野生老芒麥種質資源鑒定與基部葉鞘絨毛變異分析

摘要：為更好地利用老芒麥（Elymus sibiricus L.）野生資源，本研究從我國青藏高原、西北、華北、東北地區以及國外部分地區共采集了1 723份野生披堿草屬種質資源，通過表型特征觀測和流式細胞儀檢測，共鑒定出了990份野生老芒麥種質，246份垂穗披堿草種質，并測得老芒麥的DNA含量在5.86～7.30 Gb之間，平均DNA含量為6.66 Gb；垂穗披堿草材料的DNA含量在9.50～10.36 Gb之間，平均DNA含量為9.97 Gb。研究結果顯示，在西北、華北以及東北地區的部分野生老芒麥材料在苗期基部葉鞘出現了絨毛，分析發現該表型出現的概率與經度和緯度呈極顯著正相關關系（Plt;0.01），與海拔、年年均氣溫以及年平均降雨量呈極顯著負相關關系（Plt;0.01）。表明老芒麥苗期基部葉鞘絨毛的有無與環境因子之間存在著必然的聯系，可能是老芒麥種質應對不同環境類型的適應性機制之一。本研究為老芒麥的形態鑒定提供了新的依據，為老芒麥種質資源挖掘和育種應用提供了材料基礎。

關鍵詞：老芒麥；表型鑒定；流式細胞術；基部葉鞘絨毛

中圖分類號：S543.9文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1026-10

Identification of Wild Elymus sibiricus Germplasm Resources and Analysis of

Variation of Dorsal Hairs in Basal Leaf Sheath

LI Ming-feng LI Xin-rui LI Ying-zhu CHEN Li-li WANG Yan LI Chun-yan

CHANG Dan LEI Xiong YAN Li-jun YOU Ming-hong JI Xiao-fei ZHANG Chang-bing

WU Qi GOU Wen-long LI Da-xu CHEN Shi-yong BAI Shi-qie YAN Jia-jun

（1. Southwest Minzu University， Chengdu， Sichuan Province 610041， China; 2. Sichuan Academy of Grassland Sciences，

Chengdu， Sichuan Province 611743， China; 3. Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan Province 611130， China）

Abstract：In order to make better use of the wild resources of Elymus sibiricus germplasm，in this study the 1 723 materials of wild Elymus species resources from the Qinghai-Tibet Plateau，Northwest of China，North China and Northeast of China and some foreign regions were collected，from which，total of 990 wild E. sibiricus germplasm were identified by phenotypic characteristics and the Flow Cytometry detection. The results showed that the DNA content of E. sibiricus was between 5.86～7.30 Gb with average of 6.66Gb. The DNA content of Elymus nutans Griseb was between 9.50～10.36 Gb with average of 9.97Gb. It was found out that dorsal hair appeared in the basal leaf sheath of some wild E. sibiricus materials from Northwest of China，North China and Northeast of China，which was different from the description of the morphological characteristics of E. sibiricus in Chinese Flora，which was positively correlated with longitude and latitude （P lt; 0.01），and negatively correlated with altitude，annual mean temperature and annual mean rainfall （Plt;0.01），indicating that there was an inevitable relationship between the existence of the dorsal hair in the basal leaf sheath of E. sibiricus and its environmental factors and which possibly was one of the adaptive mechanisms of E. sibiricus germplasm to its environment. The results of this study provided a new basis for the morphological identification of E. sibiricus，and for the exploring E. sibiricus germplasm resources and breeding application.

Key words：Elymus sibiricus;Phenotypic identification;Flow cytometry;Dorsal hair in the basal leaf sheath

老芒麥（Elymus sibiricus L.）是禾本科小麥族披堿草屬（Elymus spp.）的模式種，具有產草量高、適口性好、抗逆性強等優點，在青藏高原地區被廣泛應用于高產人工草地建植和天然草地恢復改良，在畜牧業生產和生態建設中發揮著重要作用［1-3］。野生老芒麥種質資源廣泛分布于北半球溫帶地區，在我國西藏、四川、新疆、內蒙古等多個省區均有分布，是草甸草原和草甸群落中的重要成分［4-5］。老芒麥作為牧草生態草兼用型鄉土草種，準確掌握其形態特征并開展物種鑒定是野生種質資源采集利用的前提。

