紫花苜蓿胚性愈傷組織誘導與增殖的研究

摘要：為在不同栽培苜蓿（Medicago sativa）品種上，建立穩定、快速且高效的組織培養體系，本試驗以品種‘游客’、‘Paola’和‘Sardi7’為研究材料，探究了苜蓿外植體、激素配比及金屬離子（Cu²⁺、Ag⁺），對其胚性愈傷組織的誘導效果。結果表明：下胚軸為誘導愈傷組織的最佳外植體；MS+1 mg·L^-12，4-D+0.2 mg·L^-1 KT為培養基時‘游客’和‘Paola’胚性愈傷誘導率分別為24.7%，16.7%；MS+2 mg·L^-12，4-D+0.2 mg·L^-1 KT為培養基時‘Sardi7’胚性愈傷誘導效果最佳為27.3%；1 μmol·L^-1 和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能顯著促進‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’愈傷組織的誘導；5 μmol·L^-1 Ag⁺顯著誘導‘游客’和‘Paola’形成胚性愈傷組織，誘導率分別提高25.3%，46.7%（Plt;0.05）。本研究探索了誘導苜蓿愈傷組織的最佳外植體及其培養條件、金屬離子促進不同苜蓿品種再生的作用，為突破同源四倍體栽培苜蓿品種基因型上的限制、提高胚性愈傷組織出愈率提供了思路。

關鍵詞：紫花苜蓿；下胚軸；金屬離子；胚性愈傷；顯微觀察

中圖分類號：Q945.79文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1057-07

Induction and Proliferation of Embryogenic Callus of Alfalfa

TAN Lu-na#， PENG Jia-wen#， XU Huan-yu， ZHANG Han-wen， XIA Hou-yin， MIAO Yu-qi，

CUI Yi-lin， YUAN Wang， MA Zhi-chao， TONG Yu-tao， GAO Jing-hui*

（College of Grass and Grassland， Northwest A amp; F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：In order to establish a stable，rapid and efficient tissue culture system on different cultivated alfalfa （Medicago sativa） varieties，this experiment took the varieties ‘Tourist’‘Paola’ and ‘Sardi7’ as the research materials，investigated the effects of alfalfa explants，hormones ratio and metal ions （Cu2+，Ag+） on induction of embryonic callus. The results showed that hypocotyl was the best explants to induce callus. When MS+1 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 KT were cultured，embryogenic callus induction rates of ‘Tourist’ and ‘Paola’ were 24.7% and 16.7% respectively. And the embryogenic callus induction effect of ‘Sardi7’ was 27.3% when MS+2 mg·L^-1 2，4-D +0.2 mg·L^-1 KT were cultured. 1 μmol·L^-1 and 5 μmol·L^-1 Cu²⁺ could promote callus induction of ‘Sardi7’，‘Tourist’ and ‘Paola’ significantly. 5 μmol·L^-1 Ag⁺ significantly induced embryogenic callus of ‘Tourist’ and ‘Paola’，and the induction rates increased by 25.3% and 46.7%，respectively （Plt;0.05）. In this study，we explored the best explants to induce alfalfa callus and their culture conditions，as well as the role of metal ions in promoting regeneration of different alfalfa varieties，which provided a solution for breaking through the genotypic restriction of autotetraploid cultivated alfalfa varieties and improving the healing rate of embryonic callus.

Key words：Alfalfa （Medicago sativa）;Hypocotyl;Metal ions;Embryogenic callus;Microscopic observation

優質飼料草種紫花苜蓿（Medicago sativa）的遺傳轉化工作中，因組織培養過程中植株再生率低、轉化效率不穩定，嚴重制約了轉基因及相關遺傳改良工作的進展［1］。Chen等［2］已完成了同源四倍體紫花苜蓿‘新疆大葉’的測序工作，為苜蓿的遺傳改良奠定了良好的基礎。因此，獲取可用于不同栽培苜蓿品種的穩定、快速且高效的組織培養體系用于遺傳轉化研究，已成為當前紫花苜蓿分子育種的重中之重。

