蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亞細胞定位及表達特征分析

摘要：Delta24-甾醇還原酶（Delta24-sterol reductase，DWF1）是油菜素內酯（Brassinosteroide，BR）合成途徑中的關鍵酶，在植物生長發育中起著關鍵性的作用。為了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中的功能，本試驗從蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全長序列，該基因開放閱讀框（ORF）1 704 bp，編碼567個氨基酸，分子量65.911 kD，理論等電點為8.53。亞細胞定位顯示，該蛋白定位于細胞質內。進化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白與鷹嘴豆（Cicer arietinum）、紅三葉（Trifolium pratense）及豌豆（Pisum sativum）親緣關系較為接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、莖、葉中均有表達，在莖和葉中的表達水平較高。外源激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）能夠明顯提高MtDWF1表達，水楊酸（Salicylic acid，SA）能夠顯著降低MtDWF1表達水平。同時，經油菜素內酯誘導后，MtDWF1表達水平整體呈現增加趨勢。本研究為進一步探索MtDWF1基因在蒺藜苜蓿發育過程中的作用提供理論研究基礎。

關鍵詞：MtDWF1；蒺藜苜蓿；基因克隆；表達分析；亞細胞定位

中圖分類號：Q785文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-0984-08

Cloning，Subcellular Localization and Expression Pattern of MtDWF1 Gene in

Medicago truncatula

XIE Hong1， LI Shu-wen1， DONG Di1， WANG Meng-di JIA Wei CHAO Yue-hui ZHAO Yan

（1. School of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China; 2. College of Grassland， Resources

Environment， Inner Mongolia Agricultural University， Hottot， Inner Mongolia 010018， China）

Abstract：Delta24-sterol reductase （DWF1） is a crucial enzyme in the biosynthesis of brassinosteroids and has a significant regulation on plant growth and development. To examine the function of the DWF1 gene in Medicago truncatula，the full-length sequence of the MtDWF1 gene was cloned from M. truncatula （R108）. The open reading frame of MtDWF1 was found to be 1 704 bp in length and encoded a peptide of 567 amino acids with a molecular weight of 65.911 kDa and a predicted isoelectric point of 8.53. The protein of the MtDWF1 was localized in the cytoplasm as determined by subcellular localization analysis. Evolutionary analysis indicated that the MtDWF1 protein of M. truncatula is closely related to those of Cicer arietinum，Trifolium pratense，and Pisum sativum. The MtDWF1 gene was expressed in the roots，stems，and leaves of M. truncatula，with higher expression levels observed in stems and leaves than that in roots. Exogenous application of abscisic acid （ABA） caused the MtDWF1 expression significantly increased，while salicylic acid （SA） significantly reduced. Brassinosterol （BR） treatment resulted in an overall increase of MtDWF1 expression. This study provides a foundation for further investigating on the role of the MtDWF1 gene in M. truncatula development.

Key words：MtDWF1;Medicago truncatula;Gene clone;Expression analysis;Subcellular localization

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），豆科（Leguminosae），苜蓿屬（Medicago L.），一年生牧草植物。因其倍性小（2n=16）、基因組小（5×10⁸bp）［1］、生長期短、自花授粉、結實率高及可固氮等優良性狀，受到了越來越多研究者們的青睞［2-4］，同時也成為了研究豆科生物和基因組學方面的模式植物［5］。

