抗冠狀病毒藥物研究進展

秦聖樂王玉濤蔡雪君王新華楊子峰

(廣州醫科大學附屬第一醫院,廣州呼吸健康研究院,呼吸疾病國家重點實驗室,廣州 510182)

新冠疫情已在世界范圍大流行,死亡人數超過520 萬, SevereAcuteRespiratorySyndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2)是一種新型的人類感染性β 冠狀病毒[1]。 迄今為止,已發現7 種冠狀病毒可引起人類呼吸道疾病。 冠狀病毒是有包膜、單股正鏈Ribonucleic Acid(RNA)病毒,分為α、β、γ、δ 4 個屬,其中α、β 冠狀病毒屬與人類疾病有關。 目前引起人類呼吸道疾病的冠狀病毒Human coronavirus 229E(HCoV-229E)、Human coronavirus NL63(HCoVNL63)屬于α 屬,Human coronavirus OC43(HCoVOC43)、Human coronavirus HKU-1(HCoV-HKU-1)、SARS-CoV、 MiddleEastrespiratorysyndrome coronavirus (MERS-CoV)、SARS-CoV-2 屬于β 屬。HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU-1冠狀病毒可引起輕度呼吸道疾病,在免疫力低下人群中,還會引起肺炎和下呼吸道疾病[2]。 SARSCoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 病毒有高變異性和傳染性,可引起嚴重急性呼吸道綜合征。 由于RNA 病毒的高變異性,使得藥物研究困難重重。 本文對以冠狀病毒刺突蛋白,RNA 依賴性RNA 聚合酶,3C樣蛋白酶以及抗冠狀病毒中藥的體內研究現狀進行綜述,為抗冠狀病毒藥物研究提供理論依據。

1 冠狀病毒復制周期

吸附與進入:冠狀病毒是有包膜、單股正鏈RNA 病毒。 病毒的膜表面有3 種蛋白,分別是刺突蛋(spike protein,S 蛋白)、包膜蛋白(envelope protein, E 蛋白)、膜蛋白(membrane protein,M 蛋白),其中S 蛋白是病毒入侵宿主細胞的關鍵[3]。病毒進入人體后,其S 蛋白被宿主蛋白酶切割成S1和S2 兩個亞基,S1 亞基的受體結合區域與受體結合,病毒黏附在宿主細胞表面,S2 構象發生改變。病毒進入細胞包括膜融合和內吞兩種方式,S2 的兩個串聯域七肽重復序列1(heptad repeat domains 1,HR1)和七肽重復序列2(heptad repeat domains,HR2),介導病毒與細胞之間膜融合途徑,使病毒進入宿主細胞[4],如MERS-CoV 病毒[5];此外,低pH值和pH 依賴性的內質體半胱氨酸蛋白酶等組織蛋白酶協助冠狀病毒由內吞途徑進入宿主細胞,如SARS-CoV 和SARS-CoV-2 病毒[6-7]。

復制與轉錄:病毒基因組的復制和轉錄主要是由病毒的復制酶介導。 病毒進入宿主細胞并脫殼,病毒基因組RNA 釋放到細胞質中后,Open Reading Frame 1a (ORF 1a)、 ORF 1b 翻譯多聚蛋白(polyprotein,pp)pp1a 和pp1ab,pp1a 和pp1ab 隨后被木瓜蛋白酶樣蛋白酶(papain-like protease,PLpro)和3C 樣蛋白酶(chymotrypsin-like protease,3CLpro) 切割, 產生 15 ～ 16 個非結構蛋白(nonstructure protein,NSPs),NSPs 組裝成復制-轉錄復合物(replicase-transcriptase complex,RTC),負責病毒 RNA 的復制和多個亞基因組 RNA(subgenomic RNAs,sgRNAs)的轉錄。 冠狀病毒復制以其正鏈RNA 為模板,通過RNA 依賴性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)生成全長的反義負鏈模板,用于合成新的基因組RNA 和重疊的亞基因組負鏈模板。

蛋白翻譯:亞基因組mRNAs 的翻譯產生病毒的結構蛋白和輔助蛋白,如刺突蛋白(S)、核衣殼磷酸蛋白(N)、血凝素-酯酶糖蛋白(HE)、膜糖蛋白(M)、外膜蛋白(E)在內質網進行翻譯,并轉運至高爾基體[8]。

組裝與釋放:病毒顆粒組裝過程主要是在內質網-高爾基體中間體中發生,N 蛋白與新生的基因組RNA 在胞漿內組成螺旋核衣殼,核衣殼首先與M蛋白結合,E 蛋白與M 蛋白相互作用引發芽生,包裝核衣殼。 S 蛋白與HE 蛋白在翻譯時形成三聚體,包裝到成熟的病毒顆粒,最后通過胞吐釋放到胞外。