誘導和增殖高質量愈傷組織對高效紫花苜蓿組織培養體系的建立至關重要；其中胚性愈傷組織生長較快，可通過體細胞胚胎發生形成植株［3］；而非胚性愈傷組織則生長緩慢，再生能力比較弱。近年來，許多學者通過探究紫花苜蓿的外植體種類和激素濃度配比，提高胚性愈傷組織誘導率并建立高效組織培養體系；如MS培養基中，2，4-D與6-BA不同配伍，可誘導苜蓿種子［4］、胚軸上、下段和子葉［5］形成愈傷組織。Cu²⁺參與植物生長發育過程中的多種代謝反應，是多種氧化酶的組成成分、參與植物體內的氧化還原過程和光合作用［6］，在植物組織培養中起重要作用［7］；Ag+對許多單子葉和雙子葉植物形態發生具有促進作用，作為一種乙烯抑制劑能減輕植物自身產生乙烯對分化的抑制作用，促進外植體形態發生［8-10］。在小麥組培中添加10 μmol·L^-1 Cu²⁺時，愈傷誘導率和胚性愈傷誘導率均顯著提高［11］；Ag⁺對甘蔗試管苗繁殖存一定的影響和應用［12］。本試驗以紫花苜蓿‘游客’的子葉、根尖和下胚軸為外植體誘導愈傷組織，探索誘導苜蓿愈傷組織的最佳外植體及其培養條件；并利用Cu2+和Ag+刺激苜蓿胚性愈傷組織形成、提高愈傷組織出愈率的可能，探索金屬離子促進不同苜蓿品種再生的作用；以期突破紫花苜蓿再生體系效率較低的難題，達到不同品種紫花苜蓿均可通過愈傷組織培養再生植株的目的。

1材料和方法

1.1材料

試驗材料為紫花苜蓿品種‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’，購置于百綠（天津）國際草業有限公司。

1.2方法

1.2.1無菌苗培養取紫花苜蓿‘游客’種子100～150粒，在超凈工作臺內30% NaClO浸泡消毒20 min；無菌水洗滌3次并用無菌濾紙吸干種子表面殘留水分，接種至1/2MS培養基（添加瓊脂12 g·L^-1、蔗糖10 g·L^-1，pH 5.7）。置于光照培養箱中培養，培養條件為：25±2℃，光照18 h /黑暗6 h，光照強度2 000 lx。本試驗中后續組織培養的溫度和光照條件均如上所述。

1.2.2紫花苜蓿不同外植體愈傷組織的獲得取培養3～4 d ‘游客’無菌苗，將子葉切割成5 mm正方形小塊，下胚軸和根尖切割成5 mm長小段，接種到下列4種不同激素組合，含有蔗糖30 g·L^-1和瓊脂10 g·L^-1，pH 5.8的MS培養基中，見表1。在方形培養皿中分別接種子葉、下胚軸及根3種不同外植體50個，每種激素組合處理重復3次。接種14 d后觀察愈傷組織形態，統計愈傷組織的數量并分析結果。

1.2.3不同品種的紫花苜蓿胚性愈傷組織的獲得將紫花苜蓿品種‘Sardi7’、‘游客’和‘Paola’3個品種的下胚軸分別按照上述誘導培養基激素組合培養基進行外植體制備，14 d后獲得的愈傷組織轉置于相同激素濃度配比誘導培養基上進行胚性愈傷誘導培養，每14 d繼代1次，共繼代2次。繼代培養完成后根據愈傷組織的形態劃分為三類［13-14］：Ⅰ型為淡黃色愈傷組織，結構松散透明、質地較軟，鑷子觸碰容易破碎，無緊密結構；Ⅱ型為綠色愈傷組織，表面呈現綠色顆粒狀，質地緊密堅硬，鑷子觸碰不會破碎，屬于胚性愈傷組織；Ⅲ型為褐色愈傷組織，質地緊密，整體呈現干枯狀，鑷子觸碰不易破碎。

1.2.4金屬離子濃度設置根據上述愈傷組織的形態篩選出適宜誘導胚性愈傷組織的最佳激素組合，并在其中分別添加不同濃度梯度的Cu²⁺、Ag⁺（表2）。將紫花苜蓿品種‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’3個品種的下胚軸在最佳激素組合培養基誘導14 d后獲得的愈傷組織，轉置于上述添加了金屬離子的培養基上繼代培養。繼代培養完成后，統計胚性愈傷組織數量和愈傷組織數量。愈傷組織誘導率=產生愈傷組織數／接種外植體總數×100%；胚性愈傷誘導率=產生Ⅱ型愈傷組織數/接種外植體總數×100%。

