自閉癥中T細胞及相關細胞因子的研究進展①

申 晨 曹 霞 喻哲昊 李 萌 （昆明醫科大學第二附屬醫院中心實驗室，昆明 650000）

自閉癥是一組以社會交流障礙、語言和非語言交流障礙、興趣狹窄及行為重復刻板為主要特征的神經發育障礙性疾病。1943 年，美國霍布金斯醫院的兒童精神病學家KANNER 教授首次報道，并于2013年在美國精神病學診斷統計手冊第5版（DSM-Ⅴ）正式提出孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）的概念，并將兒童自閉癥、未分類的廣泛性發育障礙、阿斯伯格綜合征統稱為ASD。

ASD 病因不明，且發病率逐年提高，尚無特效治療手段，其中患者個體異質性強，也成為早期篩查和診斷治療的一大難題。ASD 被認為是環境和遺傳共同作用的結果，但仍未證實發病的病理機制和有效的臨床生物學指標，診斷主要依據行為學標準，存在較大局限。臨床病例顯示，ASD 患兒常伴有一種或多種自身免疫性疾病，家庭成員患有自身免疫病史的后代患ASD 的概率更高，且母體免疫激活已被認為是ASD 的風險因素，同時在患者體內也發現多種針對自身組分的反應性抗體存在，表現出自身免疫基礎［1-2］。近年來發現ASD 中樞和外周普遍存在不同程度的免疫失調，其中T 細胞及其細胞因子在其發生發展中顯現出越來越重要的作用。本文綜述了ASD中T細胞和相關細胞因子的研究進展，探討ASD 中免疫調節體系的缺失造成的不同T 細胞表型激活及其對于疾病進展的重要作用，為尋找潛在有效的生物學標志物和ASD 個性化防治提供新思路。

1 T細胞簡述

T 淋巴細胞簡稱T 細胞，源自骨髓產生的淋巴干細胞，在胸腺中發育成熟，循環于次級淋巴組織間發揮免疫功能，是適應性免疫應答的重要組成部分。T 細胞在胸腺中經過陰性選擇和陽性選擇后，篩選具有自身主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）限制和自身免疫耐受的T 細胞，并主要以幼稚的 CD4+或 CD8+T 單陽性 T 細胞向外周輸出，其表面的T 細胞受體（T cell receptor，TCR）決定T 細胞多樣性，遇到帶有相同抗原肽的抗原提呈細胞后，識別MHCⅡ類分子提呈的抗原決定簇的幼稚CD4+T 細胞分化為具有輔助效應的T（helper T cell，Th）細胞亞群，分泌相應的細胞因子對抗病原體感染；識別MHCⅠ類分子的幼稚CD8+T細胞分化為對抗病毒和腫瘤的細胞毒性T 細胞（cytotoxic T cell，CTL）；同時在特定細胞因子環境下，分化成能抑制T 細胞過度增殖與活化的調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg），預防自身免疫反應。

2 ASD中的T細胞失調

2.1 神經炎癥與T 細胞 ASD 近年來研究的主要進展之一就是發現神經炎癥可能是ASD 的致病因素。有證據表明，在ASD 多個腦區中發現激活的小膠質細胞和星形膠質細胞，從而導致腦組織中的促炎因子 IL-1β、IL-6、IL-17 和 TNF-α 表達增多，介導病理損傷［3］。最新研究報道，在患者死后大腦腔隙的血管周圍，出現大量多灶性淋巴細胞浸潤，主要是以 CD8+T 細胞為主，CD4+和 CD3+標記的 T 細胞次之［4］。作為我們認知中的免疫豁免區，正常情況下T 細胞不會跨越血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）。而 FIORENTINO 等［5］通過分析 ASD 死后腦組織BBB 相關基因序列和蛋白譜，認為ASD 的BBB功能受損，且和神經炎癥相關，因此不難解釋T細胞的“越位”現象，同時CD8+T 細胞的腦內優勢提示可能存在潛在病毒感染。

