不同啟動子eGFP載體在羅氏沼蝦活體內的表達效率比較

任晉東，牛寶龍，樓寶

(浙江省農業科學院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是世界上最大形的淡水蝦之一。原產于印度洋-太平洋熱帶地區，自1976年引入我國后，產業規模不斷擴大，市場需求不斷上升，目前已成為我國重要的經濟淡水蝦類，年均總產值達到80多億元[1]。羅氏沼蝦的性別決定屬于ZW型，雌雄個體表型差異較大，雄性個體體形較大，在生長速度、抗病性等方面都有著顯著的優勢[2]，因此，利用生物技術探索羅氏沼蝦性別決定機理，對培育羅氏沼蝦單性群體具有重要的意義。但由于羅氏沼蝦細胞培養技術體系的缺乏，目前常用的脂質體轉化、病毒轉染進行基因功能研究的方法在甲殼類動物上效率較低[2-3]，探索有效的外源基因表達體系是羅氏沼蝦發育、繁殖等分子遺傳機理研究的基礎。

已有相關研究表明，慢病毒表達體系能夠攜帶外源基因進入對蝦體內進行表達[4]，也有研究進行精子介導的CMV啟動子表達質粒能夠整合到羅氏沼蝦體內基因組中[5]，但該研究未進行表達效果驗證研究。在蝦類疾病-白斑病毒研究過程中，發現其囊膜蛋白VP28啟動子IE1在蝦類體內具有較強的促轉錄表達作用[6]，節肢類動物家蠶上同名的IE1啟動子也有較好的促轉錄表達效果，但是表達效率不如融合了hr5增強子的IE1轉錄活性強[7]，而目前關于羅氏沼蝦的外源基因高效表達啟動子效果的研究尚未有報道。

因此，本文利用當前常用啟動子為研究對象構建表達載體，進行活體注射，并通過熒光報告基因和基因轉錄相對表達量來探索不同啟動子在羅氏沼蝦活體的表達效率，為羅氏沼蝦開展基因功能驗證研究提供有效的分子工具。

1 材料與方法

1.1 質粒構建

構建分別包含hr5-IE1、IE1、SV40啟動子和下游表達基因eGFP及終止信號的表達質粒(圖1)。

圖1 不同啟動表達質粒的結構

1.2 活體注射

按照構建的啟動子質粒分3個組別和1個對照組，每組選擇6只體重為5～7 g的羅氏沼蝦個體注射表達質粒，對照組注射同樣體積的PBS作為參照。注射部位選擇頭胸甲與后驅間的肌肉組織，注射量為每克體重1 μg的DNA濃度標準進行注射，注射12 h后采集所有個體肌肉組織，并立即置于液氮中用于后續分析。

1.3 組織熒光檢測及定量分析

利用綠色熒光燈在黑色背景下檢測各個組別樣品的熒光特性。利用全式金Trizol UP試劑盒，提取各樣品總RNA。并利用諾唯贊RT-PCR試劑盒反轉錄合格RNA樣品，20 μL體系添加總RNA量控制在1 μg以內。

以β-Actin基因為內參基因，對eGFP基因表達量進行qPCR定量分析，qPCR引物序列如表1所示。按照10 μL 2×Mix buffer，2 μL Primer-F，2 μL Primer-R，2 μL cDNA和4 μL高純水配制成20 μL的qPCR反應體系，利用Bio-Rad的CFX96型qPCR儀進行所有樣品的兩步法定量反應，程序運行結束記錄所有樣品β-Actin和eGFP基因Ct值用于后續統計分析。

表1 基因表達量qPCR用引物的序列

1.4 相對表達量統計分析

利用各樣品測定的eGFP和β-Actin基因Ct值計算，以對照組為內參計算各組別內所有樣品eGFP基因相對表達量2-ΔΔCt值。利用方差分析比較不同組間的相對表達量差異。

2 結果與分析

2.1 熒光檢測

對實驗個體注射12 h后，利用綠色熒光檢測設備進行羅氏沼蝦活體檢測，結果表明，攜帶hr5-IE1啟動子的樣品組熒光亮度最大，IE1啟動子組注射個體僅有微弱熒光，SV40和對照組看不到熒光效果(圖2)。

圖2 不同啟動子組個體活體注射后的熒光檢測

2.2 定量分析

對注射個體以對照組為參照，以β-Actin基因為內參對3個不同啟動子組質粒注射個體eGFP基因表達量進行比較分析，結果表明，hr5-IE1組eGFP基因的相對表達量極顯著高于SV40組，顯著高于IE1組，而IE1組也顯著高于SV40組(圖3)。

*和**分別表示差異達到顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。圖3 不同啟動子組eGFP相對表達量比較結果

3 小結與討論

同一個啟動子在不同物種之間存在著顯著轉錄效率和關鍵保守域上的差異[8]，也具有在不同物種之間活化和引導特異性RNA聚合酶進行下游基因表達的調控功能[9]。因此，進行不同物種啟動子轉錄活性研究是進行外源基因體內表達的重要依據。羅氏沼蝦作為重要的淡水養殖生物，特別是其單基因調控性別決定機制的獨特性，成為性別決定分子機制研究的重要對象。而本文章通過對常見節肢動物啟動子IE1、hr5-IE1及Sv40攜帶外源基因表達效率的研究，篩選出了羅氏沼蝦活體表達更加高效的啟動子。

IE1是羅氏沼蝦白斑病毒研究中發現的在其體內復制組裝的關鍵調控元件[10]，并且在家蠶等動物中都具有轉錄外源基因的活性[7]，瞬時轉錄活性較家蠶肌動蛋白Actin4(A4)、α微管蛋白、絲素H鏈(Fib-H)啟動子較弱[11]，在家蠶遺傳轉化研究中其轉錄活性也較hr5-IE1有所下降，該結果與本研究結果一致，表明插入了增強子hr5的IE1啟動子攜帶外源基因進行轉錄表達的效率顯著提高，也表明hr5這個來源于苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的轉錄調控元件[12]，在羅氏沼蝦水生動物體內也具有增強下游啟動子的功能，和RNA聚合酶結合增強表達的效率可以達到219%以上。

SV40啟動子是來源于哺乳動物猿猴病毒40的啟動子，是哺乳動物分子生物工程重要的強啟動元件[13]，也在植物細胞中具有轉錄啟動活性[14]，在水生動物上的轉錄啟動活性還未見報道，在本研究中該啟動子和對照組不具有啟動外源基因在羅氏沼蝦體內進行轉錄表達的作用，因此，在羅氏沼蝦體內進行外源基因表達研究時建議不作為主要考慮啟動子，而IE1啟動子和含有hr5增強子的啟動子可以重點考慮，但對于hr5為何在羅氏沼蝦體內具有增強IE1啟動子轉錄活性的作用機制還尚不清楚，還需進一步探索研究。