油菜素內酯（Brassinosteroide，BR），是一類調控植物生長的固醇類激素［6］，被稱為第六類植物激素，是植物生長發育所需的天然植物生長調節劑［7］，在植物的不同器官中均存在，參與種子萌發［8］、細胞伸長和分裂、葉片衰老以及增加抗旱、抗寒、抗病等不同逆境環境的抵抗［9］。研究發現，DWF基因家族與BR在植物生長發育過程中聯系密切，很多成員都參與了BR的合成途徑［10］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［11］ 中DWF1/DIM是一個雙功能蛋白，催化24-亞甲基膽甾醇合成油菜素內酯，在dwf1/dim突變體中，內源BR的合成受阻其含量大量降低，造成DWF1基因的表達水平降低，從而導致植株生長速度減緩，植株表現矮化現象。在種子萌發時，DWF4與BR合成相關基因的表達量上調，導致內源BR含量增加。在DWF1蛋白序列中存在FAD結合結構域，具有FAD氧化還原酶特性。此外，DWF1在植物中的其他功能也得到了充分的研究，對甜瓜（Cucumis melo）中的DWF1基因進行克隆及表達分析，結果發現能促進根系及葉等組織的發育［12］。在水稻（Oryza satival）中，dwf1突變體的植株矮小，生長速度減緩，根、莖、葉等器官明顯變脆，同時葉片數量也較少，結實率及千粒重均比野生型有一定的降低［13］。在玉米（Zea mays）中通過RNAi技術干擾DWF1，發現基因表達受到抑制，轉基因植株變矮，同時這種抑制與植株的高度呈現正相關［14］。

綜上，DWF1基因在植株生長發育過程中發揮著重要的作用，然而在豆科模式植物蒺藜苜蓿中關于DWF1基因相關的研究較少。因此，本試驗以蒺藜苜蓿為研究材料，從蒺藜苜蓿中通過克隆得到MtDWF1基因，對其進行生物信息學分析、亞細胞定位及結合qRT-PCR分析該基因的表達特征，初步探討MtDWF1的功能，為后續深入研究該基因的功能機制提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的野生型蒺藜苜蓿（生態型R108）種子于北京林業大學保存。蒺藜苜蓿種子經4℃春化3 d后放置于光照16 h /25℃黑暗8 h/23℃至根系發育。然后移栽至直徑12 cm花盆中，并于25℃光照16 h/24℃黑暗8 h條件下生長。反轉錄試劑盒、PrimeSTAR MAX、限制性內切酶、pMD19-T克隆載體均來自于TAKARA公司；純化試劑盒、DNA提取試劑盒購自于OMEGA公司；DL5000 DNA Marker購自艾克瑞公司；熒光定量TB Green訂購于康維公司；大腸桿菌感受態DH5α來自于天根公司；利福平、卡那霉素、ABA，SA和BR購于Sigma公司，農桿菌感受態EHA105為實驗室保存。其他試劑均采自于進口分裝或國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計基于已經公布的蒺藜苜蓿R108參考基因組（R108_HM340_v1.0），通過軟件Primer Premier 5.0進行引物設計。其中，MtDWF1-F/R用于MtDWF1基因全長的克隆，引物3302Y-MtDWF1-F/R用于構建亞細胞定位植物表達載體構建，引物3302Y-F和3302Y-R用于植物表達載體檢測，引物MtDWF1-RT-F/R用于MtDWF1基因熒光定量檢測，引物MtActin-F和MtActin-R用于內參基因Actin熒光定量檢測。

1.2.2MtDWF1基因克隆取長勢一致的蒺藜苜蓿健康葉片作為植物材料，將其放在盛有液氮的研缽中充分研磨，按照RNA提取試劑盒提取蒺藜苜蓿總RNA。以提取的總RNA為模板，利用反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得蒺藜苜蓿cDNA。以蒺藜苜蓿cDNA為模板，以DWF1-F/R為引物獲得MtDWF1基因的目的條帶。對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小正確后，利用OMEGA純化試劑盒進行純化操作。純化后的PCR產物與克隆載體pMD19-T進行連接。然后將連接產物轉化到大腸桿菌感受態DH5α中，將其放在涂有氨芐抗生素的固體LB培養基上，挑取單菌落，使用引物M13F-47/R-48進行菌體PCR鑒定，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取擴增目的條帶大小的PCR產物送公司進行測序。