多個研究結果表明，老芒麥的表型性狀具有豐富的多樣性，在不同的生境下會出現較大差異［6-8］。老芒麥與垂穗披堿草（Elymus nutans Griseb）同為披堿草屬物種，在野外條件下，通常依靠《中國植物志》相關描述進行表型鑒定［9］。但由于老芒麥與垂穗披堿草地理分布高度重疊，并且具有豐富的表型變異性和多樣性，在野外難以區分［10］。老芒麥為四倍體，垂穗披堿草為六倍體，通過倍性鑒定，結合表型觀測，是區分老芒麥與垂穗披堿草的準確方式［11-12］。染色體計數與組型分析是傳統的植物染色體倍性鑒定方法，準確性高，但過程耗時繁瑣，對大量材料開展鑒定時，這種傳統的倍性鑒定方法就表現出了明顯的局限性。流式細胞術（Flow cytometry，FCM）是一種對懸浮在液流中的細胞及亞細胞結構等生物顆粒或非生物顆粒進行快速準確的多參數分析和分選的技術，可以快速高效的測算植物倍性，而且受限制較小、制樣簡單，適合樣品較多的倍性檢測分析［13-14］。近年來，流式細胞儀已廣泛應用于植物倍性研究，在菊花（Dendranthema morifolium）［15］、玉米（Zea mays）［16］、小麥（Triticum aestivum）［17］、鴨茅（Dactylis glomerata）［18］、斑茅（Erianthus arundinaceus）［19］等植物的倍性快速檢測上已成功運用。

為更好地利用老芒麥野生種質資源，本研究對收集自我國青藏高原、西北、華北、東北地區以及國外部分地區的老芒麥種質資源進行了形態學和流式細胞學聯合鑒定，準確鑒定出990份野生老芒麥種質資源，并發現部分老芒麥苗期基部葉鞘出現了絨毛，與《中國植物志》上對老芒麥的形態學特征描述出現了差異。我們對這一現象進行了初步分析，通過解析其分布規律和影響因素，為老芒麥種質資源采集利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料共計1 723份野生披堿草屬種質，由四川省草原科學研究院提供。材料采集于多個地區，生境信息差異顯著（表1），包括我國青藏高原地區（Qinghai-Tibet Plateau，QTP，主要為四川、西藏、甘肅、青海），西北地區（Northwest of China，NW，主要為新疆），華北地區（North China，NC，主要為河北、內蒙古中部地區），東北地區（Northeast of China，NE，主要為內蒙古東北地區），以及部分國外地區。對照品種為‘川草2號’老芒麥（Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2’）（四倍體，DNA含量6.74 Gb）。

1.2試驗地點

所有供試材料于2018年10月在四川省草原科學研究院成都市大邑縣韓場鎮試驗基地內進行盆栽育苗。2019年5月將育苗成功的盆栽材料移栽至四川省草原科學研究院阿壩藏族羌族自治州紅原縣的試驗基地（32°46′37″ N，102°32′38″ E，海拔3 500 m）。年均溫1.4℃，最熱月均溫10.8℃，最冷月均溫—9.9℃，極端最高溫23.6℃，極端最低溫—33.5℃，年降水量769.2 mm，無絕對無霜期。試驗地土壤為高山草甸土，pH值為6.6。移栽前對試驗地進行翻整處理。

1.3試驗方法

1.3.1形態學特征觀測所有試驗種質材料種植于1個小區，采用單株種植，每小區42株，株距、行距均為75 cm，小區面積為3.75 m×4.5 m，于2020年開始觀測所有供試材料的形態學特征。依據《中國植物志》上形態學特征的相關描述，垂穗披堿草“基部和根出的葉鞘具柔毛”“穗狀花序較緊密”；老芒麥“葉鞘光滑無毛”“穗狀花序較疏松”［9］。本試驗選取了苗期基部葉鞘背毛和穗狀花序兩個特征作為垂穗披堿草和老芒麥的區分標準，以穗部性狀特征為主，苗期基部葉鞘背毛特征為輔進行形態學鑒定。穗部主要觀測方法為在開花期將材料穗部完全拉伸，老芒麥的小穗會表現出非常疏松的狀態，而垂穗披堿草的小穗會非常緊湊且多數偏向于一側。基部葉鞘背毛特征在苗期進行觀測并記錄，穗狀花序特征在開花期進行觀測并記錄，

