基于網絡藥理學和分子對接探討桂芍鎮癇片治療顳葉癲癇的作用機制

摘要：基于網絡藥理學研究桂芍鎮癇片抗顳葉癲癇的作用機制。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺檢索桂芍鎮癇片的有效成分和作用靶點，使用Uniprot 數據庫進行標準基因名轉化；通過OMIM，GeneCards和DrugBank數據庫檢索顳葉癲癇相關的疾病靶點，使用維恩圖獲得桂芍鎮癇片治療顳葉癲癇的交集靶點；運用Cytoscape 3.8.2軟件構建藥材-成分-靶標網絡圖，分析核心成分和關鍵分子靶點；使用基因本體富集和京都基因與基因組百科全書分析靶點的生物學過程和相關通路；使用前三個關鍵靶點與其對應的前兩個核心化合物進行分子對接驗證。通過篩選，共獲得127個有效成分和46個相關靶點，其中，β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚等14個成分發揮核心作用，涉及CALM1、SCN5A、GSK3B等11個關鍵靶點。抗癲癇作用主要涉及膜電位調節、藥物響應等生物學過程，突觸后膜和樹突等細胞組成，離子通道和鈣調蛋白等分子功能，神經活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮等相關通路。分子對接結果顯示CALM1、SCN5A、GSK3B三個靶點分別和對應的核心化合物有較好的結合能力。桂芍鎮癇片通過減輕氧化損傷和保護神經元，影響離子通道和受體、細胞內信號傳導、細胞凋亡和突觸結構等環節，多成分、多靶標、多通路地協同發揮抗癲癇作用。

關鍵詞：網絡藥理學；分子對接；桂芍鎮癇片；顳葉癲癇；作用機制

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）03-0027-11

Abstract∶To study the mechanism of Guishaozhenxian Tablet in the treatment of temporal lobe epilepsy （TLE） based on network pharmacology. Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform was used to retrieve the active ingredients and action targets of Guishaozhenxian Tablet， and the standard gene was transformed using the UniProt database. The OMIM， GeneCards， and DrugBank databases were searched for disease targets related to TLE， and the intersection targets of Guishaozhenxian Tablet in the treatment of TLE were obtained using a Venn diagram. The medicinal herb-component-target network diagram was constructed using the Cytoscape 3.8.2 software， and the core components and key molecular targets were analyzed.Gene Ontology enrichment and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes were used to analyze the biological processes and related pathways. The first three key targets and their corresponding top two core compounds were validated using molecular docking. In total， 127 active ingredients and 46 related targets were identified， with 14 ingredients， including β-sitosterol， quercetin， and kaempferol， playing a central role in 11 key targets such as CALM1， SCN5A， and GSK3B. The anti-TLE effect was primarily due to biological processes （regulation of membrane potential， response to drug， etc.）， cell components （postsynaptic membrane， dendrites， etc.）， molecular functions （channel activity， calmodulin binding， etc.）， neuroactive ligand-receptor interaction， nicotine addiction， and other related pathways. Molecular docking results showed that CALM1， SCN5A， and GSK3B had good binding abilities with core compounds. Guishaozhenxian Tablet can reduce oxidative damage; protect neurons; affect ion channels and receptors， intracellular signal transduction， apoptosis， and synaptic structure; and exert anti-TLE effects via multi-components， multi-targets， and multi-pathway coordination.

Key words∶network pharmacology; molecular docking; Guishaozhenxian Tablet; temporal lobe epilepsy; mechanism of action

顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是一種反復發作的慢性神經系統疾病，為臨床最常見的難治性癲癇。中醫稱癲癇為“癇病”，其病位在腦，但與肝、脾、心、腎等多臟器密切相關。傳統中醫藥有較多方劑應用于癲癇的預防治療，桂芍鎮癇片是《中國藥典》2020年版收載的成方制劑，以桂枝湯、小柴胡湯、芍藥甘草湯三方加減而成，研究顯示桂芍鎮癇片用于頑固性癲癇治療可取得較好療效[1]。桂芍鎮癇片與抗癲癇化學藥物聯合使用，具有增強療效、降低副作用的優點，但其有效化學成分及作用機制尚不明確。

