糧食真菌群落組成及多樣性研究進展

祁智慧， 張海洋， 田 琳， 唐 芳

(國家糧食和物資儲備局科學研究院1，北京 100037) (糧食儲運國家工程實驗室2，北京 102209)

自然界中真菌無處不在。真菌群落組成是指在一定時間和空間內分布的真菌物種種群集合及種類組成。真菌多樣性是指在一定時間和一定區域內所有真菌物種及其遺傳變異和生態系統的復雜性總稱，包括物種多樣性、遺傳多樣性、和生態系統多樣性[1，2]。研究糧食真菌群落組成及多樣性，就是研究糧食在一定的時間或空間內，寄附或生長在其表面或內部的真菌種類組成，活動狀態及遺傳變異等情況。這與糧食行業中早期提到的糧食真菌區系調研所要完成的工作有相似之處，但研究結果更加深入。糧食作為食物到達消費者餐桌，要經歷田間生長、收獲、運輸、儲藏、加工等多個環節。若處理不當，任何一個環節都會為真菌生長繁殖創造有利條件，從而在糧食表面或內部形成真菌群落[3]。例如，糧食作物在田間生長時，當氣候條件適宜，空氣和土壤中的微生物便會不同程度地侵染糧食作物，引發病害導致減產，有些甚至產生真菌毒素[4]。糧食收獲后會攜帶大量田間真菌進入儲藏環節，初步形成糧食真菌群落。在儲藏期間，糧堆作為一個復雜的生態系統，糧倉微環境的變化可為儲藏真菌的萌發生長提供條件，從而改變糧食的真菌群落組成。部分儲藏真菌物種的大量繁殖會導致糧堆發熱霉變，真菌毒素積累，嚴重影響儲糧安全[5，6]。由此可見，無論自然傳播或人為操作，真菌對糧食的污染難于避免[7]。

糧食上真菌的種類、活動狀態與糧食質量和衛生安全密切相關[3]。有些真菌物種能引起糧食品質劣變[8，9]，而有些能產生真菌毒素嚴重影響食品衛生安全[10]。據報道，在歐洲和一些發展中國家，每年由于真菌污染導致的糧食生產損失超過10%[11]。因此，深入研究糧食真菌群落組成以及變化規律，是保障糧食品質優良和食品衛生安全的基礎前提。我國自20世紀50年代開始重視糧食微生物的研究，歷時半個多世紀，從最初的翻譯國外文獻到系統研究國內糧食微生物區系，從傳統的微生物培養鑒定方法到分子系統學及生物信息技術的應用，我國糧食微生物研究逐漸深入，且更加系統規范。本文對我國糧食真菌群落組成及多樣性研究進展進行綜述，初步探討了真菌群落組成及多樣性與真菌毒素污染的關系，為后續糧食微生物的深入研究提供參考。

1 糧食真菌分類

糧食微生物研究中常用“霉菌”代表糧食上常見的真菌類群[12]，霉菌是絲狀真菌的通稱，不是分類學上的名詞，在分類上屬于真菌界的各個門。糧食真菌包括酵母和絲狀真菌，其中酵母所需水分活度較高，在糧食中分布較少，而絲狀真菌在糧食中分布廣泛，研究較多，這也是部分研究者用“霉菌”一詞的主要原因，而本文使用現代分類系統中“真菌”進行后續綜述。

研究糧食真菌群落組成，首先要明確真菌分類。真菌的分類系統十分復雜，且不斷發展演替。早期糧食真菌的分類系統以真菌研究學術界采用最為廣泛的Ainsworth分類系統為主[13]。隨著分子系統學的建立與發展，真菌分類更為客觀高效，現代真菌分類系統也隨之建立[14, 15]，一些糧食真菌的分類地位也隨著真菌分類學的發展而發生改變，因此，近些年糧食真菌物種分類地位和名稱變化較大，需對其進行系統研究，且進一步規范化。