2 基于病毒蛋白靶點的抗冠狀病毒藥物

病毒復制周期中的酶和蛋白都是抗冠狀病毒藥物潛在的作用靶點,目前對于抗冠狀病毒藥物的研究熱點主要集中在S 蛋白、 RdRp、 3CLpro、PLpro 等。

2.1 靶向于病毒刺突(S)蛋白

刺突(S)蛋白屬于病毒的結構蛋白,成熟的S蛋白為穩定的三聚體,具有受體及膜融合活性,S1和S2 之間存在蛋白酶的裂解位點,S 蛋白的裂解活化是病毒入侵宿主細胞的關鍵[3]。 S 蛋白上的受體結合域(receptor-bindingdomain,RBD)與細胞表面受體結合,使病毒黏附于細胞表面,不同的冠狀病毒其受體不同,親和力也有區別,MERS-CoV 以人細胞表面蛋白二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP4)作為進入受體,而SARS-CoV-2 和SARS-CoV以血管緊張素轉化酶II(angiotensin-converting 2,ACE2)作為受體,由于SARS-CoV-2 的S 蛋白與ACE2 受體親和力比SARS-CoV 高20 倍,導致該病毒在人類中的傳播速度更快[9]。

SARS-CoV-2 不僅需要ACE2 作為進入受體,還須同時結合位于細胞表面上的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)才能進入宿主細胞,肝素結構上類似于HS,可結合并誘導SARS-CoV-2 S 蛋白受體結合域構象變化,抑制SARS-CoV-2 對Vero 細胞的感染[10],此外,肝素是一種硫酸多糖,有研究證實海參硫酸多糖(SCSP)可能通過抑制HS 和S 蛋白結合,阻止SARS-CoV-2 進入宿主細胞[11]。

部分藥物可通過直接與病毒S 蛋白結合,如單克隆抗體7D10 與MERS-CoV S 蛋白的N 端結構域(amino terminal domain,NTD)結合,與DPP4 競爭性結合病毒S 蛋白,抑制了S 蛋白融合前到融合后的構象變化,從而阻止MERS-CoV 進入宿主細胞[12]。或通過其他方式作用于S 蛋白,如重組蛋白Griffithsin 與SARS-CoV 的S 蛋白存在多個具有高親和力結合位點,但其并不抑制S 蛋白與ACE2 結合,研究表明Griffithsin 在體外可預防SARS-CoV 感染,預處理可預防小鼠致命性的肺部感染,減輕小鼠肺部病理改變,降低小鼠肺部炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、G-CSF、MCP-1、和IL-12 的表達[13]。 化合物陽離子改性殼聚糖N-(2-羥丙基)-3-三甲基銨殼聚糖氯(HTCC)通過與病毒S 蛋白之間的靜電相互作用,有效地阻斷了MERS-CoV 和SARS-CoV-2 進入宿主細胞,且通過微調HTCC 可以靶向其他冠狀病毒,但目前該化合物尚未用于人類,需要進一步深入研究[14]。

冠狀病毒S 蛋白與受體結合后,通過破壞融合前S 蛋白三聚體的穩定性,引起S1 亞基脫落并從S2 亞基過渡到穩定的融合后構象,Arbidol 就通過阻斷SARS-CoV-2 刺突蛋白的三聚反應,從而抑制病毒的感染性[15],但其有效性和安全性需要進一步的臨床研究。

S2 的兩個串聯域七肽重復序列1(HR1)和七肽重復序列2(HR2)可形成一個6-HB 的螺旋結構,協助SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 與細胞之間膜融合途徑[4,16],SARS-CoV-2 的HR1 比SARSCoV 具有更高的螺旋度和熱穩定性,與對應的HR2親和性也更強[17],丹參的親水化合物丹參酚酸C,通過結合SARS-CoV-2 的HR1 區域中處于融合中間狀態的保守疏水囊,阻斷HR1 和HR2 之間6-HB 的形成,從而抑制SARS-CoV-2 感染[18]。 通過SARSCoV-2 蛋白HRC 結構域設計出的SARS-CoV-2 HRC脂肽,可通過抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERSCoV 的S 蛋白介導的細胞膜融合,從而有效地抑制病毒感染[19]。

Furin 裂解位點在S 蛋白融合活性中至關重要,有助于病毒合胞體形成, 其抑制劑 CMK 和Naphthofluorescein 在體外可抑制SARS-CoV-2 的復制,該類抑制劑可作為先導化合物,進一步開發為抗病毒藥物[20],此外,組織蛋白酶L(CTSL)切割SARS-CoV-2 刺突蛋白,協助病毒進入宿主細胞,有研究表明COVID-19 患者的組織蛋白酶L(CTSL)水平升高,且與疾病的嚴重程度呈正相關,因此組織蛋白酶L(CTSL)有望開發成為抗SARS-CoV-2 病毒藥物的靶標[21]。

