MicroRNA在缺血性腦卒中發生發展及其診斷治療中的作用研究進展

楊利強 關欣 徐偉杰 武煜明 (昆明衛生職業學院，云南 昆明 650600；云南中醫藥大學)

腦卒中是一種腦血管病變引起的神經功能喪失的神經系統疾病，具有死亡率高、發病率高、致殘率高等特點〔1,2〕。我國現有1 100萬例急性腦缺血患者，且每年新發病約240萬例〔3〕。最新研究表明，腦卒中已成為我國居民致死原因第一位〔3〕。存活的患者中70%～80%有不同程度的神經功能缺陷，重度致殘者占40%，嚴重影響患者生活質量，加大了家庭和社會負擔〔4,5〕。因此，研究其發病機制及發病過程中人體生理的動態變化有重要意義。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的內源性非編碼小RNA。大量研究表明，腦內的miRNA表達水平變化與腦缺血發生過程具有一定的相關性，即miRNA參與缺血性腦卒中的病理發生發展過程〔6〕。本文綜合近年的相關研究，重點討論miRNA在缺血性腦卒中病理發生發展過程中的作用，為腦卒中新的治療方向提供一定的理論基礎。

1 miRNA的生物學特性

miRNA是一類由20～24個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈小分子RNA〔7〕。廣泛存在于真核生物體內，大量研究證實miRNA在各類物種中均具有高度保守性〔8〕。miRNA從生成到成熟涉及一系列步驟。miRNA首先在細胞核內通過RNA聚合酶Ⅱ作用轉錄形成具有帽子結構和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA，在核酸酶Drosha和輔助因子Pasha作用下pri-miRNA被加工處理成含有發夾結構，長60～70核苷酸的pre-miRNA〔9〕。pre-miRNA被RNA-GTP和exportin5從細胞核輸送到細胞質，然后在核酸內切酶ⅢDicer作用下剪切形成21～23 bp的成熟miRNA〔10〕。miRNA可以通過完全互補或部分互補靶向mRNA的3′-非編碼區(UTR)，誘導mRNA降解或抑制mRNA翻譯，在轉錄后水平調控靶基因的表達，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等生物體發育生長、衰老、死亡等過程〔11,12〕。目前，在人類基因組中已經證實約1 500個基因由miRNAs編碼，在不同的生理和生存環境下調節各種mRNA表達〔13〕。在生物體中，每個miRNA可以作用于多個靶基因，而多個miRNAs也可以共同調控同一個靶基因表達，因此，miRNA和靶基因在體內形成了一個復雜的調控網絡。

2 miRNA與缺血性腦卒中病理發生發展的相關性

缺血性腦卒中的發生發展機制較為復雜，是時間和空間上同時激活的級聯反應。具體機制主要包括大腦血腦屏障的破壞、神經炎癥反應的激活、自由基的氧化應激及細胞自噬、凋亡等一系列反應〔14〕。從病理發生發展的具體機制進行靶點阻斷，對缺血后神經功能的保護及腦功能區神經網絡的重塑具有重要作用，因此深入探尋miRNA與缺血性腦卒中病理發生發展的相關性對缺血治療策略具有重要的指導意義。

2.1miRNAs與血腦屏障 腦缺血發生后會引起基質金屬蛋白酶(MMPs)、水通道蛋白(AQP)等因子表達水平升高。MMPs是破壞血腦屏障(BBB)的關鍵成分，缺血性腦損傷發生后，由促炎性因子誘導產生，從而破壞BBB的完整性，導致缺血性損傷可能向出血性損傷轉變。研究證實miRNA-21、miRNA-105和miR-128在表達水平升高時會引起MMPs活化，導致其表達水平增加，促進腦水腫的形成，加劇腦損傷〔15,16〕。有研究表明，抑制腦缺血后miR-15a、miR-497表達水平，可以增加B細胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白水平和減少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性，從而減輕腦缺血后BBB的破壞和腦梗死體積，對神經功能缺損起到改善作用〔17,18〕。因此，深入研究miRNA與BBB兩者間的相互關系對腦缺血治療具有重要作用。