1.2.3亞細胞載體構建以含有MtDWF1克隆質粒為模板，用3302Y-DWF1-F/R為引物進行PCR擴增。在50℃下使用無縫連接酶將純化后的PCR產物與酶切質粒產物進行連接后轉入大腸桿菌感受態，并將其菌液涂在含有50 mg·L-1卡那霉素的抗生素固體LB培養基上進行挑選，將其置于37℃恒溫箱中培養8 h，挑取生長于抗生素培養基上的單菌落進行PCR擴增并取4 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將條帶大小符合的PCR產物送公司測序。

1.2.4農桿菌轉化用CaCl2凍融法將3302Y-DWF1重構質粒轉入到EHA105農桿菌的感受態中，并將其放置冰上30 min，液氮速凍1 min，37℃水浴5 min，冰上5 min，向管中加入1 mL的LB溶液，放置在28℃培養箱中振蕩4 h，5 000 r·min-1，棄上清，將剩余菌液涂于含有利福平和卡那霉素抗生素的LB培養基上，28℃暗處理2 d后，挑取單菌落，利用引物3302Y-F和3302Y-R對菌落進行PCR檢測，條帶大小符合的產物送至公司測序，測序后將比對正確的農桿菌菌液加甘油保存于-80℃的冰箱中。

1.2.5亞細胞定位將構建好的35S：：MtDWF1：GFP農桿菌菌液加到含50 mg·L^-1的利福平和50 mg·L^-1的卡那霉素抗生素的LB溶液中，黑暗條件下在培養箱振蕩1～2 d后，至OD600為0.6～0.8；以健康生長一個月左右的煙草為材料，用注射器將菌液注射到煙草葉片下表皮細胞中，注射后將煙草放置于人工氣候箱黑暗處理48 h，制作葉片玻片，將玻片倒置在共聚焦顯微鏡下，觀察煙草葉片中GFP熒光信號的分布情況，最終確定目的基因所在位置。

1.2.6生物信息學分析從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中下載MtDWF1的基因序列，將其在（https：//iris.angers.inra.fr/obh/）中與蒺藜苜蓿R108基因組序列比對，獲取MtDWF1的基因序列。同時于NCBI網站上對MtDWF1蛋白質進行保守結構域分析。利用DNA MAN分析MtDWF1的開放閱讀框及編碼氨基酸序列，用ProtPara（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質等電點和分子量，用（https：//services.healthtech.dtu.dk/services.php？signalp-5.0）進行蛋白質信號肽的預測。利用SOPMA（https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）對MtDWF1蛋白一級、二級、三級結構進行預測，Cell-PLoc網站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）去預測MtDWF1蛋白在細胞內的定位情況。通過MEGA 11軟件構建同源蛋白系統進化樹。

1.2.7MtDWF1實時熒光定量表達分析選取長勢一致健康的蒺藜苜蓿植株根、莖、葉三個組織，液氮速凍后，迅速放入-80℃的冰箱，對其進行組織差異性表達分析。以李殷睿智［15］和舒思晨［16］的實驗方法為參考，確定ABA，SA及BR濃度分別為10 μmol·L^-1，0.5 mmol·L^-1及0.1 μmol·L^-1。選取長勢一致的蒺藜苜蓿植株葉片，對葉表面均勻噴施1次進行激素誘導，分別于噴施激素的第0，0.5，1，3，6，9，12 h這7個不同時間點采取植株葉片組織后，立即用液氮進行速凍。隨后將上述樣品研磨后，分別提取植物的總RNA，并進行反轉錄。使用引物MtActin-F和MtActin-R作為熒光定量的內參基因，引物MtDWF1-RT-F/R按照試劑說明書進行qRT-PCR分析。反應結束后，根據2—△△Ct法［17］使用Excel 2010進行數據分析。

1.2.8數據分析通過Excel 2010對數據進行整理及圖標制作，利用軟件SPSS 26.0進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1蒺藜苜蓿MtDWF1基因的克隆

