長鏈非編碼RNA在膀胱癌發生發展中研究進展

關欣 楊利強 徐偉杰 武煜明

(昆明衛生職業學院，云南 昆明 650600)

膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤〔1〕。近年來膀胱癌的發病率和病死率均呈逐年上升趨勢，嚴重威脅我國國民的健康〔2〕。膀胱癌大致可以分為兩類：非浸潤性和浸潤性膀胱癌。在新發膀胱腫瘤患者中70%～80%為非肌層浸潤性膀胱癌，盡管接受了積極的手術及化學治療，膀胱癌還是具有較高的復發率和轉移率，并且有10%～30%患者進一步發展成肌層浸潤性膀胱癌〔3，4〕。肌層浸潤性膀胱癌預后能力較差，患者 5年生存率低于50%〔5〕。因此，明確膀胱癌發生發展的分子生物學機制，尋找膀胱癌的有效的治療靶點顯得至關重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子。大量研究表明，lncRNA可以通過影響信號轉導通路、表觀遺傳調控、細胞增殖分化等多個層面參與生物體內的多種調控過程〔6，7〕。本文就lncRNA在膀胱癌發生發展及治療過程中的作用研究進展作一簡要綜述。

1 LncRNA的概述、分類及功能

1.1LncRNA的概述 目前發現的大多數lncRNA都是由RNA聚合酶(pol)Ⅱ或RNA pol Ⅲ轉錄產生〔8〕。LncRNAs轉錄本由多個外顯子組成，與編碼蛋白質的mRNA的結構類似,具有3＇poly A尾巴和5＇帽子結構，但與mRNA相比，lncRNA轉錄本的外顯子更少，總體表達水平較低，而且種間的序列保守性差，只有5%～6%的lncRNA具有保守序列〔9〕。LncRNA廣泛存在于真核生物體內，早期研究過程中認為lncRNA是“轉錄噪音”，不具有生物學功能〔10〕。然而，近年來研究發現，lncRNA雖然不能參與蛋白質編碼，但其在染色質修飾、基因轉錄后調控、核內運輸、細胞周期等發育過程中發揮著重要的調控作用〔10～12〕。LncRNA的這些調控作用可能參與了疾病的發生發展，與疾病的診斷治療密切相關，使其成為了生物學研究熱點之一。

1.2LncRNA的分類與功能 目前尚未有明確規范的lncRNA的分類方法，最常見的主要是根據lncRNA在基因組中與鄰近編碼蛋白基因組之間的位置關系進行劃分，可以將其分為5種類型：①基因間lncRNA：lncRNA由位于兩個蛋白質編碼基因的間隔區域，與蛋白編碼基因相距至少1 kb以上轉錄本轉錄得到；②基因內lncRNA：lncRNA從蛋白質編碼基因的內含子區域轉錄形成；③雙向lncRNA：lncRNA由相鄰的蛋白質編碼基因的啟動子反方向轉錄而來；④反義lncRNA：由編碼基因反方向轉錄形成，轉錄本與編碼基因的外顯子存在重疊區域；⑤正義lncRNA：由編碼基因同方向轉錄形成，轉錄本與編碼基因的外顯子存在重疊區域〔13〕。LncRNA的功能與其在基因組中的定位密切相關。 絕大多數lncRNA定位在細胞核中，參與染色質修飾、轉錄激活、募集RNA pol Ⅱ等調控過程；少數lncRNA定位在細胞質，通過影響mRNA的穩定性、參與翻譯調控及競爭性結合microRNA來調節生物學功能〔14，15〕。

LncRNA的亞細胞定位呈現多樣化，在細胞核、細胞質中均有分布，甚至有些獨特的lncRNA具有獨特的亞細胞定位，所以lncRNA在生物體內的功能也非常復雜。目前確定的主要有以下8種功能〔16，17〕：①在編碼蛋白基因上游啟動子區域進行轉錄，影響下游基因的表達水平；②通過抑制RNA pol Ⅱ活性或參與染色質重組及組蛋白修飾，影響下游基因的表達；③通過與編碼蛋白基因的mRNA形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切，從而形成不同的剪切形式；④通過與編碼蛋白基因的mRNA形成互補雙鏈，進一步在Dicer酶作用下形成內源性的siRNA,從而調控基因的表達水平；⑤lncRNA通過與特定的蛋白質結合，影響蛋白多聚物的形成，調控蛋白活性；⑥作為結構組分與蛋白質形成核酸蛋白質復合體；⑦lncRNA通過結合到特定蛋白質上，改變其細胞的定位；⑧lncRNA作為小分子競爭性結合microRNA，抑制其與mRNA的結合，使得mRNA免于降解。研究發現，在許多惡性腫瘤中，lncRNA的表達和功能常常存在異?！?8〕。這些異常的lncRNA通過在基因表觀遺傳調控、轉錄調控及轉錄后調控參與到腫瘤細胞的增殖、轉移和浸潤等發生發展過程〔19〕。這些研究提示lncRNA可能成為癌癥早期診斷的特異性生物分子標志物和治療靶點。

