乳腺癌肺轉移前微環境形成機制及中醫藥干預研究進展

韓鴻寬，陶睿智，王愛云，2，吳媛媛，李曉曼，韋忠紅，陸 茵，2

(1．南京中醫藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2．南京中醫藥大學江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

2020年，據世界衛生組織國際癌癥研究機構統計結果顯示，乳腺癌超越肺癌成為全球發病率最高的癌癥[1]。乳腺癌是一種異質性疾病，根據分子以及組織病理特征可分為3種亞型：雌激素受體(ER)或孕激素受體(PR)陽性，人類表皮生長因子受體(HER)陽性、三陰型乳腺癌(ER-、PR-、HER-)。乳腺癌的發生發展到遺傳，環境等多種因素的影響。對于原發部位的乳腺癌，已有靶向藥物以及手術切除方法進行治療，而大多數乳腺癌患者往往因轉移而死亡。乳腺癌常見的轉移部位有肺臟、骨髓、肝臟等。乳腺癌對于特定器官轉移的傾向性受到乳腺癌分子分型的影響，其中以三陰性乳腺癌的肺轉移率最高。臨床上，其中大約60%～70%的乳腺癌患者因肺轉移而死亡。因此，探究乳腺癌轉移機制對于臨床上乳腺癌轉移患者的治療至關重要。

近年來，大多數研究都聚集在了PMN形成的機制研究上。PMN是由原發部位的腫瘤通過分泌腫瘤衍生因子，細胞外囊泡等到達腫瘤未來的轉移部位，并引發一系列有利于腫瘤生存定植的生物學事件，例如引起轉移部位炎癥、血管滲漏、募集骨髓來源細胞等從而改變轉移器官的微環境以適應循環腫瘤細胞的定植[2-3]。因此，PMN的形成在原發腫瘤進行遠端轉移的過程中具有重要作用。然而，PMN的形成機制較為復雜，受到多種細胞以及相關細胞因子的調控。因此，闡明PMN的形成機制對后續的抑制腫瘤PMN形成的治療是至關重要的。近年來，乳腺癌PMN的形成機制被不斷揭示，干預乳腺癌PMN也逐漸成為治療乳腺癌轉移的一種重要手段。中醫藥治療疾病具有多靶點、多環節的作用特點，目前使用中醫藥對多種疾病已有確切療效。在腫瘤發生發展的各個環節中，中醫藥的干預能起到主要或輔助治療作用。因此，中醫藥干預PMN的形成有望成為一種有效的治療手段。本文綜述了乳腺癌肺PMN的發生的機制以及中醫藥干預治療的研究進展，為后續的治療研究提供了思路。

1 轉移前微環境(PMN)

1889年，Piget的種子土壤假說表明腫瘤轉移依賴于種子(腫瘤)以及土壤(轉移器官微環境)相互作用，在之后的一個世紀里，相繼有學者發表不同觀點，James Ewing在1928年提出腫瘤轉移僅僅依賴于血液動力學，而在1976年Isaiah Fidler利用靜脈注射以及心內注射模型表明循環腫瘤細胞的轉移定植不僅取決于血液動力學的因素，腫瘤本身具有一定的轉移傾向性[4]。那么，在轉移過程中腫瘤與靶器官之間是否具有相互作用，其作用機制又是什么？直到2005年，Kaplan等[3]第一次提出了PMN這一概念，他們觀察到在LLC的皮內原位模型中，VEGFR1+的骨髓來源造血祖細胞比腫瘤率先到肺臟，并使肺中血管異常化從而為轉移提供有利的定植條件。同時，他們使用黑色素瘤的條件培養基與LLC細胞共孵育后再注射至小鼠體內時，LLC轉移到了黑色素瘤常見的轉移部位中，這凸顯出了腫瘤來源的分泌因子在腫瘤轉移器官傾向性中的重要作用。與此相符的是，近幾年來的大量研究都表明腫瘤來源的外泌體以及細胞外囊泡在PMN形成中的重要作用。

然而，腫瘤衍生因子(TDSF)在形成PMN過程中需要與靶器官中的多種細胞進行復雜的相互作用，以此使原本正常器官發生病變從而建立起PMN。PMN也具有6大特征，包括炎癥、免疫抑制、血管滲漏等。TDSF可以通過募集骨髓來源細胞，促使轉移靶器官中血管通透性增加以及介導炎癥信號來為之后的CTC定植提供有利環境。然而，不同類型的癌癥以及轉移靶器官導致PMN中的成分也各不相同，同時這也決定了PMN的形成機制也有所差異。因此，PMN的形成機制仍在不斷被研究之中。