在一項整合1 695 例自閉癥、精神分裂癥和雙相情感障礙患者腦樣本基因型和RNA 序列信息分析轉錄組調控異常的研究中，發現4 個模塊與神經免疫過程直接相關，揭示了神經發育障礙性疾病NF-κB 炎癥信號通路模塊普遍上調，而ASD 在干擾素反應和小膠質細胞模塊中表達最強，表現出疾病特異性［6］。此外，NADEEM 等［7］通過分離培養 ASD患兒T細胞，證實其T細胞中脂多糖主要受體TLR-4表達增加，激活NF-κB信號通路，導致NADH氧化酶（NOX-2）和活性氧（ROS）產生過多。而T 細胞在腦部浸潤，也很可能通過神經系統中大分子的過度氧化修飾而引發神經炎癥。

2.2 ASD外周T細胞過度活化

2.2.1 T 細胞數量與激活狀態改變 1977 年STUBBS 等［8］通過植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激ASD 患者淋巴細胞轉化，首次發現ASD中T 細胞數量減少，隨后越來越多的研究發現ASD中適應性免疫應答出現異常，以T 細胞為主表現在T細胞數量、活化狀態和相關細胞因子的改變。

ASD 外周T 細胞主要通過流式細胞術進行檢測，早些年研究認為ASD 患兒的易感性主要與CD4+T 細胞的減少相關，在鮮少報道的成人ASD 的檢測中，卻發現更多的是以CD8+T 細胞升高為主的免 疫 表 型 ，CD4/CD8 有 所 下 降［9-10］。 然 而 根 據ASHWOOD團隊［11］的報道，與健康兒童相比，并未發現 ASD 患兒 T 細胞或是 CD4+T 細胞、CD8+T 細胞數量有統計學差異，受單一時間點檢測局限，同時也提示ASD 免疫學表現的異質性結果，但在同期研究中發現ASD中T細胞的激活狀態明顯發生改變。

ERICKSON等［12］發現ASD患者的淋巴細胞細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）激活增加，ERK 被認為是一種絲裂原活化激酶，該細胞外信號通路激活增加是ASD 淋巴細胞過度活化的非特異性標志。此外T細胞活化的早期標記物HLA-DR 和CD26 在ASD 中發現表達增加，提示ASD患者T細胞可能存在持續激活狀態［11］。2018 年 AHMAD 等［13］通過檢測 ASD 單個核細胞中表 達 HLA-DR 的 CD4+、CD8+、CD28+、CXCR4+和CCR7+細胞數量，發現ASD 患兒HLA-DR、共刺激因子和作用于初始T細胞的趨化因子受體表達水平顯著升高，再次證實以上猜想。另一方面，ASD 患者T 細胞CD95 表達減少，作為細胞凋亡信號，提示ASD中可能過度活躍的T細胞凋亡減少［14］。

2.2.2 適應性免疫反應相關細胞因子異常 細胞因子是由免疫細胞經刺激合成、分泌的一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白。在ASD 的研究中，普遍發現其細胞因子分泌偏向于促進炎癥發生。最新研究證實ASD表達IFN-γ、IL-6、IL-9、IL-22和GM-CSF的CD45 細胞顯著增加，同時針對ASD 促炎因子的薈萃分析，為ASD體內更高濃度的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的存在提供更有力的證據［15-16］。

雖然在ASD 個體中產生的細胞因子表型不盡相同，但這種紊亂與其異常行為直接相關。研究發現ASD 體內高表達的IFN-γ與其刻板行為和交流障礙密切相關［12］。同時近年來多有報道ASD 患者Th2細胞分化傾向，證實其特征性細胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-13 在患者血清中升高，且具有這類特征的ASD 患兒發育評分較低［17-18］。在新生兒血斑檢測中，IL-4的升高增加了ASD的發病率，并與其嚴重程度呈正相關，同時還顯示出增加智力障礙的風險［19-20］。在被確診為ASD 的母體血清和羊水中也發現IL-4 明顯升高，提示其在早期發育中影響胎兒乃至出生后兒童的正常發育［21-22］。

Th17 是新發現的一個獨特的CD4+T 細胞亞群，主要產生IL-17、IL-21 和IL-22，已經證實在多種自身免疫病中發揮作用。ASD中Th17亞群升高，IL-17明顯高于健康對照組，增強炎癥反應的同時，證實這些改變與ASD 異常行為呈正相關［23］。同時IL-17可穿越胎盤屏障，在嬰兒大腦中起作用，導致皮質和行為異常，在早期的母體免疫激活中可能發揮重要作用［24］。ASD 患者腸道微生物還顯示出 Th17 極化傾向，合并腸道問題共病的ASD患兒Th17和IL-17顯著升高，未合并腸道問題的ASD 兒童則表現為以IL-13+CD4+T 細胞為特征的Th2 亞群優勢，兩組顯示出無差異性IFN-γ 升高。在體外細胞實驗中，拮抗IL-6 可以阻斷CD4+T 細胞中上調的IL-17a 信號傳導，提示治療的潛在靶點［25］。

