市售酸奶中發酵劑乳酸菌的耐藥性及耐藥基因研究進展

王煒哲，翟征遠，郝彥玲

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

0 引 言

抗生素使用導致的微生物耐藥已成為世界范圍內醫療健康、食品安全和經濟發展的最大威脅之一。用于人類及畜牧行業疾病治療的抗生素主要包括大環內酯類、氨基糖苷類、四環素類、喹諾酮類、β-內酰胺類和磺胺類等抗生素[1]。抗生素使用調查結果顯示，醫藥、農業和養殖等行業均存在著抗生素濫用現象，30%～50%的臨床病例中存在抗生素施用過量[2]；獸用抗生素僅有小部分被動物吸收代謝，30%～90%的抗生素最終隨動物排泄物排到環境中[3]，給臨床治療和環境中的細菌帶來選擇壓力，導致耐藥細菌的種類和數量不斷增加。國家農業農村部194號公告規定,2020年7月起企業停止生產含有除中藥外的促生長類藥物的商品飼料，中國飼料進入了無抗時代[4]。

近年來，由于觀察到抗生素耐藥基因在有益細菌和致病菌之間的水平傳播，人們對食源性乳酸菌及其抗生素抗性的重視程度不斷增加[5]，耐藥性研究也從臨床相關菌株擴展到食源性乳酸菌。國際上規定用于酸奶發酵劑等食品工業菌株需具有無致病基因、無毒性代謝物、無抗生素耐藥基因轉移潛力等生物安全特性[6]。然而，在中國、土耳其、俄羅斯多個國家市售酸奶中分離出的發酵劑乳酸菌已鑒定到多種抗生素抗性，多重耐藥率較高，同時部分菌株攜帶可轉移耐藥基因[7-9]。在乳制品生產加工過程中或人體腸道內，這些耐藥基因存在著向益生菌或致病菌轉移的潛在安全問題[10]。本文匯總了市售酸奶發酵劑乳酸菌耐藥表型、基因型及耐藥性轉移研究，明確了加強發酵劑乳酸菌抗藥性監測及耐藥基因轉移研究的重要意義[7]。

1 酸奶發酵劑乳酸菌耐藥性檢測方法及分布耐藥表型

1.1 乳酸菌耐藥性檢測方法

藥物敏感性實驗是體外檢測抗菌藥物對微生物有無抑制作用的方法，是目前實驗室及臨床常用的細菌耐藥性測定方法[11]，包括定性測定和定量測定。定性測定是通過測量固體培養基上抑菌圈的大小，判斷受試菌株耐藥情況，包括K-B紙片擴散法、打孔法、牛津杯法等[12]。定量測定包括稀釋法和E-test法，稀釋法通過測定乳酸菌在不同濃度藥物培養基中的生長情況判斷其最低抑菌濃度（MIC）或最低殺菌濃度（MBC），依據培養基不同又可分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法[12]；E-test法，通過讀取受試菌株抑菌圈與包被著指數梯度抗生素試紙條的交點處刻度，獲取最低抑菌濃度[11]。

針對乳酸菌耐藥實驗結果的判讀，美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）提供了乳桿菌及乳球菌碳青霉烯類、大環內酯類、糖肽類等抗生素的耐藥評判依據[13]。歐洲食品安全局（EFSA）提供了慶大霉素、鏈霉素和萬古霉素等8種抗生素的判定標準[14]。另外，歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）提供了腸球菌耐藥評判標準[15]。上述標準是目前乳酸菌耐藥性評判的重要依據[14]。

1.2 酸奶發酵劑乳酸菌耐藥表型

商業酸奶不同于自然發酵乳制品，其工業化生產中使用了商業發酵劑，為酸奶生產的品質控制提供保證。市售酸奶中除了應用最為廣泛的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌，嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等也常被用作益生菌添加入酸奶發酵劑。然而近年來，多個國家出現市售發酵乳制品中分離出的乳酸菌對抗生素存在耐藥性，發酵劑菌種的耐藥檢測及安全性評價成為研究熱點。

