不同血清學(xué)檢測方法在人布魯氏菌病診斷中應(yīng)用價值比較

張亞楠，張亞慧，楊佳欣，高志祥，王占黎*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院外語學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017010；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古包頭 014040）

布魯氏菌病（簡稱布病），是一種人、畜共患性全身傳染性疾病，其病原菌是布魯氏桿菌。布魯氏桿菌的毒力或致病力很強(qiáng)，人類接觸患病動物后，細(xì)菌可通過口、皮膚黏膜和呼吸道進(jìn)入人體，產(chǎn)生的內(nèi)毒素是主要的致病因子，可引起菌血癥和毒血癥[1]。布魯氏桿菌進(jìn)入人體后可侵襲到各個器官，包括脊柱、髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)等部位。臨床癥狀主要表現(xiàn)為波狀熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛。布魯氏桿菌生存能力頑強(qiáng)，在干燥、低溫的環(huán)境中均能存活，并且具有很強(qiáng)的抗滅活能力。因此，采取科學(xué)、合理檢驗(yàn)方法有效防控布病，做到早發(fā)現(xiàn)早治療尤為重要。本研究旨在探討膠體金試紙條法、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和IgG/IgM酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)IgG/IgM法（ELISA IgG/IgM法）檢測布魯氏桿菌IgG抗體在布魯氏菌病診斷中應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年12月19日就診于內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心門診的58例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：因發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、腰痛、咳嗽而就診，具有流行病學(xué)接觸史（與牛羊有所接觸），疑似布病。神志清醒。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并血液系統(tǒng)疾病及其他傳染病。根據(jù)中國布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，SAT最低抗體滴度為1∶100，WHO和美國CDC將抗體滴度定為1∶160，結(jié)合我國具體國情和WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，實(shí)驗(yàn)室初篩中加入了膠體金試紙條、ELISA IgG/IgM法等試驗(yàn)。

1.2 檢驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金試紙條法 取10 μL血清于膠體金試紙條加樣孔中，滴加3滴稀釋液，20 min后觀察結(jié)果，如果檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)條帶，即為陽性；如果質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，檢測線沒有出現(xiàn)條帶，即為陰性；如果質(zhì)控線沒有出現(xiàn)條帶，檢測線出現(xiàn)條帶或檢測線和質(zhì)控線均沒有出現(xiàn)條帶，即為無效樣本。

1.2.2 RBPT 于檢查當(dāng)天清晨采集就診患者空腹靜脈血液5 mL，置于含分離膠的金黃色頭蓋真空采血管內(nèi)，待血液凝固，3 000 r/min離心20 min，取血清備用。具體操作：用蠟筆在載玻片上劃分方格，取30 μL血清樣本于方格內(nèi)，滴加等量布魯氏桿菌病虎紅平板抗原，用牙簽混勻，室溫靜置持續(xù)觀察結(jié)果5 min，如果血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)（渾濁、顆粒狀或塊狀物質(zhì)），即為陽性。

1.2.3 SAT 取5支試管備用。第1支試管加2.3 mL濃度的0.5%石碳酸生理鹽水，第2支試管為空白對照管，不加生理鹽水；第3、4、5支試管加0.5 mL 0.5%石碳酸生理鹽水。向第1支試管中加0.2 mL血清樣本，混勻后分別取0.5 mL血清稀釋液于第2、3支試管中；將第3支試管中的混合液混勻后取0.5 mL加到第4支試管中，混勻后再從第4支試管中取0.5 mL混合液加到第5支試管中；最后從第5支試管中取0.5 mL混合液棄去。用0.5%石碳酸生理鹽水稀釋抗原，稀釋比例1∶10，再分別將0.5 mL稀釋后的抗原加到第2～5支中（稀釋比例分別為1∶25，1∶50，1∶100，1∶200）。將5支試管充分震蕩后，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中20～22 h。取出試管后室溫下冷卻，觀察試管的沉淀及清亮程度，并與比濁管比對。“-”無凝集，為均勻粉紅色；“++”出現(xiàn)明顯卷邊，凝集塊間液體稍清亮；“+++”凝集反應(yīng)較強(qiáng)；“++++”凝集塊呈菌叢狀，凝集塊間液體清亮明顯。比濁管的配置，見表1。