與此同時，T 細胞活化相關的轉錄因子和不同的 T 細胞亞群，即 Th1（T-bet）、Th2（GATA-3）、Th17（RORγt）在ASD 患兒中均有增加，表明ASD 存在免疫障礙的同時，并未支持單一細胞極化傾向的論證，由此推測效應T 細胞的普遍激活狀態可能與缺乏充分的調控機制有關［26］。

2.3 Treg 體系缺陷 Treg 是一類具有抑制T 細胞作用的調節性CD4 T 細胞亞群，主要通過分泌IL-10、TGF-β 和 IL-35 參與自身免疫耐受的建立，同時在外周不同組織中適度調節T 細胞介導的免疫應答。

研究表明有ASD 患者出現Foxp3+Treg系統性缺陷，循環CD4+CD25highTreg 頻率顯著降低，且 Treg 減少導致抗炎因子IL-10和TGF-β分泌減少，與疾病嚴重程度呈負相關，顯示出更糟的行為變化［23，27］。此外，在Treg 細胞中發揮重要免疫調節作用的轉錄因子Helios 也出現改變，證實與健康兒童相比，ASD 患兒Helios mRNA 和蛋白表達水平較低，且CD4+細胞、CD8+細胞、Tim-3+細胞和 CXCR3+細胞中 Helios下調，提示免疫功能障礙［28］。在最近的ASD 分組研究中也發現Treg和表達IL-10+的CD4+細胞有下降趨勢，表明T 細胞調節受限的共性現象［29］。同時在ASD 中發現IL-35 分泌減少，作為Treg 發揮免疫抑制作用所必需的效應因子，IL-35的濃度水平與ASD的嗜睡、過度活動以及不當語言成反比［30］。有趣的是，由于Treg 和Th17共用一個前體細胞和一套TGF初始信號，正常情況分化為Treg，而炎癥狀態下分化為Th17，因此Treg 的缺失，很大程度促進了Th17 的炎癥性激活。綜上表明Treg 體系的缺陷可能是導致T 細胞亞群出現不同程度過度激活的重要因素，進而引發ASD的相關癥狀表現。

3 小結與展望

ASD 患者普遍存在免疫紊亂，以T 細胞介導的適應性免疫為例，ASD 患者可能缺少適當的免疫應答機制。由于缺乏正常人調控T細胞增殖和分化的完整Treg 體系，T 細胞出現不同程度的激活表型導致ASD 長期的炎癥狀態，其異常表型與ASD 患者的行為和發育密切相關，表明T 細胞在ASD 發病中發揮重要作用，因此恢復其調節機制很可能有利于ASD 癥狀的改善。但是免疫失調并不是ASD 的全體現象，因為ASD 異質性強，遺傳背景和環境因素尚不清楚，且當前研究又受限于樣本量小的問題，很難得出共性結果。然而存在免疫失調的ASD 患者很可能是一類特殊的亞組，研究探索的相關免疫指標有機會用于ASD 的早期篩查和靶向治療。雖然越來越多的證據顯示免疫功能障礙在ASD 發病中發揮重要作用，但其中關聯尚未可知，仍存在許多問題等待解答。

不過近些年通過免疫調節治療改善ASD 行為的報道并不少見。如應用具有一定免疫抑制作用的抗精神病藥物利培酮，聯合塞來昔布和環氧合酶-2選擇性非甾體類抗炎藥物，改善ASD 的刻板行為和社會戒斷的有效性報道，以及通過靜注丙種球蛋白改善免疫指標和不良行為的成功案例，都表明免疫治療這條路是可行的［31-32］。隨著動物模型的介入，應用不同干預措施幫助確定ASD 發展及惡化的相關機制，以及通過聚類分析進行ASD 亞組分型的研究手段，都可以塑造未來的ASD 研究假說，為逐步揭示ASD的病理機制打下堅實基礎。