1.2.5顯微觀察- HE染色法將紫花苜蓿‘游客’繼代兩次后的3種不同類型愈傷組織浸入70% FAA固定液（甲醛∶乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90）中固定24 h，以不同濃度梯度乙醇（70%，85%，95%，100%）將固定樣品脫水后浸蠟并包埋在石蠟中，切片機切成厚度5 μm的蠟帶后制片，過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin Staining）染色并拍照觀察。

1.3數據分析

用Excel 2016記錄整理試驗數據，GraphPad Prism 8作圖。方差分析采用SPSS 23進行，單因素ANOVA分析愈傷組織誘導率和胚性愈傷誘導率，顯著性比較用Duncan’s法，多重比較采用新復極差法。

2結果與分析

2.1紫花苜蓿誘導愈傷組織的外植體及激素濃度配比

紫花苜蓿‘游客’不同取材部位獲得的外植體在不同激素濃度配比下的愈傷誘導率有顯著差異（圖1 A）。4種不同激素濃度組合下，以下胚軸為外植體時的愈傷誘導率均最高，激素濃度配比為Y1和Y4時差異最為顯著；Y1激素濃度配比下，下胚軸愈傷誘導率為66.0%，較子葉和根尖高出29.0%，45.7%（Plt;0.05）；Y4激素濃度配比下，下胚軸愈傷誘導率為75.8%，較子葉和根尖高出38.8%，33.9%（Plt;0.05）。Y1激素濃度配比下胚軸誘導形成的愈傷組織呈現出綠色、表面顆粒狀、質地緊密堅硬的形態（圖1 B，a）。在4種不同激素濃度組合下子葉和根尖均不能形成形態較好的愈傷組織：子葉為外植體形成的愈傷組織有水漬褐化現象，較難形成胚性愈傷組織（圖1 B，b）；根尖呈現水漬、透亮不緊密形態，愈傷組織較難保持良好（圖1 B，c）。以下胚軸為外植體時在激素濃度配比為Y1、Y3和Y4時愈傷誘導率顯著高于Y2，分別高出66.2%，75.1%，75.8%（Plt;0.05）。因此紫花苜蓿下胚軸為愈傷誘導的最佳外植體，適宜誘導的培養基激素濃度組合為Y1，Y3和Y4。

2.2不同激素濃度配比對不同品種紫花苜蓿胚性愈傷組織的誘導

將紫花苜蓿品種‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’3個品種下胚軸誘導形成的愈傷組織兩次繼代培養后，不同品種紫花苜蓿誘導胚性愈傷組織的最適激素濃度配比不同（圖2）。‘Sardi7’誘導胚性愈傷組織最適激素濃度配比為Y3，該配方下的胚性愈傷誘導率為27.3%；顯著高于Y1，Y4，較Y1，Y4分別高出6.0%，16.7%（Plt;0.05）。在‘Paola’中，Y1和Y3激素濃度配比下胚性愈傷誘導率都較高，胚性愈傷誘導率為16.7%，12.7%。‘游客’誘導胚性愈傷組織最適激素濃度為Y1，胚性愈傷誘導率達24.7%，顯著高于Y3，Y4下的胚性愈傷誘導率，分別高出了16.0%，18.3%（Plt;0.05）。

2.3金屬離子對紫花苜蓿愈傷誘導的作用

在培養基中添加Cu2+后，3個供試品種的愈傷誘導率均顯著增加（表3）。‘Paola’的愈傷誘導率在1 μmol·L^-1Cu²⁺濃度下最高，達86.7%，比對照組高20.0%（Plt;0.05）；‘游客’和‘Sardi7’的愈傷誘導率在5 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下最高，分別高達92.0%，92.7%，較對照組高出14.0%，12.0%（Plt;0.05）。添加Ag+可以顯著提高‘Paola’的愈傷誘導率，對‘Sardi7’、‘游客’的愈傷誘導無顯著影響（表3）。5 μmol·L^-1和10 μmol·L^-1 Ag+濃度下‘Paola’的愈傷誘導率較對照顯著提高，分別為94.7%，84.0%，較對照組分別高出28.0%，17.3%（Plt;0.05）。