2 乳腺癌肺PMN形成機制

乳腺癌的不同亞型具有不同的侵襲性，其中以三陰性乳腺癌(又稱基底樣乳腺癌)的侵襲性最強。同樣，乳腺癌的不同亞型也是乳腺癌具有不同器官轉移傾向性的主要原因之一，而三陰性乳腺癌細胞往往具有高肺轉移的特點。臨床上，大約有60%～70%的乳腺癌患者因診斷為肺轉移而發生死亡[5]。有研究表明[6]，肺轉移在ER+/PR+的乳腺癌患者占約21%，在HER2+乳腺癌患者占約25%，肺轉移在三陰性乳腺癌中更是占到了40%。但目前，不同乳腺癌分子分型在肺轉移的時間點以及轉移的分子機制目前仍未研究清楚。因此，需要充分了解乳腺癌肺轉移的機制以應對乳腺癌肺轉移。

2.1 血管滲漏肺作為一種血管網絡較為豐富的器官，是血液流通的重要樞紐，然而這也同樣為乳腺癌的轉移提供了便利。血管滲漏是PMN形成最早發生的生物學事件。血管通透性的增加是血管滲漏的重要標志之一。肺血管通透性的增加不僅有助于PMN的形成，也為腫瘤轉移外滲出血管促進肺定植提供了有利條件。研究表明[7]，乳腺癌分泌的miR-105靶向破壞肺微血管內皮細胞緊密連接蛋白ZO-1從而增加血管通透性促進乳腺癌肺轉移。Jiang等[8]利用4T1原位小鼠模型發現血清中升高的血管內皮生長因子VEGF誘導轉移前肺微血管緊密連接蛋白ZO-1破壞，該機制可能與VEGF-PKC途徑相關，使用貝伐單抗阻斷VEGF可逆轉其誘導的血管通透性增加。另一項研究發現，occludin 磷酸化/泛素化途徑也可能是肺PMN中VEGF誘導肺血管通透性過高的機制[9]。Liu等[10]發現原位乳腺癌誘導肺中總血管密度增加，體外使用VEGF可誘導小鼠肺微血管內皮細胞(MPVEC)中前列腺素E2(PGE2)的產生并增強4T1細胞的黏附。環氧合酶2(COX-2)抑制劑塞來昔布的治療顯著降低了4T1細胞對MPVEC的黏附，同時減少了癌癥轉移。

雖然使用VEGF等靶向藥物能夠逆轉PMN形成過程中所帶來的血管異常，但靶向藥物帶來的副作用同樣也是十分嚴重，并且臨床上目前單抗藥物并非有應用于治療轉移前微環境的方案。因此，單抗藥物靶向治療腫瘤轉移前微環境的有效性以及安全性仍然需要進一步的研究闡明。由于，中醫藥的治療具有毒副作用小的特點，針對靶點進行中藥的開發也不失為一項有前途的治療策略。

2.2 骨髓來源細胞(BMDC)骨髓來源細胞(BMDC)也是該形成過程中的重要角色，BMDC包括中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等。雖然以中性粒細胞、巨噬細胞為代表的骨髓來源免疫細胞是體內重要的炎癥細胞。但隨著單細胞組學技術的發展，BMDC的高度異質性已被闡明，不同表型的BMDC在腫瘤的發生發展中扮演了不同的角色，在PMN形成的過程中，BMDC被表明介導了PMN中的免疫抑制反應，通過釋放相關細胞因子如IL-10、Arg-1等抑制T、NK細胞的活化，從而抑制其抗腫瘤活性以促進轉移的腫瘤細胞逃避免疫殺傷。在臨床上，患者腫瘤微環境中的中性粒細胞以及巨噬細胞的浸潤與患者的不良預后相關。因此，BMDC目前已經成為了癌癥治療的一個重要靶點。

2.2.1VEGFR1+造血祖細胞(HPC) VEGFR1+造血祖細胞(HPC)是最早被發現在黑色素瘤以及肺癌模型中在PMN中募集的一類骨髓來源細胞。Meng等[11]在構建表達熒光素酶報告基因的MDA-MB-435s乳腺癌細胞小鼠肺轉移模型中也發現VEGFR1+CD133+的骨髓來源造血干細胞在肺中的募集增加，體內使用MMP-9、PDGFR-α和PECAM-1的特異性抑制可減少VEGFR1+CD133+HPC的向肺中的募集并減少乳腺癌肺轉移。

然而，此類骨髓來源細胞在乳腺癌肺PMN中的研究較少，大部分的研究仍然集中于腫瘤相關中性粒細胞以及巨噬細胞對于乳腺癌肺PMN的影響。但已有使用VEGFR1的靶向藥物治療轉移性結腸癌，因此，該類細胞也可能成為治療乳腺癌肺轉移的潛在靶點。