網絡藥理學基于系統生物學與系統藥理學，通過構建藥材有效成分-靶點-疾病之間的綜合網絡來分析藥物作用機制，從尋找藥理作用的單一靶點轉向多靶點分析。與抗癲癇化學藥物相比，桂芍鎮癇片所含化學成分復雜，藥理作用具有多靶點、多層次的特點，網絡藥理學能夠為中藥現代化研究提供物質基礎和生物學理論基礎，是中藥作用機制研究的有效手段[2-3]。

本研究擬采用網絡藥理學方法系統分析桂芍鎮癇片的有效化學成分、靶點與疾病之間的關系，闡釋桂芍鎮癇片治療顳葉癲癇的分子機制，并通過分子對接技術對結果進行驗證，為中成藥治療顳葉癲癇提供物質基礎和理論依據。

1材料和方法

1.1有效化學成分和作用靶點的篩選

使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/）檢索桂芍鎮癇片中桂枝、黨參、甘草、大棗、白芍、半夏、黃芩、柴胡和生姜等9味中藥的全部化學成分名稱、結構及SMILE（simplified molecular input line entry specification）式，再以口服生物利用度（oral biovailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為指標篩選有效成分及其作用靶點。

1.2有效成分作用靶點的收集

將上述篩選后獲得的作用靶點導入Uniprot 數據庫 （https：//www.uniprot. org/），以物種“human”和“reviewed”為限制條件，將靶點蛋白轉換為對應的人源物種標準基因名。

1.3顳葉癲癇疾病靶點的收集和確認

使用OMIM（online mendelian inheritance in man）（https：//omim.org/）Gene map高級搜索模式，GeneCards（https：//www.genecards.org/）以“Relevance score”為指標，取大于2倍中位數的靶點，和DrugBank（https：//go.drugbank. com/）三個數據庫，以“temporal lobe epilepsy”為關鍵詞對疾病靶點進行檢索，合并3個數據庫收集的靶點信息，刪除重復值后，獲得顳葉癲癇的疾病靶點集。

1.4桂芍鎮癇片-顳葉癲癇共有靶點的確認

將桂芍鎮癇片有效成分的藥理作用靶點和顳葉癲癇的疾病治療靶點進行匯集，繪制維恩圖，獲得二者的交集靶點。

1.5藥材-成分-靶標網絡構建

利用Cytoscape 3.8.2軟件構建桂芍鎮癇片和交集靶標的藥材-成分-靶標網絡，使用“network analysis”進行網絡解析，以節點連接度為指標，采用中位數截斷法，篩選關鍵藥材、化學成分和靶點。

1.6GO富集分析

將共有靶標導入Metascape數據庫（https：//metascape.org）進行基因本體（gene ontology，GO）分析，選定物種為“Homo sapiens”。按默認閾值Plt;0.01，最小計數為3，富集因子gt;1.5收集條目，根據條目隸屬關系相似性分組相應集群。GO富集分析主要發掘化合物在生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）三個層面的功能。同時，利用Metascape數據庫中的MCODE（molecular complex detection）算法模塊，將蛋白質相互作用數據與通路和生物學過程富集數據相結合進行聚類分析，以研究其共有靶點參與的主要生物學過程。

1.7KEGG富集分析

將共有靶點導入DAVID數據庫（https：// david.ncifcrf.gov）進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway，KEGG）通路分析，富集桂芍鎮癇片藥理作用涉及的重要通路。