2.2miRNAs與腦缺血炎癥反應的關系 缺血發生后會激活神經炎癥反應并在之后的病理過程中持續產生影響。大量研究表明，炎癥反應是導致急性缺血階段腦損傷的重要因素之一，其中中性粒細胞的聚集、浸潤是炎癥反應激活的關鍵〔19〕。研究證實，miR-155和miR-328影響中性粒細胞的募集，同時通過負反饋調節影響中性粒細胞的吞噬作用、彈性蛋白酶的活性及活性氧(ROS)的產生，從而減輕了中性粒細胞的殺傷能力〔20,21〕。在急性缺血階段炎癥反應的爆發會引起谷氨酸、ROS、NO等有害因子的大量分泌，而體外研究表明，過表達miRNA-23A可減少氧化應激反應中產生的ROS，從而起到保護作用〔19〕。最近研究還證實，低氧誘導因子(HIF)-1可以調控低氧條件下miRNA-210表達水平，而miRNA-210能夠抑制呼吸電子傳遞鏈復合體Ⅰ中鐵硫蛋白的支架蛋白ISCU1/2的表達，因此可以通過調節呼吸電子傳遞鏈復合體Ⅰ的正常表達，從而調控缺血過程中ROS的產生來減少缺血損傷〔22〕。miR-124也可以調節小膠質細胞的生存狀態，使其從促炎狀態向抗炎狀態轉化〔23〕。這些miRNAs在炎癥反應中的作用均為臨床腦缺血治療中控制炎癥反應減輕神經損傷提供了更廣闊的思路。

2.3miRNAs與細胞凋亡 當腦部血流中斷時，缺血中心區域的營養和能量供應在幾分鐘內會消耗枯竭，從而導致缺血核心區的神經元出現不可逆的壞死性死亡。然而在缺血半影區和周邊區域的神經元會受到不同程度的缺血影響，呈現不同的命運。這個過程中會導致酪氨酸激酶(JAK)2、蛋白激酶B(AKT)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)等多種信號通路激活，調控下游相關凋亡基因的表達水平，從而影響神經元的凋亡〔24〕。研究證實，腦卒中后過表達miR-582-5p會通過激活蛋白酶活化受體(PRA)-1來調控神經元凋亡，而低表達miR-134可以通過調節靶基因HSPA12B表達來保護缺血再灌注損傷〔25〕。研究表明，在腦缺血再灌注損傷模型中注射miR-106b-5p拮抗劑可顯著降低體內由于自由基脂質過氧化產生的丙二醛對細胞的損傷作用，同時恢復超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加髓樣細胞白血病(Mcl)-1和Bcl-2蛋白表達水平，從而減少細胞凋亡的損傷〔26〕。體外實驗也證實，在PC12細胞中添加miR-106b-5p抑制劑增加了Mcl-1和Bcl-2表達水平，從而減輕了谷氨酸誘導的氧化損傷和細胞凋亡〔26〕。以上結果表明，在缺血缺氧過程中miRNAs可以通過調節細胞凋亡來減輕缺血損傷，這可能是一種潛在的神經保護機制。

2.4miRNAs與神經發生 腦缺血發生后會出現大量的神經元死亡，從而導致患者神經功能障礙。腦缺血后神經發生在時間和空間上是一個動態發展的過程，需要大量的神經生長因子和一系列信號通路的級聯反應參與。近年來的研究也表明，miRNA在胚胎的發育成熟、成體神經的發生及缺血性腦損傷后的神經發生過程中都發揮著重要的調控作用〔27〕。