表1 比濁管的配置

1.2.4 ELISA IgG/IgM法 加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和已稀釋樣本于相應(yīng)反應(yīng)孔中，封板后室溫溫育60 min。移去封板紙，棄去孔中液體，用300 μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干，在每1微孔中加入100 μL酶聯(lián)物。封板后室溫溫育30 min。移去封板紙，棄去孔中液體，再次用300 μL洗滌液洗板3次。每孔加TMB底物液100 μL，室溫避光溫育20 min。之后在每一微孔中加入100 μLTMB終止液以終止底物反應(yīng)。輕輕搖動微孔板以使試劑混合均勻。加終止液后60 min內(nèi)在450 nm處測OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件完成數(shù)據(jù)分析。一致性采用Kappa檢驗(yàn)（Kappa＞0.75表明一致性極好，Kappa在0.4～0.75內(nèi)表明一致性較為理想，Kappa＜0.4表明一致性差）；受試者工作特征（ROC）曲線計算每種方法的敏感度、特異度。

2 結(jié)果

2.1 4種方法檢測58例患者血清結(jié)果 膠體金試劑條、RBPT、SAT、ELISA IgG/IgM法檢測58例患者血清，結(jié)果顯示，膠體金試紙條法檢測布魯氏桿菌IgG抗體呈陽性12例（20.69%），RBPT檢測出16例陽性（27.59%），SAT檢測出11例陽性（18.97%），ELISA IgG/IgM法檢測布魯氏桿菌呈陽性12例（20.69%），見表2。

表2 4種方法檢測58例患者血清結(jié)果

2.2 4種方法診斷結(jié)果及效能分析 以4種方法檢查結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行診斷效能的計算，結(jié)果顯示：RBPT檢測出敏感度100.00%、特異度89.36%、陽性預(yù)測值68.75%、陰性預(yù)測值100%；膠體金試紙條法檢測出敏感度81.82%、特異度93.62%、陽性預(yù)測值75.00%、陰性預(yù)測值95.65%；ELISA IgG/IgM法檢測出敏感度100.00%、特異度97.87%、陽性預(yù)測值91.67%、陰性預(yù)測值100.00%，見表3、表4。

表3 4種方法檢查結(jié)果

表4 4種方法診斷效能（%）

2.3 ROC曲線 膠體金試紙條ROC曲線下漸進(jìn)95%置信區(qū)間為[0.737，1.000]，RBPT試驗(yàn)ROC曲線下漸進(jìn)95%置信區(qū)間為[0.891，1.000]，ELISA IgG/IgM法試驗(yàn)ROC曲線下漸進(jìn)95%置信區(qū)間為[0.965，1.000]，見圖1。

圖1 ROC曲線

2.4 4種方法可靠性及項(xiàng)間相關(guān)性分析 4種方法一致性分析采用Fleiss Kappa，且Fleiss Kappa值為0.934。各項(xiàng)之間相關(guān)性分析結(jié)果顯示，膠體金試紙條法與SAT之間的相關(guān)性為0.730，RBT與SAT之間的相關(guān)性為0.784，ELISA IgG/IgM法與SAT之間的相關(guān)性為0.947，見表5。

表5 4種方法可靠性及項(xiàng)間相關(guān)性分析

3 討論

布魯氏菌病是國家二類動物疫病，也是人畜共患疾病，對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的危害特別大[2]。每年的第1季度末、第2季度初期和第3季度是布魯氏菌傳播的高峰期，應(yīng)嚴(yán)格對動物進(jìn)行檢疫工作、疫苗接種，定期抽檢調(diào)查動物及養(yǎng)殖場內(nèi)的環(huán)境質(zhì)量[3]。檢疫工作一般選擇細(xì)菌學(xué)診斷、全乳環(huán)狀實(shí)驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)[4]。檢疫工作時如若發(fā)現(xiàn)可疑目標(biāo)，立即采取隔離觀察或無害化處理，及時有效阻斷布魯氏桿菌的傳播。因此，采用科學(xué)有效的實(shí)驗(yàn)室檢查方法檢測布魯氏桿菌十分必要。