2.2.2腫瘤相關中性粒細胞(TAN) 中性粒細胞發源于骨髓造血祖干細胞，在骨髓中發育成熟后，其表面受體由CXCR4轉變為CXCR2(IL-8)受體，通過血液中CXCL8的趨化作用下釋放進入血液循環中。中性粒細胞是人體抵抗病原微生物感染的第一道防線，然而在腫瘤的發生發展中，腫瘤相關中性粒細胞(TAN)充當了雙面角色[12]。最早提出將TAN可以類似于巨噬細胞分為N1與N2表型的是Friedlander等[13]，N1型TAN通過直接或間接的細胞毒性發揮抗腫瘤活性[12]。N2型TAN通過DNA不穩定或細胞因子和趨化因子的釋放刺激免疫抑制、腫瘤生長、血管生成和轉移[14]。TAN在促進腫瘤PMN形成中的作用目前已被證實。在Ⅰ型干擾素信號受損的小鼠[Ifnar1(-/-)]的LLC以及4T1小鼠皮下模型中，肺部出現了大量TAN的積累，并伴隨著肺部Bv8、MMP9、S100A8 和 S100A9蛋白水平表達升高以促進PMN的形成。Wang等[15]通過在4T1原位乳腺癌小鼠模型以及MMTV-PyMT自發性乳腺癌肺轉移小鼠模型中發現了一類中性粒細胞群體CD62Ldim中性粒細胞，該類中性粒細胞能夠通過CXCL12/CXCR4軸特異性趨化至肺中形成乳腺癌肺PMN。在一項關于尼古丁暴露對乳腺癌PMN的影響實驗中，尼古丁的長期暴露通過誘導并募集促腫瘤N2表型的中性粒細胞促進肺PMN的形成，進而激活LCN2(一種來自N2型TAN的分泌糖蛋白)釋放，誘導轉移乳腺癌細胞MET過程，促進乳腺癌細胞在肺中的定植，使用紅景天苷能夠減少尼古丁暴露誘導的TAN的N2極化抑制其在PMN中的募集從而減少激素受體陰性的乳腺癌細胞肺轉移[16]。

TAN的募集同樣也受到原發乳腺癌細胞分泌的因子趨化作用的影響。在缺氧的原位乳腺癌腫瘤微環境下，其分泌的TDSF有助于骨髓來源的CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+粒細胞以及低細胞毒性的NK細胞在肺中的募集促進免疫抑制PMN的形成[17]。此外，有研究表明，原位乳腺癌分泌的氧甾醇通過募集N2型TAN從而促進肺PMN形成[18]。原位乳腺癌缺氧條件下誘導的酶碳酸酐酶IX(CAIX)通過刺激粒細胞樣的MDSC通過G-CSF募集至肺中形成PMN來促進轉移[19]。

因此，中性粒的表型對于乳腺癌肺PMN的形成至關重要，雖然已有多種靶向藥物抑制N2型TAN的趨化從而抑制乳腺癌肺轉移，但靶向藥物同樣也將N1型TAN的趨化抑制從而影響機體免疫。未來的研究應著重于如何精準靶向N2型TAN同時保留N1型TAN從而協同促進抗腫瘤轉移。此外，阻斷原位乳腺癌分泌的TDSF進而抑制TAN的募集趨化同樣也是一個潛在的治療靶點。

2.2.3腫瘤相關巨噬細胞(TAM) TAM目前已被報道通過多種機制促進乳腺癌轉移[20-21]，巨噬細胞在PMN中介導的免疫抑制反應是由于巨噬細胞的表型改變，在乳腺癌肺PMN形成過程中，CYP4A+TAM通過極化成M2表型并釋放TGF-β，VEGF和SDF-1增強VEGFR1+骨髓來源細胞在肺中的募集和成纖維細胞的活化[23]。因此，通過改變巨噬細胞的表型也可能是抑制PMN形成并抑制腫瘤遠端轉移的治療策略。

2.3 其他因素此外，乳腺癌肺PMN的形成與心理壓力也有關聯，在慢性不可預見性應激(CUS)造模的尾靜脈乳腺癌轉移模型小鼠中，使用β-腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素(ISO)處理小鼠能夠促進轉移前階段肺中巨噬細胞浸潤。該作用機制可能與ISO刺激上調了肺基質細胞中CCL2和單核細胞/巨噬細胞中 CCR2 的表達，導致巨噬細胞募集和浸潤到轉移前的肺中。對β-腎上腺素能信號通路的藥理抑制能夠顯著抑制壓力誘導的肺轉移[24]。在使用高脂飲食的乳腺癌原位小鼠模型中，使用甘草酸(GA)能夠改善腸道微生物組成以及抑制M1樣結腸巨噬細胞介導的LPS/HMGB2/NF-κB信號來抑制CCL2和TNF-α的產生，從而抑制Gr-1+骨髓細胞的遷移和S100A8/9的表達抑制肺PMN的形成[25]。