以DWF1-F/R為引物對蒺藜苜蓿cDNA進行PCR擴增。結果顯示，如圖1獲得條帶清晰、條帶大小約1 700 bp，將其產物送至生物公司測序，測序結果表明所克隆的堿基序列與蒺藜苜蓿MtDWF1基因序列一致，初步表明蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆成功，將正確的克隆載體命名為pMD-MtDWF1。可用于后續試驗。

2.2蒺藜苜蓿MtDWF1亞細胞定位分析

通過Cell-PLoc網站分析，推測MtDWF1蛋白定位于細胞質。將成功構建的35S：：MtDWF1：GFP載體轉化煙草，黑暗培養48 h，使用激光聚焦顯微鏡對轉化后的煙草進行觀察，捕捉激光信號。結果顯示從細胞質捕獲到強烈的GFP信號（圖2）。表明MtDWF1蛋白的亞細胞定位在細胞質中。

2.3MtDWF1基因的生物信息學分析

通過PCR克隆技術得到的MtDWF1基因開放閱讀框1 704 bp，編碼567個氨基酸（圖3），利用NCBI網站以及Blast工具對MtDWF1進行同源比對，對MtDWF1蛋白的保守結構及特性進行分析預測，發現在109～199位氨基酸之間含有FAD-binding-4結構域（圖4），該位點是FAD結合位點，MtDWF1其分子式為C₃₀₁₈H₄₆₂₀N₇₈₈O₈₂₉S₂₂，分子總質量65.911 kD，理論等電點為8.53。其正電荷殘基數量為78，負電荷殘基數量為73；不穩定系數是36.23，經預測，其蛋白性質穩定。二級及三級結構預測（圖5），結果顯示，MtDWF1蛋白主要由α螺旋及無規則卷曲構成，其分別各占二級結構總比例的42.5%和36.33%，含有延伸鏈16.23%和β轉角4.94%。通過Signal 5.0網站，進行信號肽預測（圖6），結果顯示，MtDWF1蛋白中不含有信號肽。

亞細胞定位預測結果顯示，MtDWF1蛋白定位于細胞質。使用MEGA 11軟件對MtDWF1蛋白構建系統發育進化樹，結果表明（圖7）蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白與鷹嘴豆（Cicer arietinum）、紅三葉（Trifolium pratense）和豌豆（Pisum sativum）親緣關系較近，與蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白同源的物種大多為豆科植物。

2.4組織差異性分析

對蒺藜苜蓿根莖葉進行熒光定量分析，檢測MtDWF1基因在根莖葉中的表達水平。結果表明MtDWF1基因在根莖葉中均有表達，在莖和葉中的表達量顯著高于根，分別是根的1.45和1.46倍。MtDWF1基因在莖和葉的表達水平相似（圖8）。

為探究激素對MtDWF1基因的作用，我們檢測了MtDWF1在ABA，SA及BR處理下0，0.5，1，3，6，9，12 h的表達水平。研究表明，ABA處理后，MtDWF1表達量與對照相比呈現先增加后降低的趨勢。0.5 h時表達量呈現逐漸增加趨勢，并在6 h達到頂峰，此時MtDWF1的表達量是對照的4.81倍。隨后MtDWF1表達量逐漸降低，但總體表達量高于對照（圖9）。這些數據表明，ABA可促進MtDWF1的表達，促進作用在短期內較明顯。

SA誘導后，MtDWF1的表達量整體呈現下降趨勢，前6 h呈現急速下降趨勢，在6 h時達到最低，占對照組的4.5%，6 h之后，表達量有所回升，但是仍然低于對照組。12 h表達量占對照組的44.7%（圖10）。結果表明，MtDWF1對SA較敏感，且SA對MtDWF1的表達具有明顯的抑制作用。

BR誘導后，MtDWF1被快速誘導其表達量整體呈現上升趨勢。在處理9 h時表達水平達到峰值，其表達量是對照組的5倍（圖11）。結果表明，BR對MtDWF1的表達具有促進作用。

