藤黃酸通過CYLD/NF-κB信號通路抑制高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用△

陳 晶 龐東渤

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)包括非增殖期DR及增殖期DR(PDR)。PDR的主要表現(xiàn)為病理性新生血管的形成，其發(fā)生發(fā)展是導(dǎo)致眼底出血及牽拉性視網(wǎng)膜脫離的主要原因[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞為血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，對維持視網(wǎng)膜正常生理功能起重要作用。研究表明，糖尿病持續(xù)高糖環(huán)境可引起核因子κB(NF-κB)過度激活，進(jìn)而發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等，引起RPE細(xì)胞氧化損傷及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)， EMT是PDR發(fā)展的關(guān)鍵[2-3]。去泛素化酶圓柱瘤蛋白(CYLD)為NF-κB 的主要負(fù)性調(diào)控因子和炎癥抑制因子[4]。藤黃酸(GA)是中藥藤黃的主要成分，具有抗炎、抗腫瘤細(xì)胞增殖等作用。Chen等[5]研究表明，GA可抑制DR病變過程中炎癥反應(yīng)。CYLD/NF-κB在高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞EMT中的作用以及GA能否抑制EMT過程尚未完全明了。本研究通過體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，基于CYLD/NF-κB信號通路，旨在探討GA對高糖狀態(tài)下人 PRE細(xì)胞EMT的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器ARPE-19 細(xì)胞株(美國 ADCC 細(xì)胞庫，CRL-2302)。1640 培養(yǎng)基(美國 HyClone 公司)；GA(中國瑞芬思生物公司)； CCK-8試劑盒、兔抗人磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB(p-NF-κB)多克隆抗體(中國萬類生物公司)；CYLD、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(中國博士德公司)。Mini-REPOTEANⅡ型電泳槽、Biocell 2010酶標(biāo)儀(奧地利Anthos Labtec Instruments公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀(美國UVP公司)；Leica4000B正置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 ARPE-19細(xì)胞傳代培養(yǎng)將ARPE-19 細(xì)胞快速復(fù)蘇后移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，在含體積分?jǐn)?shù) 5% CO2、37 ℃飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，觀察RPE細(xì)胞生長情況。當(dāng)RPE細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底面 80%左右時，以含EDTA的復(fù)合消化液消化，直至RPE細(xì)胞全部處于懸浮狀態(tài)。……