1.3.2流式細胞術倍性測定

（1）試驗制劑制備

細胞核分離緩沖液mGb：45 mmol·L^-1氯化鎂（MgCl₂·6H₂O），20 mmol·L^-1 3-嗎啉丙磺酸（3-Morpholinopropanesulfonic acid，MOPS），30 mmol·L^-1檸檬酸鈉，1% （W/V） 聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP 40），0.2% （v/v） 聚乙二醇辛基苯基醚（Tritonx-100），10 mmol·L^-1乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），20 μL·mL-1β-巰基乙醇，pH值為7.5。緩沖液制備好后放于4℃儲存，使用時置于冰上。

（2）細胞核懸浮液制備

采集健康幼嫩葉片，使用去離子水將樣品葉片洗凈取50 mg放入干凈培養皿中，加入1 mL預冷的緩沖液沒過材料，用鋒利的刀片將其迅速切碎，在冰上靜置10 min，用400目濾網過濾得到細胞核懸浮液。將細胞核懸浮液置于離心機1 000 r·min^-1，4℃條件下離心5 min，去除上清液。根據細胞核懸液體積，將預冷的碘化丙啶（Propidium iodide，PI）（母液濃度1 mg·mL^-1）和RNAase溶液（母液濃度1 mg·mL^-1）按1 g·mL^-1和1 g·L^-1的量加入細胞核懸液，輕微搖晃，置于冰上避光染色0.5～1 h（PI染液和RNAase溶液的工作濃度均為50 μg·mL^-1）。以同樣的方法制備參照樣品‘川草2號’老芒麥的細胞核懸浮液。

（3）上機檢測及倍性測定

利用BD FACScalibur流式細胞儀，先將染色后的‘川草2號’老芒麥的細胞核懸浮液獨立檢測再進行供試樣品檢測，每個待測樣品設置3次重復，每次收集細胞數不少于10 000個，采用488 nm藍光激發，收集FL2通道的熒光，并檢測PI發射的熒光強度。上機檢測后使用MoFit軟件進行繪圖與結果分析，利用樣品G1期熒光強度計算供試樣品的DNA含量及倍性。變異系數CV控制在5%以內，每個樣品至少測定3次，去平均值計算。

供試材料倍性水平或供試樣細胞核DNA含量=（參照材料倍性水平或參照材料細胞核DNA含量×供試材料G1峰熒光均值）／參照材料G1峰熒光均值。

2結果與分析

2.1形態學特征鑒定

依據《中國植物志》形態學特征描述，本研究對1 723份野生披堿草屬資源在苗期進行基部葉鞘絨毛觀測以及在花期進行穗部形態特征觀測。通過觀測統計發現（表2），符合垂穗披堿草形態特征的材料共有328份，符合老芒麥穗部形態特征的材料有990份。仍有405份材料由于采集地（如內蒙、西藏、國外等）的光照、溫度等生境差異，在試驗地點無法完成生殖生長，或植株形態、穗部形態產生了變異，無法通過表型特征進行準確判定。在990份穗部特征符合老芒麥形態描述的材料中，發現了部分材料在苗期時基部葉鞘出現了絨毛。因此，為了準確鑒定老芒麥和垂穗披堿草種質還需要進一步的倍性檢測鑒定。

2.2流式細胞儀檢測

2.2.1倍性檢測結果本試驗以‘川草2號’老芒麥為參照材料，使用流式細胞儀對1 723份材料進行DNA含量和倍性檢測，部分四倍體和六倍體供試材料的熒光峰值如圖1所示。檢測結果顯示，四倍體材料有1 093份，六倍體材料有213份，還有部分三倍體、五倍體等（表3）。統計發現，倍性為四倍體且穗部特征為老芒麥的材料有788份，倍性為六倍體且形態特征為垂穗披堿草的材料有66份（圖2），倍性為五倍體或三倍體但穗部特征為老芒麥的材料有202份。最終，結合形態學特征觀測結果和流式細胞術倍性檢測，鑒定出垂穗披堿草種質有246份，老芒麥種質有990份。

