基于網絡藥理學與代謝組學探討枳實-厚樸藥對治療慢傳輸型便秘的作用機制

摘要：利用網絡藥理學與代謝組學探討枳實-厚樸藥對治療慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）的潛在作用機制。使用中藥系統藥理數據庫與分析平臺篩選枳實與厚樸的化學成分及作用靶點，通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數據庫搜集STC的疾病預測靶點，運用維恩圖獲得成分與疾病的交集靶點，采用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，運用Cytoscape 3.8.0軟件計算并篩選關鍵靶點，同時繪制中藥-成分-靶點網絡圖，利用Metascape數據庫對交集靶點進行GO（gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析。采用洛哌丁胺誘導法構建STC小鼠模型，給予枳實+厚樸灌胃給藥后，對小鼠盲腸內容物進行基于氣相色譜聯合飛行時間質譜（GC/TOF-MS）的非靶向代謝組學檢測，分析差異性代謝物。結果獲得枳實-厚樸藥對活性成分共24種，與STC疾病相關的交集靶點共106個，其中度值排名靠前的關鍵靶點包括AKT1、TNF、TP53、IL6、CASP3、JUN。GO分析發現可能涉及的生物學過程包括細胞對氮化合物的反應、細胞對脂質的反應、蛋白磷酸化的正調控、炎癥反應的調節、離子傳輸的調節等。KEGG分析可能涉及的通路包括癌癥通路、PI3K-AKT信號通路、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路等。非靶向代謝組學檢測共發現21種差異性代謝物，包括Akt相關性代謝物煙酸、果糖、原兒茶酸。本研究揭示枳實-厚樸藥對通過多成分、多靶點、多通路對STC發揮治療作用，其活性成分柚皮素和木犀草素，關鍵靶點Akt及相關性代謝物值得特別關注，這為后續基礎研究提供了思路與理論依據。

關鍵詞：枳實；厚樸；慢傳輸型便秘；網絡藥理學；代謝組學

中圖分類號：R285文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）03-0018-09

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Abstract∶The potential action mechanism of aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex in the treatment of slow transit constipation （STC） was investigated via network pharmacology and metabolomics.The chemical ingredients and targets of aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex were obtained using the traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform. The disease prediction targets of STC were collected through the GeneCards， OMIM， and DisGeNET databases. The intersection targets of ingredients and diseases were obtained using Venn diagrams. The STRING database was used to construct the protein-protein interaction network. The Cytoscape 3.8.0 software was used to calculate and screen the key targets， and then the network diagram of TCM-ingredient targets was plotted. The gene ontology（GO） functional enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the intersection targets were performed using the Metascape database. A loperamide-induced STC mouse model was used in the study. After intragastric administration of aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex， GC/TOF-MS-based untargeted metabolomics of cecal contents was performed to analyze differential metabolites. A total of 24 active ingredients and 106 intersection targets were obtained. The key targets with higher degree values included AKT1， TNF， TP53， IL6， CASP3， and JUN. GO analysis revealed that the possible processes were cellular response to nitrogen compound， cellular response to lipid， positive regulation of protein phosphorylation， regulation of inflammatory response， regulation of ion transport， etc. KEGG analysis revealed the pathways involved in cancer， the PI3K-Akt signaling pathway， the calcium signaling pathway， serotonergic synapse， etc. In addition， 21 differential metabolites were found via untargeted metabolomics， including the Akt-associated metabolites nicotinic acid， fructose， and protocatechuic acid. The results suggested that aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex exerted therapeutic effects on STC via multi-ingredient， multi-target and multi-pathway mechanisms， thereby providing ideas and a theoretical basis for future basic research. The active ingredients naringenin and lignan， as well as the key target Akt and its related metabolites， deserves special attention.