由此可見，在乳腺癌肺PMN的形成機制過程中，除了已被大部分研究表明的血管滲漏以及免疫抑制等機制之外，仍然存在著心理壓力，腸道菌群等因素的調控影響。這為后續的PMN的形成機制研究拓寬了思路，同樣也揭示了豐富的潛在治療靶點。

3 中醫藥干預肺PMN形成治療研究

中醫治療腫瘤PMN的理論始于2007年，大多學者認為中醫藥治療PMN符合“治未病”的中醫學術理論，中醫認為腫瘤PMN的形成是由于轉移靶器官“正虛”，以及受到“癌毒”侵擾以及具有“氣滯痰凝血瘀”的病理狀態。并提出以“扶正培本、清熱解毒、理氣祛痰，活血化瘀法”改善PMN，從而抑制患者腫瘤轉移，改善腫瘤患者的預后。

目前，已有報道中醫藥在干預腫瘤PMN中的治療作用。Tian等[26]通過對4T1原位荷瘤小鼠模型灌胃不同劑量的保元解毒湯發現，具有補氣血，增強免疫功能的保元解毒湯可以通過TGF-β/CCL9通路抑制具有免疫抑制功能的髓源抑制細胞(MDSC)在肺PMN中的積累從而延長了4T1荷瘤原位小鼠的生存時間并減少了腫瘤轉移。使用中藥消痞方能夠抑制乳腺癌PMN的形成從而抑制肺轉移，其機制是通過抑制M2型巨噬細胞上的CXCL1表達從而減少骨髓中的HSPC的募集以及其向MDSC的分化[27]。另一項研究表明使用中藥復方乳移平與桔梗聯用可以通過保護肺血管完整性來抑制纖維蛋白原的外滲，并中斷其與原位癌的相互作用，從而抑制炎癥性PMN的形成[28]。

乳腺癌肺PMN的形成機制復雜多變，受到腫瘤細胞、免疫細胞等多種細胞的互作調控，臨床上抑制乳腺癌肺PMN的形成目前也無任何靶向藥物的治療。中醫藥干預乳腺癌肺PMN的形成不僅符合中醫傳統理論，其相應的實驗研究也表明其具有一定的科學內涵。因此，利用中醫藥復方多成分，多環節，多靶點的整合調節作用的治療特點抑制乳腺癌肺PMN形成是一個具有前途的治療策略之一。

4 展望

臨床上，接受治療的乳腺癌肺轉移患者的預后仍然很差。大部分患者在確診腫瘤之后已經發生了遠端轉移。因此，對其的治療策略應該盡早進行診斷治療。腫瘤PMN的形成是腫瘤遠端轉移的重要先決條件之一，干預腫瘤PMN的形成也成為近幾年來治療腫瘤轉移的重要治療策略。臨床上，目前對于PMN的檢測缺乏有效的手段[22]，但已有報道在乳腺癌動物模型中使用基于抗體的單光子發射計算機斷層掃描(SPECT)在體內檢測以S100A8/A9 作為轉移前靶器官標記物的成像系統的應用以檢測PMN中的免疫微環境狀態[29]。這可能為后續應用基礎及臨床研究提供了方法。另外，通過3D生物打印技術構建體外腫瘤微環境，使得研究精準研究腫瘤轉移分子機制成為了可能，這也為臨床前藥物篩選提供了平臺。同時，這可能也為PMN的體外研究并為PMN的精準治療提供思路。

由于PMN的形成機制復雜，治療的難度也大大提高。最近，在自發性肺轉移的橫紋肌肉瘤小鼠模型中，有研究表明，可通過基因工程改造的骨髓來源細胞(GEMys)利用其歸巢特性將細胞因子IL-12遞送至肺部改善PMN從而減少腫瘤轉移，這為后續其他癌癥模型的PMN治療以及臨床應用奠定了基礎[30]。以多成分、多靶點治療為特點的中醫藥可能是干預PMN形成的治療策略，目前對于中醫藥干預PMN的形成機制主要在于重塑免疫微環境，以及保護血管通透性方面。然而，PMN也具有代謝異常等特點，同時，改善免疫抑制微環境不僅取決于減少以骨髓來源細胞介導的免疫抑制反應，同時也要激活T，NK細胞活化的相關的代謝途徑以促進其介導腫瘤殺傷效應。那么，一方面從改善PMN代謝的角度出發是否也能夠起到干預治療腫瘤PMN的效果？另一方面配伍改善代謝與免疫微環境重塑的中藥是否可能有協同起效的作用？因此，仍然需要繼續對中醫藥的療效進行深度挖掘并加以創新。此外，未來或許可能利用構建的體外PMN進行有效的中藥配伍成分的篩選。