Notch信號通路在骨肉瘤增殖、耐藥、上皮-間質轉化中的作用機制

侯偉巖，曹云鵬， 孔令偉，紀海茹

骨肉瘤是一種原發性惡性腫瘤，發病率高、增長幅度快，多見于兒童和青少年。骨肉瘤好發于血運豐富、生長迅速的骨骺區[1]。原發性骨肉瘤早期易發生血行轉移[2]，肺是其最常見的轉移器官[3]。目前，綜合治療模式雖然使患者生存率有了一定的提高，而早期肺轉移依然導致患者預后較差。

Notch信號通路高度保守，在腫瘤的發生、發展中起關鍵作用，參與腫瘤的增殖、浸潤轉移、血管生成、多藥耐藥等多種生物學行為，且調控機制較為復雜。其與腫瘤發生、發展的關系已成為近期研究的熱點，深入剖析Notch信號通路在骨肉瘤中的作用機制，可給予其臨床治療方式的研究以新啟發。本文現對Notch信號通路與骨肉瘤的關系作一綜述。

1 Notch信號通路

Notch基因最早于1919年被提出，而Notch信號通路與骨肉瘤的研究始于2004年[4]，其與其他腫瘤細胞信號通路的不同之處在于具有抑癌和(或)致癌的雙重性，具體表現由Notch通路的強度、表達時機及細胞種類的不同來決定[5]。Notch信號通路包括4個受體(Notch1/2/3/4)、5個配體(DLL1/3/4、JAG1/2)和細胞內效應分子[6]。Notch信號通路激活以其受體與鄰近細胞上所表達的同源配體結合為起始，通過兩次蛋白酶水解切割后形成Notch細胞內結構域NICD。NICD由細胞質膜釋放并轉移到細胞核，在核內與RBPJ結合，達到使下游轉錄因子活化表達的目的[7]。

2 Notch信號通路與骨肉瘤細胞增殖

Notch信號通路可促進骨肉瘤細胞增殖，當Notch信號通路被阻斷時可使骨肉瘤細胞的增殖受到抑制。在體外實驗中，Engin等[8]通過對3例經治療和7例未經任何治療處理的骨肉瘤患者活檢標本進行檢測對比后，發現受體Notch1、配體Jagged1、靶基因Hes1、Hey2的表達均較野生型成骨細胞明顯增加，且在經DAPT阻斷Notch信號通路后，骨肉瘤細胞增殖均受抑制；在體內實驗中，Qin等[9]通過構造骨肉瘤K7M2細胞系的小鼠脛旁腫瘤模型和肺轉移模型，進一步證明DAPT可通過抑制Notch激活來抑制Erk通路磷酸化，以有效抑制腫瘤生長、血管生成和肺轉移，進而提高患者生存率；Li等[10-11]通過對二烯丙基三硫化物(DATS)和姜黃素在骨肉瘤中的作用進行深入探究，發現大部分骨肉瘤細胞系中均有Notch1/2/3基因信號存在，且在Notch1與下游基因表達下調時，骨肉瘤細胞的增殖和轉移被抑制。

2.1 γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路與骨肉瘤細胞增殖Notch信號通路的激活需要經過3次酶切過程，第3次酶切過程位于S3酶切位點，由Notch通路中的關鍵酶γ-分泌酶進行[12]，而γ-分泌酶抑制劑(GSI)可阻止該酶合成，從而使Notch通路不被激活。DAPT作為一種常見的人工合成GSI，對γ-分泌酶的阻斷作用具有特異性，可以阻止Notch信號通路的激活[13]。

游浩等[14]用不同濃度DAPT處理體外培養的MG-63骨肉瘤細胞，發現當Notch信號被阻斷時MG-63細胞增殖受限，并呈劑量、時間依賴性；實驗還發現，Notch1及其下游靶基因HES1的表達均下調，提示DAPT抑制MG-63細胞的增殖可能與Notch1、HES1下調有關。

2.2 Notch配體Jagged1與骨肉瘤細胞增殖腫瘤細胞的異常增殖與其細胞周期調控紊亂密切相關，Notch信號通路參與多種腫瘤的細胞周期調控，Jagged1作為Notch的重要配體，是Notch信號通路激活不可或缺的部分，其與Notch1受體的結合可促進Notch信號通路的激活，在腫瘤細胞周期調控過程中發揮重要作用[15]。Chen等[16]發現高表達lncRNA MEG3的骨肉瘤細胞可顯著降低Jagged1與Notch1的表達水平，細胞增殖受限。Lu等[17]發現miR-26a可直接抑制Jagged1配體，進而減少Notch信號通路激活來抵抗骨肉瘤的增殖。