研究發現，在嗅球、海馬和紋狀體等腦內再生能力旺盛的區域，由神經干細胞分化的新生神經元整合到現有神經網絡的過程中，被CREB上調的miR-132顯著促進突觸連接的形成和神經遞質傳遞〔28,29〕。體外研究也證實，高表達狀態的miR-132促進神經突的生長發育和新突觸的建立，而抑制miR-132的表達會導致樹突生長能力顯著減弱和突觸密度降低〔30〕。在大鼠原代皮層神經元中有20%～40%的miRNA表達可能受神經發育調節，同時，一些miRNA的表達水平(如miR-128、-191、-323、-324-5p、-326、-329和-344)顯著增加，和其在皮層神經發育中的表達趨勢一致〔31〕。在神經元分化(miR-23、-23b)和突觸形成中也發現了特異性表達的miRNA譜圖〔31〕。研究發現阻斷腦富集非編碼小RNA miR-124會引起腦室下區(SVZ)細胞保持分裂狀態，而miR-124的異位表達能夠促進早熟神經元分化〔32〕。在神經再生期間敲低內源性miR-124會導致增生的形成和神經元再生的延遲。鑒定發現Sox9是SVZ成神經細胞中miRNA-124的重要生理靶點，在SVZ細胞中過表達Sox9會抑制神經元的產生；相反，敲低Sox9基因則導致神經發生增加和神經膠質形成減少〔33〕。因此，我們應該增加腦缺血后通過調控相關 miRNA 的表達水平來干預或刺激神經發生來恢復腦卒中患者神經功能的研究，為腦卒中治療提供一種新的治療方向。

3 miRNAs在腦缺血診治過程中的應用

目前，在臨床上治療腦缺血疾病得到認可并有效使用藥物依然很少。組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)就是公認的能夠有效使用的溶栓藥物，但由于其在使用過程中有應用時間窗(3～6 h)要求，從而受到了極大的使用限制〔34〕。當前關于腦缺血疾病治療的研究主要集中在缺血核心區血流運輸的重塑及神經元的再生，然而血管重塑和神經元再生涉及的機制比較復雜，所以仍然需要我們積極深入探尋新的治療靶點。通過對急性缺血性腦卒中患者的血清進行miRNA芯片分析發現115種miRNA呈現差異性表達，其中hsa-let-7f、miR-126、miR-1259、miR-142-3p、miR-15b、miR-186、miR-519e、miR-768-5p表達下調及rno-miR-19b，rno-miR-290，rno-miR-292-5p表達上調〔35〕。用C57BL/6小鼠構建大腦中動脈栓塞(MCAO)模型研究腦缺血再灌注損傷后miRNAs變化時，發現缺血模型組有24種循環miRNAs表達豐度出現了上調，其中miR-1264、miR-1298、miR-448在再灌注3 h后表達量達到高峰，此后呈現逐漸下降趨勢，而在出血性模型組中循環miRNAs水平并沒有變化〔36〕。這些結果提示我們這些miRNAs不僅可以作為急性腦缺血診斷的生物學標志物，還可以成為潛在的治療靶點。

miRNA除了作為腦缺血診斷和預測的生物學標志物，對于腦缺血的治療也有一定意義。miRNA可以同時調控多個靶基因的表達水平，參與腦缺血病理發生發展過程的調節〔37〕，因此有望成為缺血性腦卒中治療的潛在靶點。目前，針對miRNA進行干預或影響主要是通過antagomi與miRNA強競爭性結合，阻止miRNA與其靶基因mRNA的互補配對，從而抑制miRNA發揮作用或使用miRNA mimics增強內源性miRNA的功能，從而提高其沉默作用。上述研究方法在體內體外實驗的成功驗證讓我們相信隨著研究的進一步深入，miRNA有治療缺血性腦卒中的潛力。

綜上，miRNAs在生物體內的基因表達網絡中起著重要的調控作用，參與了發育、內環境穩定及多種生理病理的反應和多種信號通路途徑的調節。缺血性腦卒中的病理發生發展和修復在時間、空間上是一個動態變化的過程，其中涉及BBB的破壞、神經炎癥反應、細胞凋亡、神經發生等。眾所周知，隨著miRNA的研究深入，其在疾病診斷治療應用中越來越廣泛，miRNA在缺血性腦卒中病理發生發展和修復過程中的研究也是目前的熱點之一。同時，miRNA由于其結構簡單易于合成，而且可以穿越BBB，并且在外周血清中穩定表達的特點，揭示了它在臨床疾病診斷和治療中的潛力，為其成為缺血性腦卒中臨床診斷的生物標志物和治療靶點提供了可能。