為了便于描述糧食從田間收獲到儲藏期間真菌群落組成的變化，研究者對糧食真菌進行了劃分。早期Christensen[16]根據糧食真菌的侵染環節及對水分含量的需求，將其分為田間真菌和儲藏真菌。后期陸續有研究人員在此基礎上結合糧食收獲前、收獲期和收獲后環節及真菌生長適宜水分活度(Aw)范圍，將糧食真菌分為3種主要類型：田間真菌指親水型的植物病原真菌，主要在糧食作物田間生長或收獲期侵染糧食籽粒，如附球菌屬Epicoccum、鐮孢菌屬Fusarium和鏈格孢屬Alternaria等；過渡真菌：對水分活度要求相對寬泛，以腐生和嗜熱真菌為主，主要在收獲前后污染谷穗或受傷的植株，如毛霉屬Mucor、枝孢屬Cladosporium和根霉屬Rhizopus等；儲藏真菌為嗜旱真菌，對水分活度要求相對低，主要在糧食儲藏期間侵染糧粒，如曲霉屬Aspergillus和青霉屬Penicillium等[17]。將糧食真菌分為3種類型，充分體現了環境因素對糧食上優勢菌的決定性作用，是糧食真菌群落組成及演替規律的研究基礎，對后續研究起到很好的指導作用。

2 真菌對糧食造成的危害

長期以來國內外研究者非常關注真菌對于糧食造成的危害。糧食上真菌污染產生的危害主要體現在兩個方面，一是對糧食質量的影響，二是產生真菌毒素威脅食品衛生安全。真菌污染對糧食質量的影響主要包括：種子退化、變色、干物質損失、氣味異常、霉變發熱等。具體表現為真菌侵染糧粒能使糧食種子喪失活力，發芽率降低。種子胚部營養豐富且種皮最為薄弱，易受真菌侵染，Prom[18]發現彎孢屬Curvularia和鐮孢菌屬Fusarium物種侵染與種子發芽率下降之間存在高度相關性，Moshiur 等[19]也發現玉米種子的發芽率下降與籽粒上的真菌之間存在密切聯系；真菌感染谷粒的穎片或內核是引起糧食變色的主要原因，稻平臍蠕孢Bipolarisoryzae、禾谷鐮孢Fusariumgraminearum、稻梨孢菌Pyriculariaoryzae、稻黑孢霉Nigrosporaoryzae和黑色附球菌Epicoccumnigrum等均能引起糧食變色[20, 21]；引起糧食干物質損失，真菌生長要消耗糧食籽粒上營養成分，進而導致質量損失[22]，掃描電子顯微鏡顯示真菌菌絲能滲透到小麥胚乳中，代謝產生蛋白酶和淀粉酶，降解營養成分(淀粉和蛋白)為己所用，從而加速干物質損失[23]；產生霉變氣味，真菌在富含營養物質的基質(例如谷物)上生長時會產生揮發性化合物，20世紀70年代，研究人員證明腐生真菌會產生揮發性物質，引起糧食霉變異味[24]；引起糧堆霉變發熱[25]，真菌生長會呼吸產生熱量，熱量在糧堆中聚集后，會引起糧堆溫度升高。高溫會使糧食脂肪酸值等指標發生變化，加速品質劣變[26]，Sinha等[27]研究表明，環境溫度為-5 ℃時，真菌快速生長繁殖釋放的熱量可能導致谷物溫度升高至64 ℃。

糧食部分產毒真菌生長能產生具有強烈毒性和致癌性的真菌毒素，可通過食入、吸入或皮膚接觸進人體內，威脅人類的身體健康，造成嚴重的食品衛生安全問題[28]。聯合國糧農組織估計，全世界谷物供應的25%受真菌毒素污染[29]。糧食中常見的真菌毒素主要是由曲霉屬Aspergillus、鐮孢菌屬Fusarium和青霉屬Penicillium物種產生的黃曲霉毒素(Aflatoxins, Afs)、伏馬毒素(Fumonisins, FBs)、嘔吐毒素(Deoxynivalenol, DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenon, ZEA)等[30, 31]。其中一些真菌毒素的毒性較強，具有致命性且化學性質穩定，給人類造成的損失和危害難以估量[32]。為確保食品衛生安全，歐盟委員會對真菌毒素水平進行了嚴格的限制。研究不同階段糧食真菌群落組成及多樣性，了解真菌污染情況，提出真菌及真菌毒素污染精準防控策略，對于保障糧食品質優良，確保食品衛生安全具有十分重要的意義。