1.8分子對接驗證

采用分子對接的方法對網絡藥理學分析得到的桂芍鎮癇片前三個關鍵靶點與其對應的排名靠前的兩個核心化合物進行驗證。從 PubMed 數據庫（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov）下載獲取桂芍鎮癇片的活性小分子化合物的 2D 結構，保存為*SDF文件；使用Chem3D軟件進行3D格式轉化和能量最小化，保存為*mol2格式。通過 PDB 數據庫下載三個靶點的pdb格式的蛋白結構，包括CALM1（PDB ID：1CTR）、SCN5A（PDB ID：6LQA）和GSK3B（PDB ID：6Y9S），采用Pymol軟件對受體蛋白進行去水、去除原配體、加氫等預處理，再借助 AutoDockTools 1.5.6對蛋白質受體定義原子類型、計算電荷、并輸出為*pdbqt格式文件。將蛋白自帶的配體視為活性結合位點，根據其位置設置grid box坐標和大小，使用Autodock Vina 1.1.2進行對接，根據結合能（combination energy）篩選出最佳構象后用Pymol軟件對結果進行可視化分析。

2結果

2.1有效化學成分及其靶點

通過TCMSP數據庫檢索桂芍鎮癇片9味中藥材的全部化學成分，每味中藥材所含化合物成分數如表1所示。口服生物利用度和類藥性是化合物成藥的重要指標，經OB≥30%和DL≥0.18篩選后，9味中藥材的有效成分數大幅減少，去重后得到桂芍鎮癇片有效成分206個（表1）。繼續使用TCMSP對有效成分的藥理作用靶點進行檢索，每種中藥材成分靶點數列于表1，排除無對應人源物種標準基因名的靶點蛋白，刪除中藥材間的重復靶點，得到桂芍鎮癇片的有效成分的藥理作用靶點合計為285個。

2.2顳葉癲癇的藥物治療靶點

通過OMIM、GeneCards和DrugBank數據庫檢索獲得的顳葉癲癇相關疾病靶點數量分別為592、445和55，合并3個數據庫檢索的靶點數，去重后得到974個與顳葉癲癇相關的疾病治療靶點。

2.3桂芍鎮癇片-顳葉癲癇的共有靶點

利用桂芍鎮癇片的285個藥物靶點與顳葉癲癇的974個疾病治療靶點繪制維恩圖，獲得46個共同靶點。再根據靶點確定桂芍鎮癇片各藥材中治療顳葉癲癇的有效成分，共獲得有效抗癲癇成分127個（表1）。

2.4藥材-成分-靶點網絡

使用Cytoscape 3.8.2軟件將桂芍鎮癇片的9種藥材、127個有效成分與46個共同靶點構建藥材-成分-靶點的拓撲網絡（OSID科學數據與內容附圖1）。圖中節點表示藥材、有效成分、靶點基因等，邊數表示節點間的連接，線條代表兩者之間的相互連接作用，網絡圖中心為桂芍鎮癇片和顳葉癲癇。拓撲學網絡圖中通常采用連接度指標表示在網絡分析中節點的中心性，節點形狀的面積越大，代表該節點的連接度越大，則該節點在網絡中就越重要。從圖中可以見到桂芍鎮癇片的一個有效成分可作用于多個靶點，同時一個靶點也是多個成分的作用目標，體現了桂芍鎮癇片通過多成分、多靶點協同發揮抗癲癇作用。

2.5核心化合物及其關鍵作用靶點

經藥材-成分-靶點拓撲網絡分析，藥材、成分和靶點的連接度的中位數分別為16、8、12，因此，推斷桂芍鎮癇片包含甘草和黃芩兩種核心藥材，連接度分別為82和22，通過14個核心成分（OSID科學數據與內容附表1）作用于11個關鍵靶點（OSID科學數據與內容附表2）。14個核心成分中以β-谷甾醇的連接度最高，節點緊密度為 0.463，節點介度為0.059。其次為槲皮素，其節點緊密度和節點介度分別為0.460和0.055，并且與核心藥材相對應。11個關鍵靶點中CALM1、SCN5A和GSK3B的連接度高居前列，提示這3個靶點在桂芍鎮癇片治療顳葉癲癇中的重要性。