3 Notch信號通路與骨肉瘤多藥耐藥

多藥耐藥是導致腫瘤化療失敗的主要原因，可能的機制包括腫瘤干細胞存活、藥物外排增加、藥物靶標突變、DNA損傷修復、替代信號激活及細胞凋亡逃逸等[18]。Notch信號通路可通過減少細胞內藥物積累、調控上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、導致microRNA失調和細胞凋亡基因的紊亂、調節腫瘤干細胞等方面，影響腫瘤的耐藥性[19]。以Notch信號通路為中心開展對骨肉瘤多藥耐藥的研究，探尋逆轉耐藥治療的手段，增強骨肉瘤對化療藥物的敏感性，對提高骨肉瘤患者的生存率具有重要的臨床意義。

3.1 骨肉瘤順鉑耐藥與Notch信號通路順鉑作為經典鉑類藥物，最早于1970年引入骨肉瘤治療中，并已成為多種惡性腫瘤的一線化療藥物，其抑制腫瘤生長與Notch信號通路有關。劉蓋為等[20]用不同濃度的順鉑(2、4、6、8、10 μmol/L)處理骨肉瘤143B細胞(1、2、3、4、5天)后，發現低濃度順鉑(≤4 μmol/L)處理48 h后會激活Notch信號通路，而高濃度順鉑(≥6 μmol/L且<8 μmol/L)處理48 h后會通過抑制Notch信號通路來抑制骨肉瘤生長，由此可見，順鉑對Notch信號通路的影響呈劑量和時間依賴性。也有研究證明，Notch目的基因的表達與化療敏感性呈負相關，即上調Notch信號通路可增強癌細胞的耐藥性[21]，因此可在適當范圍內提高化療藥物的濃度來降低骨肉瘤細胞的耐藥性，起到更有效的治療效果。

骨肉瘤順鉑耐藥并非一成不變，其耐藥狀態可逆，給予骨肉瘤順鉑耐藥細胞一個“藥物假期”，即停止用藥一段時間后發現Notch通路等因子的表達水平較骨肉瘤順鉑耐藥組明顯下降，說明藥物中斷可使骨肉瘤順鉑耐藥細胞再敏化，提示可通過間歇化療保證骨肉瘤細胞對順鉑等化療藥物的敏感性[22]。

3.2 骨肉瘤干細胞阿霉素耐藥與Notch信號通路阿霉素作為一種有效的一線抗腫瘤藥物，對實體腫瘤有著廣泛的活性譜[23]。阿霉素耐藥也是影響骨肉瘤療效及預后的重要因素。余玲等[24]證實骨肉瘤細胞具有阿霉素耐藥性，化療可富集骨肉瘤干細胞，他們發現耐阿霉素骨肉瘤干細胞中Notch受體胞內段NICD1及靶基因表達量上調，說明Notch通路可富集阿霉素誘導的骨肉瘤干細胞；Notch通路被阻斷后，骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性提高，提示可通過抑制Notch通路提高阿霉素靶向殺傷骨肉瘤細胞的能力。

張義等[25]證實，沉默MG-63阿霉素耐藥株中lncRNA FOXC2-AS1的表達可阻斷Notch1通路的激活，提高對阿霉素的敏感性，逆轉骨肉瘤細胞對阿霉素的耐藥。

3.3 骨肉瘤乏氧與Notch信號通路乏氧微環境是腫瘤耐藥的重要因素，順鉑等臨床常用化療藥物在乏氧狀態下MG-63骨肉瘤細胞的半數抑制濃度IC50顯著高于常氧狀態[26]。乏氧與Notch信號通路存在相互作用關系，乏氧狀態下Notch-ICN、MRP1等蛋白的表達水平均較常氧狀態下顯著升高，表明MG-63細胞內Notch信號通路被激活，利用siRNA干擾乏氧狀態下的Notch1后，MG-63細胞耐藥性明顯下降[27]。王淼等[28]發現，乏氧微環境與常氧環境相比，可明顯促進MG-63細胞的增殖、轉移與Notch信號通路相關蛋白HIF-1α、Notch1、Hes-1的表達；而在乏氧狀態下加入Notch1通路抑制劑DAPT后，MG-63細胞株的增殖與侵襲能力均較單獨乏氧條件下得到有效抑制，因此通過阻斷Notch1表達可改善骨肉瘤細胞在乏氧狀態下的多藥耐藥。