本文采用膠體金試紙條、RBPT、ELISA IgG/IgM法和SAT檢測布魯氏桿菌，結(jié)果表明：膠體金試紙條快速檢測試驗(yàn)和RBPT為定性試驗(yàn)，準(zhǔn)確度略低，易出現(xiàn)假陽性，但是檢測速度快，可做大批量篩查；SAT和ELISA（IgG/IgM）法為定量試驗(yàn)，準(zhǔn)確度高，但是SAT檢測時間長，ELISA IgG/IgM法價格比較貴。4種方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，分析原因如下：膠體金試紙條法假陽性常見原因主要包括布魯氏桿菌抗原間交叉反應(yīng)、血清中的內(nèi)、外源性物質(zhì)干擾等。文獻(xiàn)報道內(nèi)源性干擾物質(zhì)包括類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、人抗動物抗體等，容易造成膠體金假陽性[5]。外源性干擾物質(zhì)包括標(biāo)本凝固不全便開始離心，血清中殘留的纖維蛋白原黏附在硝酸纖維素膜上造成假陽性；此外試劑本身質(zhì)量問題、溶血、乳糜血等原因均可對膠體金檢測結(jié)果造成干擾[6]。膠體金雙抗原夾心法、免疫層析法則容易產(chǎn)生假陰性。

RBPT主要檢測項(xiàng)目是IgG抗體，具有較高的敏感度，且有操作簡便、成本低廉、出結(jié)果快的優(yōu)點(diǎn)，可用于大規(guī)模普查[7]。但是該方法易出現(xiàn)假陽性，會造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，并且加大工作人員的工作量[8]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，布魯氏桿菌細(xì)胞壁脂多糖上的O-鏈抗原作為RBPT檢測的診斷靶點(diǎn)，與大腸桿菌O157、沙門氏桿菌等O-鏈抗原具有高度相似性，容易發(fā)生交叉凝集反應(yīng)導(dǎo)致假陽性[9]。抗原質(zhì)量是影響RBPT結(jié)果的關(guān)鍵因素。此外，反應(yīng)溫度、時間、抗凝劑、纖維蛋白原和藥物易對RBPT產(chǎn)生假陽性。根據(jù)布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 269-2007）[10]要求反應(yīng)在30 ℃、5 min后判斷結(jié)果。有研究證明，虎紅平板表面溫度會對試驗(yàn)結(jié)果造成影響。商品化的紙質(zhì)反應(yīng)板難以控制溫度，可通過加熱玻璃反應(yīng)板消除溫度對實(shí)驗(yàn)造成的影響[11]。每次試驗(yàn)時須設(shè)立陰、陽性對照，在規(guī)定的時間范圍內(nèi)完成檢測。血清樣本放置的時間越長、溫度越低，假陽性率越高。抗凝血的血漿中含有纖維蛋白原，帶有正電荷的纖維蛋白原與帶有負(fù)電荷的虎紅發(fā)生靜電結(jié)合，形成肉眼可見的超分子反應(yīng)[12]。相比之下，SAT不受樣本類型的影響，血清和血漿樣本的檢測結(jié)果一致。因此，RBPT試驗(yàn)采血時必須使用促凝管，要求血清樣本新鮮透亮、無細(xì)菌污染和溶血，在規(guī)定溫度和時間下進(jìn)行檢測。

ELISA相對RBPT和膠體金試紙條法敏感度和特異度更高，可避免人工操作帶來的誤差。該方法通過檢測血清中的IgG、IgM，可有效鑒別急性、慢性布魯氏菌病。但是，布魯氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌0∶9的脂多糖在ELISA試驗(yàn)上可發(fā)生抗原交叉反應(yīng)，常規(guī)上使用ELISA抑制試驗(yàn)測定布魯氏菌屬和耶爾森氏菌屬抗體的特異度，并且該方法成本高，不適用于現(xiàn)場檢查[13]。

SAT作為國際上推薦使用的檢測方法，被當(dāng)作布魯氏菌病的確證試驗(yàn)。該方法不易受到非特異度抗體的干擾，假陰性檢出率低，具有較高的敏感度和特異度，適用于布魯氏桿菌臨床診斷[14]。但是，SAT主要檢測IgM類抗體，其維持時間較IgG抗體短，所以SAT陽性檢出率低于RBPT。此外，SAT易受到人為因素的干擾，操作時間長，耗時24 h以上，檢測時需用大量血清和布魯氏桿菌凝集抗原。

綜上所述，在臨床實(shí)際血清學(xué)檢查的工作中，RBPT敏感度高，ELISA敏感度高且特異度強(qiáng)。四種試驗(yàn)方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可結(jié)合使用快速診斷布魯氏菌病。另外，應(yīng)該配合臨床其他檢查手段，比如超聲、CT等綜合判斷布魯氏菌病。最后，在治療的過程中，應(yīng)該科學(xué)治療，對癥下藥，醫(yī)患雙方積極配合，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。