3 糧食真菌群落組成及多樣性研究發展歷程

我國早在20世紀50年代開始重視糧食微生物的研究，已歷時半個多世紀。最初糧食微生物研究以梳理和翻譯國外研究結果為主，80年代首次針對我國糧食真菌區系進行了全面系統的調研。隨著研究技術和手段的不斷更新，從傳統的培養及表觀形態學鑒定，到分子測序分析及生物信息技術的應用，研究結果從簡單的真菌區系調研、分類、鑒定，發展到真菌群落組成與環境因子、真菌毒素等相互關系的復雜研究。隨著研究不斷深入，對于真菌及真菌毒素的精準防控更加具有指導意義。

3.1 基于傳統形態學鑒定的研究

我國科學家20世紀80年代初首次全面開展糧食微生物的研究，對主要糧食作物小麥、稻谷、玉米等微生物區系進行系統的調研[33]。此次調研參考了國外對于糧食真菌的分類，以真菌區系調研為主，分離的菌株約50屬，182種[33]。稻谷中分離的真菌約30屬，84種，優勢菌26種[34]。小麥中分離鑒定的真菌為30屬，101種[35]。玉米中分離鑒定的真菌為15屬，60種[36](“種”指菌株種類的數量，很多菌株未鑒定到物種水平)。調研結果顯示糧食上常見的田間真菌主要包括枝孢屬Cladosporium、鏈格孢屬Alternaria、鐮孢菌屬Fusarium和附球菌屬Epicoccum等，儲藏真菌主要包括曲霉屬Aspergillus、青霉屬Penicillium、根霉屬Rhizopus和毛霉屬Mucor等[33]。全國范圍內的調研結束后，陸續有科研人員選取我國特定的省份，針對單一糧倉研究糧食真菌區系[37, 38]，分析不同儲藏條件下真菌群落組成的變化，結果發現在黃熟期和新收入庫的糧食上以田間真菌為優勢菌，腐生的儲藏真菌極少，儲藏2年后，田間真菌減少直至消失，儲藏真菌逐漸增加，而后又減少[34, 39]。

這一時期的真菌區系調研，主要采用純培養獲得菌株，基于傳統形態特征比對進行菌種鑒定，受當時菌種鑒定資料及鑒定技術限制，只有部分分離株鑒定到種，大部分的分離株只能鑒定到屬，田間真菌和儲藏真菌群落組成的研究結果最終以種、屬混合列出。而且，真菌群落組成與環境因子關聯密切，時隔30多年，我國糧食種植環境、耕種習慣、收儲條件以及氣候因素等均發生了較大變化。因此，有必要重新對全國糧食真菌的群落組成及多樣性進行詳細研究。