3討論

DWF1基因是BR合成過程中的關鍵基因，能夠多次參與BR的催化合成。目前，DWF1基因已在多種植物中被研究，但在蒺藜苜蓿中DWF1方面的研究還未見到報道。本研究成功在蒺藜苜蓿中克隆獲得MtDWF1基因，該基因全長1 704 bp，共編碼567個氨基酸。進化樹結果分析（圖8）該基因控制合成的蛋白質與鷹嘴豆、豌豆、紅三葉等多個物種中的DWF1蛋白高度同源，其與鷹嘴豆相似度最高。DWF1蛋白含有FAD-binding-4結構域保守區域。在已報道的擬南芥［18］、甜瓜（Cucumis melo）［12］、棉花（Gossypium hirsutum）［19］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［20］等物種中，DWF1主要都是參與BR的催化合成過程，同時在本試驗中我們預測的蒺藜苜蓿DWF1蛋白質性質與以上這些物種中的DWF1蛋白質性質相同。因此，我們推測MtDWF1在蒺藜苜蓿中也具有相似的功能，能夠參與蒺藜苜蓿BR的催化合成過程。

通過表達分析，發現MtDWF1在根、莖、葉組織中均有表達，說明其廣泛存在于蒺藜苜蓿各個組織中，但其在不同的組織中的表達量具有差異性，在根中表達量最低，在葉中的表達量最高。這與DWF1基因在馬鈴薯［20］、玉米［14］和豌豆［21］的表達模式十分相似，推測DWF1基因在不同物種中可能具有相似的功能，因此可以利用在其他植物中獲得的結果，推測MtDWF1基因可能參與了蒺藜苜蓿BR的催化合成過程。植物激素在植物生長發育過程中扮演著重要的角色，不同激素處理對基因的響應也存在著差異。ABA被稱為“逆境激素”［22］，在逆境脅迫下大量的脫落酸（Abscisic acid，ABA）在植物中被積累。已有研究發現，玉米在外源噴施ABA激素后DWF4的相對表達量升高［23］。在本研究中，MtDWF1受ABA激素誘導后表達量也上調，因此我們猜測，該基因表達在受到ABA誘導后上調，MtDWF1可能會對逆境脅迫產生響應，這種響應可能是受到或部分受到ABA途徑所影響。除了ABA，MtDWF1與其他激素也存在相互作用。在SA處理后，該基因的相對表達量隨處理時間的增加基因的表達量受到抑制，暗示SA可能對MtDWF1進行負調控從而實現對蒺藜苜蓿生長的調控。Vriet等［24］發現，DWF1基因能夠促進油菜素內酯的合成，同時Best等人［25］也發現DWF1基因參與著BR和GA信號的相互作用，從而調控植物發育。在本試驗中我們通過BR激素處理后，發現MtDWF1基因的表達量總體呈現上升趨勢，這說明在外施BR激素的條件下，其促進了MtDWF1基因的表達，因此我們有理由猜測MtDWF1基因可能參與了蒺藜苜蓿植株的生長發育過程［20］，對植株生長具有促進作用。綜上所述，本研究為進一步探究蒺藜苜蓿MtDWF1基因功能提供了幫助，但關于其在蒺藜苜蓿中的具體功能及調控機制還需深入研究。

4結論

本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtDWF1基因并對其進行生物信息學分析顯示，DWF1的開放閱讀框1 704 bp，編碼567個氨基酸。DWF1的序列上有一個典型的氧化還原酶的FAD保守結構域，無信號肽。亞細胞定位顯示該蛋白定位于細胞質。表達分析結果表明，蒺藜苜蓿MtDWF1基因在莖及葉中的表達量最高，說明其在莖和葉中發揮作用。其表達受ABA，SA調節。BR可促進MtDWF1基因的表達，進而促進植株發育。總之，這些結果不僅為進一步探索MtDWF1基因功能的提供了思路，也從分子水平上研究其他豆科植物基因功能提供理論基礎。

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（責任編輯 劉婷婷）