2.2.2DNA含量的測定本研究利用流式細胞術對1 723份野生披堿草屬種質資源DNA含量進行測定。統計結果顯示，四倍體老芒麥種質的DNA含量在5.43～7.35 Gb之間，平均DNA含量為6.70 Gb；六倍體垂穗披堿草種質的DNA含量在9.50～10.36 Gb之間，平均DNA含量為9.97 Gb。在老芒麥材料中，平均DNA含量最高的是青海地區材料，最低的為新疆地區材料（表4）。

2.3老芒麥苗期基部葉鞘絨毛統計分析

本次研究將形態學鑒定與流式細胞儀檢測結合，最終鑒定出了990份老芒麥野生種質材料，246份垂穗披堿草野生種質材料。在990份老芒麥野生種質資源中，發現有部分老芒麥種質資源在苗期時基部葉鞘出現了絨毛（圖3）。統計發現，基部葉鞘出現絨毛的野生老芒麥種質材料有222份，占本次野生老芒麥種質資源總數的24.2%，主要分布在東北地區、華北地區以及西北地區（圖4）。東北地區的野生老芒麥種質中出現絨毛的占比最多，有108份，占59.0%；華北地區有70份，占30.1%；西北地區最少，有44份，占23.9%；在青藏高原地區以及國外地區材料未有發現（表5）。對供試材料采集地的氣候相關信息（http：//www.worldclim.org）進行統計分析（表6），發現東北地區的材料生境信息中年平均氣溫最低，西北地區的年平均氣溫最高，但年平均降雨量最低。對生境信息進行相關性分析發現（表7），老芒麥基部葉鞘出現絨毛的概率與經度和緯度呈極顯著正相關關系（Plt;0.01）；與海拔、年平均氣溫以及年平均降雨量呈極顯著負相關關系（Plt;0.01）。表明老芒麥苗期基部葉鞘是否出現絨毛受生境影響，在經緯度越高，海拔越低，年平均氣溫和降雨量越低的地方基部葉鞘越容易出現絨毛變異。

3討論

3.1披堿草屬種質資源的鑒定方法

經典的野生植物資源鑒定方法是形態學鑒定，通過觀測植物的外形特征、生境特征等進行鑒定識別，一般以植物有性繁殖的器官特征來鑒定更為準確，但一些同屬植物的種間差異非常細微，比如披堿草屬植物的生態適應相似，地理分布高度重疊，種間差異小，加上表型具有多樣性，僅根據形態學特征通常難以準確鑒定，需要結合倍性鑒定進行綜合判斷，才能使鑒定結果更加客觀可靠［20］。傳統的倍性鑒定方式是通過細胞學壓片進行染色體計數和細胞學觀察，雖是最準確有效的倍性鑒定方法，但其工作量大，過程繁瑣，難以對大量材料快速鑒定。流式細胞術是一種對懸浮液中的細胞、細胞核、蛋白質以及染色體等顆粒進行準確的多參數分析和分選的技術，能快速高效的測定植物的基因組大小和倍性［21］。與染色體計數相比，流式細胞術具有更快速高效的優點，并且能同時對大量供試材料進行倍性鑒定。將流式細胞術與形態學鑒定相結合，能快速高效的對大量的野生資源進行鑒定分類。但由于流式細胞儀所需的樣本為細胞核懸浮液，而植物細胞形態各異，還含有細胞壁、葉綠體以及液泡等細胞器，對細胞核解離緩沖液要求較高，較難分離得到適用于流式檢測的細胞核懸浮液，導致少部分測定結果出現偏差［22］。在本試驗中，流式細胞術檢測結果除了正常的四倍體和六倍體披堿草屬材料外，還出現了少量三倍體、五倍體等其他倍性（表2）。由于披堿草屬材料大部分屬于四倍體和六倍體種質，五倍體基本為披堿草屬的遠緣雜交種，并且具有不育性，形態特征會發生一定變化，本次倍性檢測中能完成生育期的三倍體或五倍體材料，可能是試驗過程中造成的偏差，結合該部分材料表型特征，將表型特征明顯的材料進行分類，表型特征模糊的材料還需后續通過細胞學壓片來進一步鑒定。說明通過單一鑒定方法對野生植物資源進行鑒定都存在一定不足，需要結合多種鑒定手段綜合分析才能使鑒定結果更加準確可靠。