Key words∶Aurantii Fructus Immaturus; Magnoliae Officinalis Cortex; slow transit constipation; network pharmacology; metabolomics

慢傳輸型便秘（slow transit constipation， STC）是由于結腸運輸能力減弱，以腸道內容物傳輸緩慢為特征的一類頑固性便秘，約占功能性便秘的45.5%[1]。STC的臨床表現為長期便次減少，便意缺失，排便時間延長，糞便干結，呈羊糞狀或球狀，部分患者伴有腹脹、左下腹隱痛等不適癥狀。中醫學上將便秘歸為“便秘” “脾約” “后不利”等范疇。《金匱翼·便秘》指出“氣內滯，而物不行也”，大腸傳導失司，氣機郁滯，通降失職，糟粕內停為本病基本病機，即如《丹溪心法》所云“當升者不得升，當降者不得降，當變化者不得變化也，傳化失常”[2]。

對于STC病機的認識，目前普遍認為應當屬于中醫學“虛秘”范疇，為本虛標實之證。究其本源，多為中焦脾胃虛弱，納運失職，氣機升降失常，氣虛則大腸傳導無力，不能推動腸內糟粕運行[3]。歸納總結上海中醫藥大學附屬龍華醫院曹永清教授561首治療便秘中藥內服處方，共涉及中藥113味，按選用頻次高低排序，排名前5的中藥依次為枳實、厚樸、黨參、茯苓、川楝子[4]；河北省中醫院李佃貴教授治療便秘90首處方中，最為常用的前5位中藥分別是枳實、大黃、厚樸、當歸、川芎[5]；廣東省中醫院黃穗平教授治療便秘176首處方中，使用頻率最高的5味中藥依次為枳實、炙甘草、黃芪、厚樸、火麻仁[6]。分析當代醫家治療便秘的組方特點及用藥規律，我們可以發現“枳實”與“厚樸”兩味中藥在臨床治療便秘組方配伍中的選用頻率排名前列。

枳實與厚樸皆屬苦泄辛散性溫，“辛”能行，能散，引氣上行，“苦”能降，能瀉，苦瀉下行，苦辛通降，調理脾胃氣機，具有較強的行氣消積作用，同為消除脹滿的要藥。枳實-厚樸藥對出自張仲景《傷寒論》，此兩藥之配伍自古至今被認為具有協同增效的作用。因此，本研究以枳實-厚樸藥對作為研究對象，運用網絡藥理學方法篩選枳實與厚樸的有效成分及作用靶點，并進行生物信息學分析，同時結合非靶向代謝組學研究，探索其治療STC的潛在作用機制，為下一步研究提供數據基礎與理論依據。

1資料與方法

1.1枳實、厚樸活性成分及作用靶點的篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分別檢索枳實、厚樸的化學成分，選擇口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為參考標準篩選出活性成分，而后獲得活性成分的靶點信息。此時得到的靶點信息為蛋白名稱，利用Unitprot數據庫（http：// uniprot.org/）進行檢索轉化為基因名稱。

1.2STC疾病相關靶點篩選

以“slow transit constipation”為關鍵詞在OMIM 數據庫（https：//omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）中檢索STC疾病相關靶點，將上述3個數據庫中獲得的靶點信息刪除重復項后，得到本次研究的疾病預測靶點庫。

1.3藥物-疾病交集靶點獲取

利用Venny 2.1在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將枳實、厚樸活性成分的作用靶點同STC疾病預測靶點庫進行交集，從而得到枳實-厚樸藥對在STC治療中的潛在作用靶點。

1.4構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

將1.3節得到的交集靶點數據導入STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/），選擇Mutiple proteins分析，選擇Organisms為Homo Sapiens，設置minimumrequired interaction score為medium confidence（0.400），得到蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）信息，以STV 格式導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制PPI網絡圖。

1.5拓撲分析及關鍵靶點篩選

利用Cytoscape軟件中的Centiscape 2.2插件計算每個靶點的連接度（degree），按照度值由高到低進行排列，排位越靠前代表此成分靶點越關鍵。同時利用Cytoscape軟件繪制中藥-成分-靶點網絡圖。

1.6GO富集分析與KEGG通路富集分析

利用Metascape數據庫（https：//metascape.org/gp/index.html）對1.3節得到的交集靶點數據進行基因本體（gene ontology， GO）功能富集分析和京都基因和基因組大百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析，預測枳實-厚樸藥對治療STC的潛在機制。