1.2.1 對抑制蛋白質合成抗生素的耐藥性分析

在抑制蛋白質合成的抗生素中，乳桿菌和嗜熱鏈球菌對氨基糖苷類抗生素具有較高的耐藥性，其中對卡那霉素和鏈霉素的耐藥最為廣泛[10,16,-17]。乳桿菌及嗜熱鏈球菌對四環素和氯霉素表現出不同程度的耐受情況，于濤等[18]利用紙片擴散法鑒定到31株乳桿菌中的四環素耐藥率為61.3%，25株嗜熱鏈球菌中四環素耐藥率為20.0%，而分離自北京市售酸奶的70株乳桿菌及30株嗜熱鏈球菌均表現四環素敏感[17]；Yang等[19]利用微量肉湯稀釋法鑒定到43株乳桿菌氯霉素耐藥率為58.1%，39株嗜熱鏈球菌氯霉素耐藥率為71.8%，而分離自邯鄲市售酸奶的48株乳桿菌氯霉素耐藥率僅為2.08%，43株嗜熱鏈球菌均表現為氯霉素敏感[19]。大部分乳桿菌和嗜熱鏈球菌對大環內酯類類抗生素表現為敏感，分離自邯鄲市售酸奶的48株乳桿菌分離株僅有2.08%對紅霉素耐藥，43株嗜熱鏈球菌均表現為紅霉素敏感[20]。

1.2.2 對抑制細胞壁合成的抗生素耐藥性分析

在抑制細胞壁合成的抗生素中，幾乎全部的干酪乳桿菌和植物乳桿菌表現為萬古霉素耐藥[20]，但大量的嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種為萬古霉素敏感菌株[19,22]。嗜熱鏈球菌對萬古霉素則表現出不同程度的耐受，Erginkaya等[8]對土耳其發酵乳制品中分離的乳酸菌進行耐藥分析，發現40%嗜熱鏈球菌為萬古霉素耐藥，而分離自廣州市售酸奶的乳酸菌中，僅有8%嗜熱鏈球菌為萬古霉素耐藥[10]。嗜熱鏈球菌和乳桿菌對β-內酰胺類抗生素，如青霉素、氨芐青霉素和頭孢呋定等敏感，例如，北京市售酸奶分離的37株乳桿菌和15株嗜熱鏈球菌對青霉素和氨芐青霉素均敏感[22-23]。

1.2.3 對抑制核酸合成的抗生素耐藥性分析

在抑制核酸合成的抗生素中，乳桿菌和嗜熱鏈球菌對喹諾酮類抗生素具有一定的耐受性，如環丙沙星、萘啶酸和達氟沙星等，其中環丙沙星耐藥比率最高。凡琴從17個品牌酸奶中分離的14株嗜熱鏈球菌和21株乳桿菌均表現為萘啶酮酸、環丙沙星、諾氟沙星、達氟沙星及多粘菌素E耐藥[7]。石磊等利用E-test法和紙片擴散法檢測發現分離自廣州市售酸奶的23株乳桿菌也表現為100%的環丙沙星耐藥率[10]。

1.2.4 對抑制葉酸合成的抗生素耐藥性分析

在葉酸合成抑制類藥物中，大部分乳桿菌對磺胺類抗生素表現為耐藥，Xu等[24]利用微量肉湯稀釋法對33株從酸奶分離的乳桿菌進行藥敏實驗，54.6%的菌株表現為磺胺甲惡唑耐藥。嗜熱鏈球菌對磺胺類抗生素顯現不同程度的耐受性，25株酸奶及發酵劑分離的嗜熱鏈球菌耐藥分析發現22.27%的菌株表現為復方新諾明耐藥[25]，而分離自紹興市售酸奶的嗜熱鏈球菌對復方新諾明全部表現為敏感[26]。

2 酸奶發酵劑乳酸菌耐藥基因的攜帶情況

乳酸菌的耐藥表型與其攜帶的耐藥基因具有相關性，且攜帶耐藥基因本身就會給乳酸菌的安全應用帶來風險[12]。研究人員利用分子生物學方法，如耐藥基因PCR擴增、DNA微陣列和全基因組測序等從市售酸奶分離乳酸菌中鑒定到多種耐藥基因[27]。

