢獻率分別為74.4%、14.2%，累積方差貢獻率達88.6%，提示其可較好地代表補肺活血膠囊的成分信息和特征。圖4A 顯示，11 批樣品雖均位于95%置信區(qū)間內(nèi)，但在橫坐標（主成分1）方向批間離散程度較大。圖4B顯示，補骨脂苷（5號峰）、異補骨脂苷（7號峰）在主成分1上偏離程度較大，沒食子酸（1號峰）、芍藥內(nèi)酯苷（4號峰）、芍藥苷（6號峰）、鞣花酸（9號峰）、補骨脂素（14號峰）及異補骨脂素（15號峰）在主成分2上差別較大，提示上述8個成分對批間差異影響較大，其中尤以補骨脂苷（5號峰）和異補骨脂苷（7號峰）差異貢獻較大，提示其為影響補肺活血膠囊批間質(zhì)量均一性的主要指標成分。

圖4 11批補肺活血膠囊的PCA得分圖與變量載荷圖

3 討論

中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量均一、穩(wěn)定，是保證其臨床安全有效的前提。但由于多數(shù)中藥復(fù)方制劑組方藥味多樣、所含成分類型復(fù)雜，目前質(zhì)量控制標準中僅針對其含量較高的組分進行質(zhì)量均一性控制已很難滿足臨床需求。針對該問題，已有報道建議增加補肺活血膠囊質(zhì)量控制成分數(shù)量。例如，唐清等[11]采用HPLC 建立了補肺活血膠囊指紋圖譜，液相運行時間為65 min，確定了12 個共有峰，指認了8個成分；舒婷等[12]同樣采用HPLC建立了補肺活血膠囊指紋圖譜，液相運行時間為60 min，確定了18個共有峰，并對其中5 個共有成分進行了含量測定。但上述方法均存在運行耗時長、標定共有峰數(shù)量有限、未分析影響其均一性的關(guān)鍵組分等不足。因此，有必要在前人工作的基礎(chǔ)上優(yōu)化建立用于補肺活血膠囊質(zhì)量控制的快速分析方法，并篩選發(fā)現(xiàn)影響批間質(zhì)量均一穩(wěn)定的關(guān)鍵化學(xué)組分，以提高其臨床用藥的安全性與有效性。

在建立補肺活血膠囊指紋圖譜過程中，本研究首先考察了提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、50%乙醇）、提取方式（回流、超聲）、提取時間（20、40、60、80 min）對補肺活血膠囊成分提取轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果表明，甲醇提取效果優(yōu)于乙醇，以50%甲醇作為提取溶劑時，色譜峰數(shù)量較多。回流提取與超聲提取對成分提取的差異影響較小，超聲提取時間在60 min 時最優(yōu)，故本研究最終選擇50%甲醇超聲提取60 min 為供試樣品溶液的制備方法。

中藥復(fù)方制劑成分繁雜，各類型化合物紫外吸收波長差異較大，本研究通過PDA 全波段（190～400 nm）掃描，比較不同波長下，各色譜峰形情況，結(jié)果顯示，檢測波長為246 nm 時，補肺活血膠囊各色譜峰峰形較好、基線平穩(wěn)、相鄰色譜峰分離度較高，多數(shù)成分色譜信息得以體現(xiàn)。雖黃芪中黃芪甲苷等皂苷類成分存在末端吸收難以檢測到的問題，但其黃酮類成分毛蕊異黃酮、芒柄花素等色譜信息均可體現(xiàn)，故本研究選用246 nm 作為補肺活血膠囊指紋圖譜檢測波長。

本研究采用UPLC 建立了20 min 分離時間內(nèi)含有20 個共有峰的指紋圖譜分析方法，可在較短時間內(nèi)較為全面地反映補肺活血膠囊中化學(xué)成分信息，且11 批供試樣品指紋圖譜相似度較高，表明其可用于該廠家生產(chǎn)的補肺活血膠囊產(chǎn)品的質(zhì)量控制。PCA 顯示，補骨脂苷和異補骨脂苷為影響補肺活血膠囊批間質(zhì)量均一性的潛在化學(xué)成分。因此，建議在本研究所建立的指紋圖譜分析方法的基礎(chǔ)上，可增加上述香豆素類化學(xué)組分的含量測定，共同用于補肺活血膠囊的質(zhì)量均一性控制，以保證其臨床應(yīng)用的安全性和有效性。