1.7實驗動物及分組

6～8周齡，18～22 g，清潔級，雄性，C57BL/6小鼠，共18只，購于常州卡文斯實驗動物有限公司（SCXK（蘇）2021-0010），飼養于無錫市人民醫院實驗動物中心屏障級環境設施中。飼養溫度為24～26 ℃，濕度為50％～70％，12 h/12 h固定明暗周期。本項目通過無錫市中醫醫院動物倫理審查（倫理審批號SSB2022011001）。所有小鼠適養一周后隨機分為3組，即正常組（NC組）、便秘模型組（STC組）和枳實+厚樸治療組（ZS+HP 組），每組各6只。STC組和ZS+HP組小鼠利用洛哌丁胺灌胃法構建便秘模型，方法為按10 mg/kg體重劑量給予洛哌丁胺（西安楊森制藥，批號：LGJ0448）灌胃，1次/d；NC組小鼠給予0.2 mL生理鹽水灌胃，1次/d。ZS+HP組小鼠按12.0 g/kg劑量給予枳實+厚樸水提液（V（枳實）：V（厚樸）=1：1）灌胃，1次/d。NC組和STC組小鼠則給予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.8樣本采集及處理

造模后第8 d，所有小鼠禁食12 h后頸椎脫臼處死，取小鼠盲腸內容物，速凍后置于-80 ℃冰箱保存。稱取5 mg凍干糞便樣品放置在離心管中，然后與10 μL內標混合，每份樣品再加入50 μL預冷后的50%甲醇，14 000 g，4 ℃離心20 min（Microfuge 20R， Beckman， USA），將上清轉移到自動取樣瓶（Agilent Technologies， USA）。將175 μL預冷后的甲醇/氯仿（體積比為3：1）加入殘渣中進行二次萃取。14 000 g，4 ℃離心20 min，取100 μL上清轉移到自動取樣瓶，剩余上清液匯集在一起，制成質量控制樣品。使用真空濃縮器（Labconco， USA）對自動取樣瓶中的所有樣品進行短暫蒸發以去除氯仿，并使用冷凍干燥機（Labconco， USA）進一步凍干。干燥的樣品加入50 μL甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液（20 mg/mL）在30 ℃衍生2 h，然后用樣品制備頭在37.5 ℃下加入50 μL MSTFA （1% TMCS）再衍生1 h。

1.9基于GC-TOF/MS的非靶向代謝組學分析

小鼠盲腸內容物的非靶向代謝組學分析通過氣相色譜聯合飛行時間質譜（GC/TOF-MS）系統（Pegasus HT， Leco， USA）進行檢測，測序分析委托麥特繪譜生物科技（上海）有限公司實施。通過Rxi-5ms毛細管氣相色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm， Restek， USA）進行分離。載氣為氦氣（≥99.999%），恒定流速1.0 mL/min。注入和轉移溫度為270 ℃。質譜參數如下：EI 離子源模式，70 eV電離能量，離子源溫度220 ℃，采集速率25 spectra/s，掃描范圍：50～500 Da。使用ChromaTOF v4.71（Leco， USA）軟件處理和識別獲得的原始數據。化合物的鑒定參考麥特繪譜（上海）構建的JiaLib代謝物數據庫。運用主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法對各組代謝物譜進行分析。代謝物VIP（variable importance in projection）gt;1和Plt;0.05（Student′s t-test）被認為存在顯著差異。

2結果

2.1枳實、厚樸的活性成分及作用靶點

通過TCMSP數據庫檢索得到枳實活性成分22種，作用靶點124個；厚樸活性成分2種，作用靶點28個。刪除重復項后得到枳實-厚樸藥對的活性成分共24種（OSID科學數據與內容附表1），主要活性成分見表1。作用靶點共134個，見OSID科學數據與內容附表2 。

以“slow transit constipation”作為關鍵詞在OMIM 數據庫和GeneCards數據庫中分別檢索到STC疾病相關靶點604個和3 801個，由于在DisGeNET數據庫中無法以“slow transit constipation”作為關鍵詞進行檢索，遂改用“constipation”作為關鍵詞，在DisGeNET數據庫中檢索到疾病相關靶點424個。綜合3個數據庫結果，刪除重復項后，最終得到STC疾病相關靶點合計4 380個。

2.3藥物-疾病交集靶點及PPI網絡構建

通過Venny 2.1在線工具得到枳實-厚樸藥對與STC的藥物-疾病交集靶點共106個， 見OSID科學數據與內容附圖1。將獲得的106個交集靶點數據導入STRING數據庫，得到蛋白質間的相互作用信息，借助Cytoscape 3.8.0軟件重新布局交集靶點PPI網絡，見OSID科學數據與內容附圖2，度值越大則節點圖標越大，顏色越深，相互作用越強則節點連線越粗。