2.2 靶向于RNA 依賴性RNA 聚合酶

RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp,Nsp12)是冠狀病毒RTC 的重要組成部分,冠狀病毒在復制過程需自身編碼的RdRp 參與,主要負責病毒復制過程中鏈引發和鏈延伸兩個階段,是研究抗冠狀病毒的主要靶標[22]。

瑞德西韋(remdesivir)是一種新型核苷類似物,靶向于RdRp,通過摻入到RNA 復制過程中,添加3個核苷酸從而誘導RdRp 遇到易位屏障,終止鏈延伸,抑制病毒復制[23],因此瑞德西韋也具有廣譜性,對SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 均有抗病毒活性[24],臨床上瑞德西韋副作用小,多用于治療呼吸道病毒感染,但對于COVID-19 重癥患者沒有顯著的臨床和抗病毒效果[25]。 蘇拉明(suramin)在酶水平上,是瑞德西韋的三磷酸活性形式的20 倍以上,通過與RdRp 活性位點結合,抑制病毒RNA 模板與引物和底物結合,同時抑制了RdRp 聚合酶活性[26]。 而利托那韋可與SARS-CoV-2 RdRp 蛋白結合,可能通過抑制RdRp 蛋白3’到5’外切酶活性,可提高藥物治療COVID-19[27]。 利巴韋林多被用于治療由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的呼吸道相關疾病,其在宿主細胞內磷酸化后,可能通過競爭性地抑制病毒的三磷酸鳥苷合成,或是抑制病毒mRNA 合成和抑制RdRp 實現抗病毒作用[28],有研究提出干擾素-α2b 和利巴韋林聯合使用可有效減少MERS-CoV、SARS-CoV 的體外復制[29],且能改善被MERS-CoV 感染后恒河猴體內病毒載量和肺組織病理變化[30],對于嚴重的MERS-CoV 感染患者,干擾素-α2b 和利巴韋林聯合治療可改善14 d 生存率[31]。

2.3 靶向于3C 樣蛋白酶

3C 樣蛋白酶(3CLpro, Nsp5)負責切割病毒基因組翻譯的蛋白前體,是冠狀病毒復制的重要酶。3CLpro 在β 屬冠狀病毒中保守性較高[32],其相關的抑制劑對于MERS-CoV、SARS-CoV 和SARS-CoV-2 有廣泛的抗病毒活性[33]。

目前有許多化合物通過靶向3CLpro 顯示抗病毒活性,如吲哚-氯吡啉基酯衍生物GRL-0820 和GRL-0920 可與SARS-CoV-2 的3CLpro 共價結合,在體外具有抑制SARS-CoV-2 作用。 GRL-0820 吲哚氮上有一個額外的丙烯取代基,相比之下GRL-0920對SARS-CoV-2 具有更強的抗病毒活性[34]。 針對3CLpro 設計出的TG-0205221 能夠減少SARS-CoV和HCoV-229E 病毒滴度,顯示出一定的抗病毒活性[35]。 GC-376 和鈣蛋白酶抑制劑II、XII 則具有雙重作用機制,在Vero 細胞中同時抑制病毒3CLpro和宿主組織蛋白酶L 的活性,對SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV 以及HCoV-229E、OC43 和NL63 均有抗病毒活性[36]。 阿扎那韋與3CLpro 氫鍵結合,可抑制SARS-CoV-2 的3CLpro 酶活性,與利托那韋聯用還可以下調病毒誘導的IL-6 和TNF-α水平[37]。 洛匹那韋是HIV-1 蛋白酶抑制劑,常與利托那韋聯合使用提高血藥濃度,其靶向于3CLpro,對冠狀病毒有一定的抗病毒活性,預防性給予洛匹那韋/利托那韋可降低MERS-CoV 在小鼠體內病毒載量,治療性使用可改善肺功能,但不減少病毒復制和嚴重的肺病理改變[38],早期的洛匹那韋/利托那韋治療可縮短SARS-CoV-2 病毒在病人體內的排毒時間[39]。

通過體外分子篩查,篩選出槲皮素有望成為靶向于3Clpro 的抗SARS-CoV-2 候選藥物[40]。 肉桂硫胺可能通過抑制3Clpro 來抑制SARS-CoV 復制[41]。 表沒食子兒茶素- 3 - 沒食子酸酯( epigallocatechin-3-gallate, EGCG ) 和 Nsubstited Isatin 可抑制3Clpro,具有作為抗冠狀病毒藥物的潛力[32,42]。 中藥雙黃連制劑靶向于SARS-CoV-2 3Clpro,抑制病毒在VERO-E6 細胞中復制,成劑量依賴關系,其活性成分黃芩苷和黃芩素在體外也顯示較好抗病毒活性[43]。