2.6共同靶點的GO富集分析

使用GO富集分析得到BP條目731條，CC條目88條，MF條目78條。根據P值從小到大順序，選取排名前列的條目（圖1）。BP條目分析顯示，桂芍鎮癇片抗癲癇作用主要與膜電位調節、藥物響應、金屬離子響應、轉運的負向調節、神經元死亡、細胞對含氮化合物的應答、尼古丁響應等生物學過程有關。CC條目分析顯示，桂芍鎮癇片抗癲癇作用主要與突觸后膜、膜筏、枝晶、質膜蛋白復合物、突觸囊泡等細胞組分有關。MF條目分析顯示，桂芍鎮癇片抗癲癇作用主要與通道活性、蛋白質特異性結合區域、蛋白酶結合、無機陽離子跨膜轉運蛋白活性，氧化還原酶活性等分子功能有關。

Metascape的MCODE模塊利用STRING、BioGrid、OmniPath、InWeb_IM等數據庫，對46個靶點蛋白進行分析，獲得網絡中蛋白之間的高度連通區域的基因聚類，如圖 2所示，圖中每種顏色代表了一個MCODE聚類。將GO富集分析應用于每個MCODE聚類，根據P值，對BP、CC和MF三個生物學進程各篩選出三個評分最高的GO條目，見表2。

2.7共同靶點的KEGG通路分析

通過KEGG通路富集分析得到79條信號通路，根據P值從小到大，選取排名前20條目進行可視化，如圖3所示。顏色越紅表示該條目富集越顯著，圓形越大表示該條目富集的基因越多。KEGG通路顯示桂芍鎮癇片抗癲癇作用可能與神經活性配體-受體相互作用、阿爾茨海默病、尼古丁成癮、肌萎縮側索硬化癥、多巴胺能突觸、PI3K-Akt信號通路、GABA能突觸和嗎啡成癮等神經系統信號通路有關，其中神經活性配體-受體相互作用通路富集的靶點數為11個，所占比例0.239 1，而尼古丁成癮通路最顯著，為1.18×10-7，這兩條富集通路的靶點信息見表3。

2.8分子對接驗證

網絡藥理學分析獲得的桂芍鎮癇片前三個關鍵靶標CALM1、SCN5A和GSK3B與其對應的2個核心化合物分子對接后，配體在靶標中的位置和作用方式的可視化處理分別如圖 4～6所示，圖中黃色虛線為氫鍵，鍵長單位為。由圖可見，CALM1與β-谷甾醇（結合能為-7.5 kJ/mol，圖 4（a））和山柰酚（結合能為-6.6 kJ/mol，圖 4（b））、SCN5A與豆甾醇（結合能為-10.6 kJ/mol，圖 5（a））和槲皮素（結合能為-8.8 kJ/mol，圖5（b））以及GSK3B與異鼠李亭（結合能為-8.7 kJ/mol，圖 6（a））和漢黃芩素（結合能為-8.6 kJ/mol，圖6（b））都能夠自發穩固地結合。Autodock Vina 軟件采用半經驗打分函數進行受體蛋白-小分子配體評估兩者的結合能力，當結合能≤-5. 0 kJ/mol 時，認為配體可以和受體較好地結合，并且結合能越低，越有利于構象的穩定。

3討論與結論

桂芍鎮癇片是以我國名醫張仲景的柴胡桂枝湯方劑為基礎研制的片劑，方中由柴胡、桂枝、白芍、黨參、大棗、生姜、半夏、黃芩、甘草等9味藥材組成。據《中國藥典》2020年版記載，桂芍鎮癇片具有調和營衛、清肝膽之功效，用于治療各種發作類型的癲癇[4]。本研究利用網絡藥理學的手段分析并探討桂芍鎮癇片的藥理作用機制，通過中藥數據庫和生物信息數據庫，篩選出桂芍鎮癇片127種有效成分和46個作用靶點，構建了藥材-成分-靶點網絡，確定了藥材核心成分14個，關鍵靶點11個，并通過GO富集和KEGG通路分析了46個作用靶點，揭示了與桂芍鎮癇片抗顳葉癲癇作用相關的生物學過程和信號通路。