3.2基部葉鞘具絨毛的老芒麥材料分布特征和成因分析

本研究中發現了一種與植物志關于老芒麥葉鞘光滑無毛不一致的表型特征，即苗期基部葉鞘出現了絨毛，并且該類材料整體呈地域性集中（圖4）。植物表型主要受自身遺傳組成和所處生態環境影響，葉脈［23］和侯曼曼［24］認為在不同的生境中，同一物種的適應性受環境影響會產生差異，為了最大程度的減小不同環境帶來的不利影響，植物種或種群會在表型或者基因型方面做出響應，進化出一定的適應機制來緩解不同環境因素產生的壓力。袁慶華［25］和韓夢麗等［26］認為不同的生境條件會導致老芒麥種質的表型特征出現變異。鄢家俊等［27］在對老芒麥形態變異的研究中也發現部分老芒麥材料莖稈葉鞘出現小刺，并認為與高海拔地區的特殊生態環境有關，是對極端環境的一種響應策略。

絨毛是與植物適應性密切相關的重要表型性狀，在一定程度上能有效增強植株抗性［28］。有研究表明［29-30］，植物器官的絨毛通常與環境中的水分含量密切相關，生長在沙漠、草原等干旱條件下的植物出現絨毛的概率更高；Wilfried等［31］發現葉片絨毛也能夠增加植株對水分的利用率，提高植株抗旱性；Wood等［32］在對棉花葉絨毛的研究中，發現了干旱會導致植物的絨毛產量增加；Prachi等［33］也認為在干旱情況下，作為一種適應手段，植物會增加其器官上的毛狀體結構。在植物絨毛與寒冷脅迫相關研究較少，Dobrovolskaya等［34］發現麥類作物的穎殼絨毛能減少低溫對葉片傷害；崔紫霞［33］在小黑麥材料的研究中發現，穎殼絨毛和頸部絨毛越密集的小黑麥材料，具有更好的抗凍性。本研究對老芒麥材料原生地的年平均降水量和年均溫度進行了調查，發現東北和華北地區的年均氣溫和年降雨量都普遍低于青藏高原地區，其中東北地區的年均溫度遠低于其他三個地區，西北地區的年均溫度雖然比較高，但降雨量卻遠低于其他三個地區（表7）。經過相關性分析，老芒麥苗期基部葉鞘出現絨毛的概率與年平均降水量和年均溫度都呈極顯著負相關關系，在東北地區出現的概率最大，表明老芒麥苗期基部葉鞘絨毛的產生與降雨量和氣溫之間存在著必然的聯系，在降雨量越少，氣溫越低的地區，老芒麥苗期基部葉鞘產生絨毛的概率就越高。老芒麥具有很好的抗旱性和抗寒性，但在幼苗時期卻比較容易受干旱和低溫的影響［35-37］。結合相關文獻研究對比發現［38-41］，不同地區在老芒麥返青時期降水量和溫度差異較大，東北地區的降雨量和溫度遠低于青藏高原地區。推測老芒麥苗期基部葉鞘產生絨毛可能是在長期的低溫干旱環境中，為了適應環境壓力，進化出的一種“自我保護策略”，并且該部分材料移栽到青藏高原地區后，在苗期時基部葉鞘依舊表現出明顯的絨毛特征，可能具有較穩定的遺傳性，推測控制該表型的基因型也可能產生了變化。

4結論

本研究對1 723份披堿草屬野生種質資源進行了表型特征鑒定和流式細胞術檢測，準確鑒定出990份野生老芒麥種質資源，246份垂穗披堿草種質資源，為披堿草屬野生資源評價利用提供了材料基礎；通過流式細胞儀測得老芒麥供試材料的DNA含量在5.86～7.30 Gb之間，平均DNA含量為6.66 Gb，垂穗披堿草供試材料的DNA含量在9.50～10.36 Gb之間，平均DNA含量為9.97 Gb。此外，還發現部分來自東北、西北和華北地區的老芒麥野生資源在苗期時基部葉鞘出現了絨毛變異，分析發現該性狀與原生地環境顯著相關，表明老芒麥基部葉鞘具絨毛這一特殊性狀受生長環境影響，可能是老芒麥種質在應對不同生境類型的適應性機制之一，可作為老芒麥抗性材料前期篩選的重要指示指標。

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（責任編輯 閔芝智）