2 LncRNA在膀胱癌中的作用

隨著lncRNA研究的深入，其在疾病發生發展過程中的作用也越來越受大家的關注。在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、腎癌等常見腫瘤中，都發現了異常表達的lncRNA，研究結果也證實這些表達異常的lncRNA確實與腫瘤的增殖、遷移、侵襲等發生發展過程密切相關〔20～22〕。在泌尿系統腫瘤研究中，也發現了多種異常表達的lncRNA參與了腫瘤發生發展，其中發現最早的是在膀胱癌中表達異常的H19，之后又陸續發現了UCA1、MALAT1等在膀胱癌中的作用〔23～25〕。因此，不斷闡明新的lncRNA在疾病發病機制中的作用對臨床診斷、治療等方面均具有重要的價值。

2.1LncRNA對膀胱癌細胞增殖的影響 癌癥的發生發展受多種因素的調控，如環境、遺傳等，其中細胞增殖調節的失控是腫瘤發生發展的一個重要機制。細胞發生異常增殖，造成細胞凋亡減少，會促進腫瘤的發生。許多關于膀胱癌和lncRNA的研究表明，lncRNA參與了膀胱癌細胞的增殖調控。

LncRNA H19是最早發現的在膀胱癌中異常表達的長鏈非編碼RNA。H19位于人染色體11p15.5上，全長2.3 kb，是母源性印跡基因，在胚胎發育時期呈現高表達水平，而出生后表達水平快速降低〔26〕。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)對24例膀胱癌組織、癌旁組織及膀胱癌細胞系的H19表達水平進行檢測分析，發現膀胱癌組織和膀胱癌細胞系的H19呈高表達水平，并且過表達H19可以通過調節分化抑制因子(ID)2和果蠅zeste基因增強子同源物(EZH)2蛋白的表達促進膀胱癌細胞的增殖〔27〕。Luo等〔28〕研究也證實H19通過與EZH2相結合，可以激活Wnt/β-鏈蛋白信號通路，從而抑制上皮細胞E-鈣黏附素(cadherin)的表達促進膀胱癌增殖、轉移。尿路上皮癌相關抗原(UCA)1是參與膀胱癌發生發展過程中特異性表達的lncRNA，其在膀胱癌組織中呈現高表達，并與膀胱癌的增殖密切相關。研究發現，lncRNA UCA1的表達水平與環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)表達量呈正相關，過表達UCA1可以通過調控細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性和表達，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路,從而調控p300 和CREB的表達，最終促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移。LncRNA在腫瘤中的功能并不是單一的，有促癌作用也有抑癌作用。母系表達基因(MEG)3就是少數發揮抑癌作用的lncRNA之一。采用RT-qPCR對31例膀胱癌組織和對應的癌旁組織進行監測分析，發現在膀胱癌組織中MEG3表達水平明顯下調〔29〕。此外體外實驗結果顯示，在 T24細胞中對MEG3做敲除處理，使MEG3表達缺失會增加膀胱癌細胞的增殖，而重新表達MEG3則可抑制腫瘤細胞的增殖和集落的形成，更重要的是自噬抑制可以抵抗MEG3下調造成的細胞增殖〔29〕。MEG3在膀胱癌中具有抑癌功能，但其發揮作用的機制仍不明確，需要進一步的研究探討。

2.2LncRNA對膀胱癌細胞侵襲和轉移的影響 惡性腫瘤的發展進程常伴有腫瘤細胞的侵襲和轉移，而這也是造成腫瘤患者死亡及難以治療的主要原因。以往研究證實，表達異常的lncRNA可能參與了腫瘤細胞的侵襲和轉移調控過程。目前已被研究報道的lncRNA MALAT-1、UBC1、MDC1-AS、SNHG7、ncRNA、UCA1等〔30～32〕與膀胱癌的侵襲、轉移密切相關。LncRNA MALAT-1是一個在膀胱癌、肝癌、前列腺癌等癌癥中都高表達的特異性lncRNA。在膀胱癌的研究中發現，MALAT-1在癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織，與沒有發生轉移病灶的膀胱癌組織相比，發生轉移的膀胱組織中MALAT-1呈現高表達。體外研究證實，在膀胱癌細胞株T24和RT4中通過調節轉化生長因子(TGF)-β表達水平上調MALAT-1和SUZ12的表達，從而激活Wnt信號通路促進細胞發生上皮間質轉化(EMT)，進而增強了膀胱癌細胞的侵襲、遷移、轉移能力〔33〕。另外，He等〔34〕發現lncRNA UBC1在膀胱組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且UBC1的表達與淋巴結的轉移及較差的預后密切相關。研究表明，UBC1在原發性膀胱癌中表達水平升高，并且其表達水平越高，膀胱癌患者發生淋巴結轉移的概率越大〔35〕。通過RNA免疫沉淀發現UBC1可以與多梳抑制性復合物(PRC)2的核心成分EZH2和SUZ12相互結合，從而促進膀胱癌細胞增殖、轉移和侵襲〔34〕。以上研究都表明lncRNA的異常表達與腫瘤發生進程的增殖、侵襲和轉移具有高度的相關性，這也提示了我們更加深入研究lncRNA在癌癥發生過程中的作用及機制，可以為腫瘤治療和干預提供一定的基礎和方向。