2.1 糖肽類和喹諾酮類的耐藥基因

萬古霉素是糖肽類抗生素，能夠與敏感菌株細胞壁前體五肽D-丙氨酰-D-丙氨酸以氫鍵連接，從而阻斷肽聚糖的聚合，而在抗性菌株中D-丙氨酰-D-丙氨酸被D-丙氨酰-D-絲氨酸或D-丙氨酰-D-乳酸取代，導致萬古霉素結合能力下降[28]。大多數乳桿菌具有編碼D-丙氨酰-D-絲氨酸連接酶vanE基因[21]和D-丙氨酰-D-丙氨酸水解酶的vanX基因[28]。D-丙氨酰-D-丙氨酸水解酶VanX與D-乳酸脫氫酶、羧肽酶、D-丙氨酰-D-乳酸連接酶協同將細菌細胞壁五肽末端修飾為D-丙氨酰-D-乳酸[29]。

環丙沙星是喹酮類抗生素，通過抑制DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的功能，阻斷DNA復制發揮抑菌功能[30]。Jiang等從酸奶分離的環丙沙星抗性乳桿菌中，編碼DNA促旋酶和拓撲異構酶IV的基因gyrA和parC發生突變，導致抗生素與靶位點的結合能力下降，菌株表現為環丙沙星耐藥[31]。

2.2 氨基糖苷類和四環素的耐藥基因

慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素是氨基糖苷類抗生素，通過與敏感菌株核糖體30S亞基A位點結合，干擾細菌蛋白質合成[32]。氨基糖苷類抗生素耐藥基因以編碼修飾酶為主，通過對抗生素的修飾，降低其與核糖體結合能力，從而產生耐藥性。aph（3′）IIIa編碼磷酸轉移酶介導卡那霉素抗性[33]。aac(6′)-aph(2′′)編碼雙功能復合酶，既有6'乙酰轉移酶，又有2'磷酸轉移酶活性[34]，介導慶大霉素抗性[35]。ant(6)編碼核苷轉移酶在鏈霉素耐藥中占主導地位，此外，酸奶發酵劑菌株中還發現了其他鏈霉素耐藥基因，如氨基糖苷-3-磷酸轉移酶基因strA、氨基糖苷-6-磷酸轉移酶基因strB、氨基糖苷腺苷酸轉移酶基因aadA和aadE[19,25,36]。

四環素類抗生素通過阻礙氨酰-tRNA與核糖體A位點的結合來抑制蛋白質合成[37]。四環素耐藥基因種類繁多，包括編碼核糖體保護蛋白的tetM、tetO、tetS、tetW和編碼外排泵的tetK、tetL等抗性基因[17,19,22]，其中tetM、tetS、tetK和tetL是酸奶發酵劑乳酸菌中常見的四環素耐藥基因。

2.3 大環內酯類和磺胺類抗生素的耐藥基因

紅霉素是大環內酯類抗生素，當紅霉素與敏感菌株核糖體23S rRNA結合時，tRNA轉位受到干擾，新生肽鏈的延伸被阻斷[38]。市售酸奶中分離到的編碼紅霉素抗性的主要基因為ermB和mefA[36]。ermB編碼rRNA甲基化酶，在乳酸菌紅霉素耐藥中占主導地位，該酶催化23S rRNA的2058位腺嘌呤核苷酸甲基化修飾，使紅霉素與靶位點的結合能力下降[39]。mefA編碼紅霉素外排泵系統，通過將菌體內的紅霉素排出體外，提高菌體對紅霉素的抗性。

磺胺類藥物，利用對氨基苯磺酸與氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，阻斷細菌中二氫葉酸的生物合成[40]，其增效劑甲氧嘧啶可抑制二氫葉酸還原酶活性。酸奶發酵劑乳酸菌中鑒定到，突變的二氫葉酸合成酶基因sulI和sulII使抗生素與靶位點的結合能力降低，菌株表現為磺胺類抗生素耐藥[18-19]。突變的二氫葉酸還原酶基因drfA和drfD能夠介導一定水平的甲氧芐啶耐藥性，在酸奶乳桿菌分離株中均有鑒定[21,41]。

此外，乳酸菌耐藥研究中發現耐藥表型與耐藥基因型之間存在著不一致性。部分對某種抗生素敏感的乳酸菌也可能攜帶與其相關的耐藥基因。秦宇軒等[17]用PCR特異性擴增結合測序的方法在紅霉素和四環素敏感的乳酸菌中檢測到相應的耐藥基因，這種潛在的耐藥基因無法與耐藥表型相關聯，更容易在安全性評價中被忽視，使食源性乳酸菌成為耐藥基因的蓄水池。與之相反的是，部分耐藥乳酸菌未鑒定到對應的耐藥基因，研究人員對乳酸菌的耐藥研究多借鑒臨床致病菌的機制，而乳酸菌對某些抗生素的耐藥機制可能與病原菌不同，使得其耐藥基因未被探明，研究人員需進一步針對乳酸菌研究其耐藥機制，為乳酸菌的安全性評價提供理論依據。