添加Cu²⁺后‘Paola’‘游客’的胚性愈傷組織誘導率顯著提高，最高可達29.3%，21.3%，分別比對照組高16.6%，12.6%（Plt;0.05）；供試品種‘Sardi7’在1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下的胚性愈傷誘導率與對照組的胚性愈傷誘導率均無顯著差異（P＞0.05）。Ag+濃度可顯著提高‘Paola’、‘游客’的胚性愈傷誘導率，對‘Sardi7’的胚性愈傷組織誘導無顯著促進作用；‘Paola’‘游客’的胚性愈傷誘導率在5 μmol·L^-1 Ag⁺濃度下最高，高達59.3%，34.00%，較對照組提高了46.7%，25.3%（Plt;0.05）。

2.4紫花苜蓿愈傷組織的形態結構

2.4.1愈傷組織形態對紫花苜蓿‘游客’的下胚軸在兩次繼代培養后進行形態學觀察，松散透明的Ⅰ型愈傷組織分散性較好，隨著培養時間的增加不容易發生褐化，但無法形成胚性組織，不能繼續分化過程；Ⅱ型致密綠色愈傷組織質地較硬，再生性高，增殖較快；Ⅲ型褐化愈傷組織隨著培養時間增長，逐漸喪失胚性而死亡。在Y3配方中加入金屬離子后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型紫花苜蓿愈傷組織更加緊密、表面顆粒狀增多（圖3B，3D，3F）。

2.4.2組織學特征在顯微組織細胞學上，紫花苜蓿‘游客’胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織有明顯的差異（圖4）。Ⅰ型松散透明淡黃色愈傷組織的細胞排列松散，無明顯的組織結構，且細胞染色淺，較少的細胞含有細胞核（圖4A，B）；Ⅱ型致密的綠色愈傷組織細胞排列緊密，有明顯的組織樣結構和分生中心，分化出球形胚和子葉型胚結構（圖4 C），且細胞染色深，細胞核大（圖4D）；Ⅲ型褐色愈傷組織細胞排列雜亂，沒有明顯的組織結構，雖然細胞染色較深，部分細胞有細核，但細胞結構不完整（圖4E，4F）。

3討論

3.1外植體類型及激素濃度影響紫花苜蓿胚性愈傷的形成

紫花苜蓿不同植株部位內源激素水平的差異，同一品種上的不同外植體，誘導產生愈傷組織的效果存在顯著差異［15，16］，適宜外植體有助于高質量愈傷組織的形成，保證其繼代培養中不定芽的形成，有利于發育成完整植株，提高組培效率［17］。本研究中采用紫花苜蓿‘游客’品種子葉、下胚軸和根尖3種不同外植體，在愈傷組織誘導上存在著顯著差異，其中以下胚軸作為外植體形成愈傷組織數量和質量效果最佳，研究結果與趙曉倩等［18-19］的研究結果一致。

馬伶俐等［20］在MS基本培養基上以下胚軸為外植體，添加2 mg·L^-1 2，4-D+1 mg·L^-1 6-BA激素，誘導紫花苜蓿‘甘農4號’愈傷組織并分化成苗；紫花苜蓿‘青大1號’以種子為外植體，在添加了40 μmol·L^-1 2，4-D和15 μmol·L^-1 6-BA的MS培養基上誘導出胚性愈傷組織［21］。基因型決定植物體細胞胚胎發生及其發育，相同物種不同基因型的體細胞胚發生能力存在差異［22］，對植物激素種類和濃度敏感性響應亦不同［23］。本試驗中采用下胚軸為外植體，品種‘Paola’和‘游客’在激素濃度配比為2，4-D 1 mg·L^-1+ KT 0.2 mg·L^-1時胚性愈傷誘導效果最佳，而品種‘Sardi7’誘導胚性愈傷組織的最佳激素濃度則為2，4-D 2 mg·L^-1+ KT 0.2 mg·L^-1。以紫花苜蓿葉片為外植體，2 mg·L^-1 2，4-D和0.5 mg/ KT最適于胚性愈傷的誘導，但也僅適用于基因型為公農系列苜蓿品種；因不同基因型次生胚發生頻率不同，不同品種紫花苜蓿胚性愈傷組織最適激素濃度配伍存在差異［24］，因此，選擇合適的外植體類型和激素配伍，可以有效提高胚性愈傷誘導率。不同品種紫花苜蓿誘導胚性愈傷組織，需要在外植體和激素配伍間多次試驗探索，以期獲得較好的再生植株。