2.4關鍵靶點分析

在Cytoscape 3.8.0軟件中對交集靶點度值進行分析，度值排名前10的關鍵靶點包括AKT1、TNF、TP53、IL6、CASP3、JUN、VEGFA、MAPK3、PPARG、EGFR，見OSID科學數據與內容附圖3。同時繪制中藥-成分-靶點網絡圖，見OSID科學數據與內容附圖4。

2.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過Metascape數據庫對藥物與疾病交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析發現枳實-厚樸藥對治療STC的潛在生物過程可能涉及細胞對氮化合物的反應、對肽的反應、對異種刺激的反應、細胞對脂質的反應、腺體發育、蛋白磷酸化的正調控、對營養水平的反應、炎癥反應的調節、離子傳輸的調節、對氧氣水平降低的反應等，見OSID科學數據與內容附圖5。KEGG分析結果顯示枳實-厚樸藥對可能參與的通路為癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、鉑類藥物耐藥性、化學致癌-受體激活、結直腸癌、非酒精性脂肪肝、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路、AMPK信號通路，見OSID科學數據與內容附圖6。

2.6非靶向代謝組學分析

PCA（principal component analysis，主成分分析）和OPLS-DA（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，正交偏最小二乘法判別分析）分析結果顯示NC組和STC組小鼠盲腸內容物中的代謝物聚類性較好，兩組間代謝水平存在明顯差異（圖1（a），1（c）），STC組和ZS+HP組比較同樣顯示兩組間代謝水平存在明顯差異（圖1（b），1（d））。篩選NC組和STC 組兩組間的差異性代謝物（圖 1（e）），根據VIPgt;1的標準鑒定出79 種差異性代謝物，根據Plt; 0.05的標準鑒定出43種差異性代謝物，同時滿足上述兩種篩選標準的差異性代謝物共有43 種。相同方法篩選STC組和ZS+HP組兩組間的差異性代謝物共43 種（圖1（f））。對上述兩兩比較得到的組間差異性代謝物進行綜合分析，最終發現相較于NC組，SCT組小鼠盲腸內容物中有16種代謝物出現明顯減少，但在給予枳實+厚樸灌胃給藥后上述代謝物顯著增加，包括乙醇胺、N-甲基丙氨酸、煙酸、脯氨酸、尿嘧啶、氫化肉桂酸、核糖、果糖、焦谷氨酸、赤酮酸、谷氨酸、木酮糖、甘露糖、1-單硬脂精、1-單肉豆蔻精和3-羥基苯乙酸。此外，有5種代謝物在SCT組小鼠盲腸內容物中較NC組顯著升高，但在枳實+厚樸給藥后出現明顯下降，包括腐胺、纖維二糖、N-乙酰腐胺、原兒茶酸和麥芽糖（表2）。

3討論

通過研究PPI網絡發現，枳實-厚樸藥對治療STC的關鍵靶點有AKT1、TNF、TP53、IL-6、CASP3、JUN等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT1信號通路的重要作用節點，主要參與細胞增殖、細胞凋亡、代謝等生物學過程，研究發現AKT1磷酸化激活對于維持 Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal， ICC）的功能具有重要作用[7]。ICC是一種廣泛分布于胃腸道肌層的間質細胞，是胃腸道平滑肌慢波的發起者和傳播者，被視為胃腸動力的起搏細胞[8]。ICC在全結腸的分布相對均勻，STC患者各段結腸中ICC的數量與體積較正常人均明顯減少[9]。TNF和IL-6屬于炎癥性細胞因子，腸道微生物介導的炎癥性細胞因子分泌異常可能是導致便秘的原因之一，研究報道慢性便秘患者血清中IL-6和TNF-α的濃度均出現明顯升高[10]。TP53和JUN是癌癥相關基因，一項針對便秘患者罹患癌癥的風險追蹤隨訪調查發現，便秘會導致短期內患發癌癥的風險升高[11]。CASP3是一種蛋白酶，屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。研究發現STC相關的反應性人腸膠質細胞（reactive human enteric glial cell，rhEGC）表型會引起CASP3的mRNA轉錄上調，提示CASP3可能通過影響腸神經膠質細胞從而對胃腸動力發揮調節效應[12]。