3 乳酸菌耐藥性轉移

微生物耐藥性可以分為固有耐藥和獲得性耐藥。固有耐藥是指依靠自身基因組包含的耐藥基因而具有對某類抗生素的抗性，其耐藥性能夠穩定遺傳[42]。獲得性耐藥分為菌體基因自發突變[9]和通過轉座子或質粒等移動元件[25]水平轉移兩種方式，其中水平轉移是耐藥基因獲得的主要途徑[43]。

氨基糖苷類抗生素是乳桿菌和嗜熱鏈球菌固有耐藥，萬古霉素、喹諾酮類及磺胺類抗生素同樣列入乳桿菌固有耐藥，而四環素和紅霉素耐藥基因常與乳酸菌質粒及轉座元件有關。具有固有耐藥性的乳酸菌理論上是安全的，但是區分基因層面的固有性和獲得性耐藥非常困難，判斷一株菌株對某種抗生素是否為固有耐藥的最準確的方式是研究其耐藥基因是否會發生傳遞，因此乳酸菌的耐藥基因是否轉移是研究者們評價乳酸菌安全性的重點內容，研究已發現一些乳酸菌的幾種抗性基因可在乳酸菌與乳酸菌、乳酸菌與病原菌之間發生傳遞，所以完善針對商業菌種的耐藥性安全評價已刻不容緩。

乳酸菌耐藥基因轉移性研究主要采用體外試驗，濾膜結合法是常用的體外結合轉移的方法。Yang等[19]利用濾膜接合法將四環素耐藥基因tetM和tetS分別從德氏乳桿菌保加利亞亞種和植物乳桿菌轉移到單增李斯特菌L82，轉移率為7.3×10-7～2.9×10-6；Nawaz等[22]通過濾膜結合轉移實驗發現分離自發酵乳制品的發酵乳桿菌MWL24的ermB基因，能夠轉移至糞腸球菌181，轉移率為2.62±0.81×10-5;植物乳桿菌MWL22的tetM基因，能夠轉移至糞腸球菌181，轉移率為1.39±0.06×10-5。乳酸菌抗性基因體內的轉移性研究目前較少，Feld等[45]檢測到位于植物乳桿菌中質粒p LFE1上的ermB可在無菌小鼠體內實現向糞腸球菌的轉移，而在無特定病原體（SPF）小鼠中未發現水平轉移[45]。同樣從酸奶發酵劑分離的紅霉素抗性的德氏乳桿菌保加利亞亞種，攜帶有編碼外排泵蛋白的msrC基因。但在SPF級裸鼠腸道也未檢測到msrC基因轉移[46]，作者推測腸道微生物群落可能作為保護屏障，發揮抑制耐藥性轉移的作用。Toomey等[47]發現在發酵乳基質中乳酸乳球菌477的四環素耐藥基因tetM能夠轉移至乳酸乳桿菌BU-2-60中，表明在發酵乳等食品基質中耐藥基因也能夠在不同的細菌間進行水平轉移。

4 結論

乳酸菌耐藥性像一把“雙刃劍”，一方面能夠提高菌體在含有抗生素的環境中的存活率，另一方面也存在耐藥基因向食品或腸道中其他微生物轉移的風險，導致耐藥基因的傳播。食品、微生態制劑生產菌株的安全性是食品安全的重要保障，歐洲食品安全局（EFSA）強調[14]野生菌株到工業菌株的審批流程中應將抗生素敏感性測定作為必要的安全性指標，同時應對申報菌株的耐藥基因及其可移動性在實驗室水平和實際生產條件下進一步探究，并以長期安全性為原則，在菌株使用中及時監測其耐藥性的變化，將風險降到最低。此外，鑒于乳酸菌在治療抗生素相關性腹瀉上已得到臨床證明，乳酸菌固有耐藥性的研究也為臨床抗生素優化施用提供新思路[48]。固有耐藥的益生菌株和抗生素聯合施用，實現藥物殺菌和菌群抑制的協同作用，既減少了抗生素的用量又為抗生素使用后腸道菌群恢復提供了益生菌補充。