3.2金屬離子促進紫花苜蓿胚性愈傷組織誘導

金屬離子會對植物愈傷誘導產生顯著影響［25］，Cu²⁺因其氧化還原特性能夠參與生物體內的多種催化反應，對生物的正常生長和發育至關重要［26］；Ag+作為植物生長非必需元素，對器官和體細胞胚胎發生具有顯著促進作用［12］。山禾等［27］發現在培養基中添加15.0 μmol·L^-1的Cu²⁺，寒地粳稻‘空育131’和‘東農425’的愈傷組織誘導率分別提高了8.0%和22.0%（Plt;0.01），綠苗分化率分別提高了26.4%和27.0%（Plt;0.05）；在小麥‘甘春’中添加0.5 μmol·L^-1的CuSO₄有類似效應［28］。本試驗研究0～5 μmol·L^-1 Cu²⁺和 0～10 μmol·L^-1 Ag⁺對紫花苜蓿愈傷誘導的效應，1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1Cu²⁺均能顯著提高3種紫花苜蓿愈傷組織誘導率。棉花組培中添加5 μmol·L^-1 Ag⁺可縮短最早出愈天數，提高愈傷誘導率和植株再生率［25］；當添加10 μmol·L^-1Ag⁺時，小麥‘泰山21’的胚性愈傷組織誘導率最高可達到74.0%［29］。本實驗中Cu2+和Ag+均不同程度促進紫花苜蓿愈傷的誘導，這與后猛等［29］在小麥上的研究結果一致；其中5 μmol·L^-1 Ag+顯著提高‘Paola’和‘游客’胚性愈傷組織的誘導率。試驗添加1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1 Cu²⁺促進了紫花苜蓿愈傷誘導率，但對胚性愈傷誘導效果則尚需進一步研究。

3.3金屬離子影響紫花苜蓿胚性愈傷形態

高濃度的Ag⁺通過嚴重的氧化應激引起形態畸變和細胞膜損傷，從而對愈傷組織誘導產生負效應［30］。本研究中紫花苜蓿‘游客’3種愈傷組織形態學觀察表明，誘導的紫花苜蓿胚性愈傷組織具有致密的綠色顆粒狀結構，在細胞學形態上具有明顯的分生中心，并形成了球狀胚和子葉型胚的胚狀結構，與連香樹［31］和‘鳳丹白’［32］組培上的研究結果相一致。受紫花苜蓿基因型的影響，本研究添加Ag+的愈傷組織形態學觀察發現，形成的愈傷組織更加緊密、表面顆粒狀增多，說明Ag+對紫花苜蓿胚性愈傷品質有明顯促進作用，并可實現在紫花苜蓿胚性愈傷組織早期組織學形態鑒定，便于早期優質胚性愈傷組織的篩選。

如何突破同源四倍體栽培苜蓿品種基因型上的限制、提高胚性愈傷組織出愈率，金屬離子在胚性愈傷組織形態上的作用，也許能提供一些思路。玉米中報道了ZmSAUR15 基因參與吲哚-3-乙酸的生物合成和未成熟胚衍生愈傷組織的細胞分裂，敲除ZmSAUR15可以改善未成熟胚胎誘導胚性愈傷組織形成的能力，從而提高愈傷組織再生效率［33］。而金屬離子在苜蓿胚性愈傷組織誘導中的分子機理則有待進一步研究。

4結論

紫花苜蓿‘游客’的下胚軸作為外植體能夠很好地誘導愈傷組織的形成；‘游客’和‘Paola’胚性愈傷誘導率均較高的培養基為MS+1 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 KT，誘導率分別為24.67%，16.67%；‘Sardi7’的胚性愈傷誘導效果最佳的培養基為MS+2 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 KT，誘導率為27.33%；1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能促進‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’愈傷組織的誘導，其中‘Paola’的愈傷誘導率在1 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下最高，為86.7%，‘游客’和‘Sardi7’的愈傷誘導率在5 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下最高，分別為92.0%，92.7%；5 μmol·L^-1 Ag⁺顯著提高了‘游客’和‘Paola’的胚性愈傷誘導率，較不添加Ag⁺的對照組分別提高了25.3%，46.7%（Plt;0.05）。

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（責任編輯 彭露茜）