3.2 基于形態學和分子生物學鑒定的研究

隨著分子生物學的發展，真菌物種的基因數據庫不斷擴充完善，利用核酸序列構建系統發育樹使真菌的分類和鑒定更加客觀高效。近些年，糧食行業研究人員逐漸將真菌的分子系統分析方法引入到糧食真菌研究中。都立輝等[40]研究了淮稻5號的真菌群落組成，對稻谷原糧上分離培養得到的菌株，在傳統形態學鑒定的基礎上，選擇內轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer，ITS區)及 28S rDNA 兩種基因片段比對，將大部分菌株鑒定到種水平并構建了系統發育樹，明確了物種之間的親緣關系。葛志文等[12]以湖南和湖北倉儲稻谷為研究對象，對稻谷儲藏期間主要優勢菌進行了分離純化，通過觀察其形態特征，結合ITS區分子測序結果，明確湖南和湖北倉儲稻谷的主要優勢菌為黃曲霉Aspergillusflavus、黑曲霉A.niger、亮白曲霉Aspergilluscandidus和灰綠曲霉Aspergillusglaucus等。祁智慧等[41]基于形態學和分子生物學鑒定首次對我國13個稻谷主產省收儲環節的稻谷系統的開展真菌組成和多樣性的調研，共分離到600多株菌，這些菌株分屬于17屬，73個物種。研究發現北方地區收獲期稻谷主要優勢菌為芽孢狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和Cladosporiumanthropophilum(暫無明確中文名稱)，南方收獲期稻谷主要優勢種為黃曲霉A.flavus和黑曲霉A.niger。進入儲藏期后，儲藏微環境相對穩定，耐旱真菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans成為優勢菌。南方收獲期感染的黃曲霉A.flavus和黑曲霉A.niger(主要產毒真菌)進入儲藏期后仍保持優勢比例，導致儲藏期間潛在的毒素污染風險增加。針對收獲和儲藏環節真菌群落組成的研究及優勢菌分析，能夠準確了解糧食真菌污染情況，有利于對糧食真菌及真菌毒素污染危害進行風險評估。

3.3 基于高通測序技術的研究

3.1和3.2提到的研究，均是基于純培養方法獲得樣品中可培養真菌的群落組成，然而，自然界中還有大部分真菌是不可培養的或在某種培養條件很難生長。隨著分子生物學的不斷發展，高通量測序技術(High-throughput Sequencing, HTS)有效解決了大量不可培養真菌物種的難題。通過對樣品中全部微生物基因組測序，結合環境因子等多種影響因素，采用生物信息分析方法，可對糧食微生物的群落組成及多樣性進行深入研究。近幾年，基于HTS研究糧食真菌組成及多樣性已經得到應用。

徐圓程等[42]基于HTS研究儲藏稻谷中的真菌群落結構與優勢菌，結果顯示稻谷中的優勢種不僅包含黃曲霉A.flavus等常見的菌種，同時還包括糧食中鮮有報道的物種，如球孢白僵菌Beauveriabassiana和小孢暗球腔菌Phaeosphaeriamicroscopica等。Chai等[43]通過高通量16S rRNA和ITS區擴增子測序分析儲藏條件對稻谷微生物群落結構的影響，進一步證實儲藏溫度和水分對稻谷中微生物群落的活動影響明顯，嚴控儲藏條件是防止稻谷儲藏過程中霉變的有效措施。岳曉禹等[44]應用HTS研究小麥在儲藏過程中真菌群落的變化，明確儲藏時間和糧堆深度是影響小麥真菌生長和演替的主要因素。Solanki等[45]采用HTS研究了磷化氫熏蒸對于小麥真菌菌群組成和多樣性的影響，全面闡述了熏蒸在抑制霉菌生長方面的作用和局限性。本課題組通過HTS對全國13個主產區稻谷的真菌群落組成與環境因子之間的關系進行系統分析，發現冬季平均溫度、年平均降雨量和收獲季節的風速是影響真菌群落組成的主要因素。

利用高通量測序技術從基因組水平上研究真菌組成及多樣性，打破了傳統培養鑒定的限制，獲取信息量大，通過生物信息學分析，可以深入研究糧食真菌群落組成差異及環境因素之間的關系，為產毒真菌及真菌毒素污染精準防控提供了新的思路。