3.4 骨肉瘤內耐藥因子與Notch信號通路減少細胞內的藥物積累是調節腫瘤耐藥的一條重要途徑，ATP-結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette, ABC)介導的藥物外排與骨肉瘤多藥耐藥相關，MDR相關蛋白-1(MDR related protein-1, MRP1)(又名ABCC1)是ABC的主要靶點[29]。ABCC1高表達的骨肉瘤耐藥細胞內NICD和PSEN1(一種γ-分泌酶的催化劑，參與細胞內Notch1蛋白的合成)的表達顯著增加，Notch通路激活后，可促使NICD/CBF1復合物形成，進而降低ABCC1表達，從而使骨肉瘤細胞的藥敏性增強[30]。這也證明了上文中所提到的Notch1在乏氧狀態下參與骨肉瘤的多藥耐藥，其發生機制可能與MRP1等蛋白的表達水平提高有關的結論。

BCL蛋白家族由促凋亡蛋白(Bax、Bak和Bad)和抗凋亡蛋白(BCL-2和BCL-xL)組成，具有調節細胞周期的作用。通過慢病毒體外敲除BCL-2基因可顯著增強骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性；反之，敲除Bax基因可降低骨肉瘤細胞的化療敏感性[31]。吳德明等[32]通過用mNotch-1 shRNA干擾骨肉瘤細胞后，可有效地使BCL-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，從而誘導骨肉瘤細胞的凋亡。Ye等[33]通過在其他腫瘤中沉默Notch1表達也得到了相似結果，并證實了Notch信號通路與BCL-2和Bax共同參與腫瘤化療敏感性的調節。

p53是目前被研究最為透徹的抑癌基因，被認為是細胞基因組的看家基因，與生長停滯、衰老、細胞凋亡和DNA修復等多種生物學行為關系密切。先天性p53基因失活所引起的Li-Fraumeni綜合征患者的骨肉瘤發病風險要遠比p53基因正常人群高[34]。突變型p53基因可通過上調促凋亡基因p21和Bax增加骨肉瘤耐藥細胞對化療藥物的敏感性[35]。p53基因靶向激活Notch1信號通路，進而通過Notch/Hes相關阻遏蛋白轉錄途徑抑制促凋亡基因叉頭框蛋白O3(forkheadbox O3, FOXO3)，抵抗由順鉑誘導的DNA損傷，抑制腫瘤細胞凋亡[36]，從而產生多藥耐藥。

4 Notch信號通路與EMT

癌癥致死的重要原因是腫瘤轉移，而EMT是腫瘤侵襲轉移的關鍵過程，EMT可使上皮細胞失去極性成為間充質細胞，獲得遷移能力，侵襲周圍組織。E-鈣黏蛋白屬于細胞間的黏附因子，參與EMT的產生，該蛋白表達水平的下調會使細胞間黏附能力降低，促進細胞轉移[37]。有研究證明，在眾多腫瘤的早期轉移中，EMT發揮重要作用，提示可研究如何抑制腫瘤細胞的EMT，起到抑制腫瘤轉移的作用，以提高癌癥患者的生存率。

Su等[38]通過小干擾敲低ATG4A在骨肉瘤中的表達水平，發現Notch1、Hes1表達均下調，E-鈣黏蛋白表達上調，證明了ATG4A可通過激活Notch信號通路促進骨肉瘤的EMT。

誘導啟動EMT的方式有多種，如乏氧可通過活化Notch通路的方式來促進EMT、Notch配體與受體的結合激活Notch通路產生EMT、Notch1受體高表達誘導EMT的發生等。陳敬騰等[39]在體內外實驗中敲除轉錄因子Slug后，可逆轉Notch通路誘導的EMT，進而減弱骨肉瘤的轉移侵襲能力。

5 結語

Notch信號通路在胚胎發育、穩態維持、機體免疫調控及腫瘤等疾病的誘發產生過程中發揮著不可或缺的重要作用。在Notch信號通路對治療惡性腫瘤所具有的廣闊前景下，Notch信號通路已成為研究熱點。但有文獻報道[40]，在哺乳動物某些細胞中存在與RBPJ無關的信號，可使NICD與細胞質蛋白或核轉錄因子直接相互作用，這種Notch非典型信號通路在骨肉瘤中的作用研究甚少，可能會成為未來的一個研究方向。在對Notch信號通路與骨肉瘤的關系研究中，不同學者仍持有不同觀點，但我們堅信隨著對Notch信號通路研究的不斷深入，其具體作用機制將會被闡明，為Notch通路在骨肉瘤的臨床診療及預后提供理論依據。