3 抗冠狀病毒中藥的體內研究

傳統中藥在我國已廣泛使用,其成本低,療效好,能有效緩解癥狀,減少從輕度到中度或重度的發展,改善治愈率,降低死亡率,促進患者的康復等。 新冠病毒流行期間,以“三藥三方”為代表的中藥在新冠病毒的防治方面發揮了重大作用[44],基于中藥多成分、多靶點、多通路的特點,因此體內模型驗證其有效性具有重要意義,由于冠狀病毒受體限制,因此中藥抗冠狀病毒的動物模型評價研究有限。

3.1 甘草干燥根和山茶水提物的小鼠體內抗新冠病毒研究

GB-2 主要由甘草干燥根和山茶通過水提獲得,為了研究GB-2 的體內抗SARS-CoV-2 效應,以小鼠為實驗動物模型每天口服200 mg/kg 的GB-2。在GB-2 治療1 周后,小鼠未有死亡,且小鼠活動或體重都沒有顯著變化。 此外,GB-2 組與對照組比較,血清肌酐、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶和谷氨酸-丙酮酸轉氨酶水平沒有顯著升高,表明GB-2 沒有明顯的腎毒性或肝毒性。 肺和腎是ACE2 相對高表達的重要器官,是SARS-CoV-2 的潛在靶點,因此研究了GB-2 對ACE2 和TMPRSS2 蛋白在兩個器官組織中的表達影響。 GB-2 治療1 周(200 mg/kg,口服),肺和腎的免疫組織化學(IHC)數據顯示,GB-2組的ACE2 和TMPRSS2 與對照組比較明顯減少。結果表明,GB-2 可能阻斷ACE2 和ACE2TMPRSS2在肺和腎組織中的表達且無副作用,包括腎毒性和肝毒性[45]。

3.2 通過建立人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠模型,該研究評價熱炎寧合劑、復方芩蘭口服液、柴銀顆粒、金柴抗病毒膠囊的有效性

熱炎寧合劑由蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮4味中藥組成,結果顯示熱炎寧合劑能顯著降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺指數,提高小鼠外周血CD8+T 淋巴細胞和CD4+T 淋巴細胞百分比,其低劑量組(14.67 mL/(kg·d))能提高總B 淋巴細胞百分比,降低小鼠肺組織中人冠狀病毒載量和炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 含量,提示熱炎寧合劑對人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證具有較好療效,主要表現在改善肺部病變,增強小鼠免疫機能,降低體內炎癥因子等方面[46]。

復方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍根4 味中藥組成,其高(22 mL/(kg·d))、低劑量(11 mL/(kg·d))可降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺指數,抑制率分別為59.01%、47.72%,此外,復方芩蘭口服液可降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺組織病毒載量,提升其外周血CD4+T淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞及總B 淋巴細胞百分比,降低肺組織中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α 及IFN-γ 表達,明顯改善肺組織炎癥[47]。

柴銀顆粒是由柴葛解肌湯和銀翹散化裁,由柴胡、金銀花、黃芩、葛根、荊芥、青蒿、連翹、桔梗、苦杏仁、薄荷、魚腥草11 味中藥組成,其高(8.8 g/(kg·d))、低劑量(4.4 g/(kg·d))能降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺指數,抑制率分別為61.02%,55.45%,提高小鼠外周血CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、總B 淋巴細胞百分比,降低小鼠肺組織炎癥因子IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量[48]。

金柴抗病毒膠囊由金銀花、柴胡、連翹、黃芩、清半夏、西洋參、綿馬貫眾等中藥組成,可增加寒濕疫毒襲肺證小鼠的活動度和反應能力,改善小鼠皮毛和大便狀態,金柴抗病毒膠囊高(1.76 g/(kg·d))、低劑量組(0.88 g/(kg·d))可以顯著降低肺指數,明顯提升CD4+T 細胞,CD8+T 細胞,B 細胞含量,低劑量組顯著降低血清中MTL 含量,降低肺組織中病毒載量和炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 表達,改善肺組織病理損傷[49]。

4 結語

新冠病毒感染具有潛伏期長、傳染性強等特點,且不斷出現變異株,導致傳播性增強,免疫逃逸,增加疾病嚴重性以及降低疫苗的有效性[50]。 目前尚無有效的抗新冠病毒藥物批準用于臨床,現有藥物研究主要集中在病毒相關靶蛋白,由于冠狀病毒為RNA 病毒,易發生突變,因此單靶點藥物極易產生耐藥性。 因此,針對冠狀病毒及可能的新出現毒株的藥物治療,應根據其致病特點,深入研究病毒復制周期及病毒-宿主相互作用的特點,不斷探索新靶點,將不同靶點藥物聯合使用降低耐藥性及減少毒副作用,此外,“老藥新用”及中西醫并重的治療策略都為抗病毒藥物研究提供了新思路。