4 糧食真菌群落組成與真菌毒素污染的關系

真菌毒素是由真菌產生的次級代謝產物，是真菌在競爭空間資源和營養物質時，作為抗菌素抑制其他物種生長的手段[46]。糧食上不同的真菌群落組成，產生真菌毒素種類和數量存在差異[47]，而真菌群落組成受氣候條件、土壤、地理位置等多種因素影響[48，49]。MüllerF.graminearum[50]研究表明，禾谷鐮孢與細極鏈格孢Alternariatenuissima共同生長時，細極鏈格孢A.tenuissima產毒能力顯著降低；黃色鐮孢Fusariumculmorum與細極鏈格孢A.tenuissima共同生長，黃色鐮孢F.culmorum產DON和ZEN的能力明顯提高。Giorni等[51]研究黃曲霉A.flavus、禾谷鐮刀菌F.graminearum、串珠鐮刀菌F.verticillioide3種產毒真菌共同生長對單個真菌產毒能力的影響，發現兩種鐮孢菌產毒能力會受黃曲霉A.flavus影響大幅降低，而黃曲霉A.flavus產毒能力不受影響。Neme[52]在研究糧食儲藏期間環境因子對真菌生長及產毒情況影響時，提出了自然界中真菌以共生與競爭兩種模式共存，共生過程中通過改變代謝途徑產生真菌毒素以提高競爭力，不同的真菌組成會影響產毒情況。糧食在田間、收獲及儲藏期多個環節都可能感染真菌。氣候及農耕習慣(土壤)等條件差異會引起的糧食真菌組成的差異，進而影響到產生真菌毒素的種類及積累量[53，54]。Edwards[49]的研究也表明，糧食上真菌毒素污染情況不僅受氣候條件(環境溫濕度)的影響，還受土壤環境中真菌種類、數量及分布的影響，主要因為土壤真菌組成會影響糧食真菌組成。

由此可見，真菌毒素的污染程度與真菌物種組成及環境因子之間存在復雜的關系。真菌毒素污染的預測，除了考慮環境氣候條件、成熟期溫濕度及產毒真菌的產毒能力外，還應該考慮真菌群落組成，真菌共生與競爭的生物驅動因素，這樣可以進一步提高毒素污染預測的準確率。

5 糧食真菌群落組成及多樣性的研究應用

真菌物種之間以共生與競爭兩種模式共存，有些真菌物種之間通過競爭可抑制產毒真菌生長，降低真菌毒素含量，在毒素的生物防控方面發揮重要作用[55, 56]。在真菌毒素生防菌研究中，木霉屬Trichoderma真菌具有很大的拮抗潛力，可抑制產毒真菌的生長，降解真菌毒素，其中綠色木霉Trichodermavirens抑制黃曲霉A.flavus生長降低黃曲霉毒素(AFs)含量效果良好[56]，棘孢木霉T.asperellum能抑制串珠鐮刀菌F.verticillioide的生長。木霉屬Trichoderma一些物種不但能抑制的禾谷鐮刀菌F.graminearum生長，還能降解玉米赤霉烯酮(ZEN)[57, 58]。讓不產毒素的黃曲霉A.flavus分離株與產毒素的分離株競爭抑制，是目前用于減少玉米和花生中AFs污染廣泛使用的生物防治方法，防治效果明顯[59]。

生物防控技術是化學藥品有效替代品之一，在控制田間有害真菌發生，減少谷物真菌毒素污染中發揮著重大作用。在研究糧食真菌群落組成及多樣性時，從全國糧食主產區收集糧食樣品，采用傳統的分離培養法獲得大量真菌菌種資源，結合形態學和分子生物學進行真菌物種鑒定，構建菌種資源庫。同時運用高通量測序技術獲得糧食上覆蓋全部真菌群落的基因信息，進行生物信息分析，研究不同地區、不同環節糧食上真菌物種的共存模式及物種之間的競爭拮抗關系，為真菌毒素的生物防控菌種的篩選提供一個新的途徑。

6 結語

我國糧食真菌研究始于20世紀50年代中期，60年代初通過翻譯國外研究資料，編著了糧食微生物學的專著教本，20世紀80年代初對全國范圍內主要糧種的真菌區系(群落組成及多樣性)進行了系統的調研和匯總整理，為我國糧食微生物研究奠定了基礎。但早期受研究方法及技術的限制，真菌組成以種、屬并列形式給出，結果不夠精準和深入。進入21世紀后，隨著分子技術的快速發展和應用，研究技術手段逐步增加，可以從基因層面全面系統的研究糧食真菌組成，研究結果更準確。隨著生物信息分析學的發展，使得糧食真菌群落組成差異及其影響因素的深入研究成為可能，使我國糧食真菌群落組成及多樣性的研究邁入新階段，為糧食真菌毒素污染精準防控及生防菌株篩選開拓了新路徑。