3 LncRNA在膀胱癌診斷和治療中的作用

膀胱癌良好治療的基礎是可能患膀胱癌人群的早期篩查診斷和有效且無創的術后監測方法。膀胱鏡檢查雖然是膀胱癌診斷的金標準〔36〕，但其有創性的特點，常令患者望而生畏，且膀胱鏡無法發現早期、較小的膀胱癌病變，因此無法用于膀胱癌高危人群的早期篩查。尿液細胞學檢查是臨床應用最為廣泛的無創檢查方法，但其敏感性較低，可重復性較差〔37〕。目前研究最多的膀胱癌標志物是核基質蛋白(NMP)22〔38〕和膀胱腫瘤抗原(BTA)〔39〕系列試驗,但均存在特異性較低的問題。這些方法無法滿足目前臨床早期診斷和術后監測膀胱癌的需要。因此，確定更好的、可靠的、無創的、可用于早期診斷和術后監測的膀胱癌標志物非常重要。

在膀胱癌中，有些lncRNA不僅與腫瘤的發生發展密切相關，而且在診斷、預后方面具有高度的敏感性和特異性。研究發現，通過尿液細胞學檢測發現尿液中UCA1顯示其在膀胱癌診斷中具有明顯的特異度(91.76%，78/85)和靈敏度(80.85%，76/94)，而且UCA1與膀胱癌的分期分級密切相關，膀胱癌的分級越高，UCA1診斷的靈敏度也越高，在膀胱癌G2～G3期患者中靈敏度高達91.11%(41/45)〔40〕。在膀胱癌患者尿液中UCA1所表現出來的高特異度和靈敏度，使其可能成為膀胱癌診斷及治療預后評估的腫瘤標志物。還發現UBC1在膀胱癌中的表達與腫瘤的淋巴結轉移、術后生存率呈負相關。提示UBC1也可作為膀胱癌高風險患者加強治療和預后評價的一個指標。另外，Wang等〔41〕在膀胱癌患者血清外泌體中關于lncRNA H19的研究結果也表明，膀胱癌患者血清外泌體中H19與癌旁組織中的H19表達水平呈正相關，且與術前樣本相比術后樣本中的血清外泌體H19顯著降低，膀胱癌患者血清外泌體H19表達水平也顯著高于健康人群。生存曲線分析也表明膀胱癌患者血清外泌體H19表達水平與患者生存率呈負相關，以上結果都提示我們血清外泌體H19可以作為膀胱癌非侵入性診斷和治療預后監測的標志物。

HOX反義轉錄RNA(HOTAIR)是位于12號染色體上由HOXC基因簇的反義鏈轉錄而來的lncRNA。研究發現，HOTAIR在宮頸癌中表達上調，并且與腫瘤的大小、淋巴轉移、浸潤深度相關，而且上調的HOTAIR還可以作為宮頸癌預后評估的有效分子標志物〔42〕。在甲狀腺癌中，也發現HOTAIR通過激活Wnt信號通路影響甲狀腺癌患者的腫瘤大小、淋巴轉移并且和腫瘤患者較差的存活率有明顯的關系〔43〕。另外，在原發性腫瘤患者和淋巴結轉移患者的唾液中檢測發現HOTAIR表達量有明顯的差異。唾液 HOTAIR檢測被認為是無創、快速診斷口腔癌的標志物。HOTAIR不僅在宮頸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、口腔癌等腫瘤中可作為分子標志物，在膀胱癌中HOTAIR表達水平對膀胱癌發生發展、復發和預后情況也具有明顯的預測價值。HOTAIR表達水平與膀胱癌復發率呈正相關，其中Ta/T1級膀胱癌復發率較高。在Ta/T1級膀胱癌組織切片中通過免疫組化檢測發現Wnt-抑制因子(WIF)-1表達水平與 HOTAIR呈負相關，由此可見HOTAIR可作為Ta/T1級膀胱癌復發率的獨立預測指標〔44〕。

綜上，膀胱癌和其他腫瘤一樣，其發生發展是一個動態多變的過程。近年來關于膀胱癌的診斷、治療雖然出現了一些新方法，但是對于早期的診斷、術后的監測等問題還是未能作出建設性的突破。隨著科技技術的發展，關于lncRNA在膀胱癌中的研究成果也越來越多，大量的研究也表明lncRNA與膀胱癌的增殖、遷移、侵襲等生物進程密切相關，這也使lncRNA有可能成為膀胱癌早期診斷、治療、復發監測的潛在分子標志物。雖然當前已經發現了較多與膀胱癌相關的lncRNA,但其在組織中特異性低，而且在其他腫瘤中也呈現異常表達，這為我們開發膀胱癌特異性強，靈敏度高的lncRNA分子標志物提供了難度。因此，我們應該更加深入的研究探討lncRNA在膀胱癌發生發展中作用，才能更好地預測、診斷膀胱癌及為膀胱癌個性化治療和藥物研發提供具有意義的理論指導。