本研究KEGG分析結果顯示枳實-厚樸藥對治療STC的潛在通路包括PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路等。PI3K-Akt信號通路除了涉及調控ICC細胞功能外，還能夠通過調控下游內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達從而參與便秘疾病過程。研究發現p-Akt的表達降低，會導致結腸組織eNOS的表達升高，使得NO釋放增加，NO是一種抑制性神經遞質，可以作用于胃腸道平滑肌，抑制其收縮，減少胃腸道蠕動[13-14]。本研究中藥-成分-靶點網絡分析顯示，關鍵靶點Akt對應的活性成分為柚皮素和木犀草素。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有多種藥理學活性，如抗炎、抗過敏、降尿酸 、抗腫瘤、抗病毒等，多項研究發現木犀草素可以通過調控PI3K-Akt信號通路發揮治療作用[15-16]。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物，研究同樣發現柚皮素可以通過調控PI3K-Akt信號通路發揮抗炎、抗腫瘤、抗血小板凝集等生物學作用[17-19]。此外，Yin等[20]報道柚皮素能夠通過上調Cajal間質細胞的標志物干細胞因子（stem cell factor， SCF）及其受體c-kit的表達，以及調控水通道蛋白3（Aquaporin3，AQP3）的表達從而對洛哌丁胺誘導的STC小鼠發揮治療作用。

鈣信號通路與胃腸道平滑肌收縮關聯緊密，平滑肌的收縮伴隨有鈣信號的改變，表現為收縮時細胞外液中Ca2+內流或細胞內貯存的Ca2+釋放使得平滑肌細胞內Ca2+的濃度升高，而在舒張時游離Ca2+被質膜鈣泵或Na+、Ca2+交換排出胞外使得平滑肌細胞內Ca2+的濃度降至靜息水平[21]。李東鑫等[22]研究發現枳實含藥血清可以提高胃竇平滑肌細胞內Ca2+的濃度，增強肌細胞的收縮。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是腸神經系統中一種重要的神經遞質，5-HT可以刺激腸道平滑肌收縮，一般認為便秘患者通常伴隨5-HT水平降低以及5-HT受體活性的改變[23]。研究表明5-HT3受體表達下降會影響腸道感覺向大腦中樞的傳遞使得便意減少，另一方面又會使胃腸道蠕動減弱，延緩胃腸道內容物的運輸[24]。此外，結腸5-HT4受體表達降低同樣會引起腸蠕動減弱，腸道分泌反射異常，導致便秘[25]。

本研究還通過非靶向代謝組學方法檢測了枳實-厚樸藥對灌胃對STC小鼠腸道代謝物的影響，最終共檢測出21種差異性代謝物，其中值得注意的是枳實-厚樸給藥增加了STC小鼠腸道內容物中煙酸和果糖的含量，降低了原兒茶酸的含量，而這3種差異性代謝物均與Akt信號通路存在關聯。煙酸是一種多功能物質，對機體神經系統、炎癥反應以及脂肪代謝等具有調節作用[26]。林福全等[27]報道煙酸可以增強人永生化表皮細胞（HaCaT）中Akt活性。果糖是與葡萄糖同分異構的單糖，李穎霞等[28]研究發現果糖能夠顯著激活Akt信號通路中的關鍵分子Akt的磷酸化水平。Sato等[29]同樣報道果糖給藥可以增強小鼠肝臟中Akt的磷酸化。原兒茶酸被證實具有抗氧化和抗炎等作用。Nam等[30]報道原兒茶酸可以抑制脂多糖誘導的Akt信號通路的激活。Wu等[31]同樣發現原兒茶酸可以顯著降低成纖維樣滑膜細胞（FLSs）中Akt和mTOR的磷酸化水平。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學研究方法結合非靶向代謝組學檢測，分析枳實-厚樸藥對治療STC的活性成分、關鍵靶點、相關通路之間的相互聯系，探討其潛在作用機制，結果表明枳實-厚樸藥對針對STC存在多成分、多靶點、多通路的作用特點，其中引起我們特別關注的是活性成分柚皮素和木犀草素，以及關鍵靶點Akt及其相關性代謝物煙酸、果糖和原兒茶酸。本研究結果為臨床選用枳實-厚樸藥對治療慢傳輸型便秘補充了理論依據，同時為后續基礎實驗提供了研究思路。

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