經過藥材-成分-靶點網絡分析得到桂芍鎮癇片抗顳葉癲癇核心成分14個，文獻檢索顯示這些核心成分主要通過減輕氧化損傷、抑制炎癥、影響腦內遞質代謝和調節離子通道發揮神經保護和抗癲癇作用。其中，槲皮素、山柰酚、異鼠李亭、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、黃芩素和漢黃芩素均屬黃酮類化合物，不僅具有抗氧化活性，還可與GABAA受體結合發揮神經保護作用[5]。研究顯示黃芩素和漢黃芩素可通過調節鉀通道，抑制凋亡相關基因以保護神經元，減少癲癇發作[6-7]。此外，柚皮素、木犀草素、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、豆甾醇和右旋光千金藤堿除顯示良好的抗氧化活性之外，也具有抑制炎癥反應的作用。研究表明，柚皮素和木犀草素不僅可以對抗神經元氧化損傷，還能抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化增生，減輕腦內炎癥反應，減少癲癇發作[8-10]。β-胡蘿卜素是有效的自由基清除劑和脂質抗氧化劑，動物實驗中顯示出良好的抗癲癇活性[11]。β-谷甾醇可增加小鼠腦內去甲腎上腺素、5-羥色胺及其代謝產物的水平，顯示出對海馬神經元的保護作用[12-13]。豆甾醇則通過影響即早基因表達，增加抗氧化酶活性，發揮神經保護作用[14-15]。右旋光千金藤堿可抑制小膠質細胞激活，減輕神經炎癥，對神經細胞具有保護作用[16]。荷葉堿是Cl-、Ca2+、K+等多種離子通道調節劑，通過影響5-羥色胺和多巴胺受體功能而改善癲癇發作[17]。值得注意的是，β-谷甾醇和槲皮素作為桂芍鎮癇片核心成分，與其他節點的連接度分別高達79和66，并且對應于黃芩和甘草兩味核心藥材，表明其在抗顳葉癲癇作用中扮演主要角色，也提示減輕氧化損傷和影響腦內兒茶酚胺類遞質代謝可能作為桂芍鎮癇片抗癲癇作用的重要機制。

藥材-成分-靶點網絡分析顯示桂芍鎮癇片關鍵靶點11個，這些靶點分為離子通道類、受體類、細胞凋亡因子類和信號調節類。離子通道類靶點包括SCN5A、KCNH2和SLC6A3，受體類靶點包括GABRA1、CHRNA7、OPRM1和GABRA3，細胞凋亡因子類靶點包括BCL2和CASP3，信號轉導類靶點包括CALM1和GSK-3β。11個靶點中受體類占比0.36，包括γ氨基丁酸受體（GABAR A1和A3）、α7煙堿型乙酰膽堿受體（CHRNA7）和阿片受體（OPRM1），說明與興奮性調節相關的腦內受體是桂芍鎮癇片抗癲癇的主要靶點。分子對接實驗也說明了這些關鍵靶點與有效成分有較好的結合能力。本課題組前期試驗也證實，使用α7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑治療可以減少顳葉癲癇大鼠的發作次數，減輕海馬損傷[18]。此外，電壓依賴性鈉、鉀離子通道和細胞凋亡因子也是桂芍鎮癇片抗癲癇的重要靶點，可通過抑制離子通道所致的異常興奮，減少凋亡發揮抗顳葉癲癇作用。值得關注的是，信號調節類靶點CALM1和GSK-3β的連接度分別為105和63，體現了這兩個靶點的重要性。CALM1和GSK-3β作為細胞內重要的信號調節分子，與突觸重塑、長時程增強和神經元存活相關，參與癲癇的發生發展過程[19-20]，提示細胞內信號調節可能是桂芍鎮癇片與相關靶點結合后發揮抗顳葉癲癇作用的關鍵機制。

GO富集分析顯示，桂芍鎮癇片主要通過調節膜電位和對藥物的響應等生物學過程，影響突觸結構等細胞成分，干預離子通道活性等分子功能發揮抗顳葉癲癇作用。而由MCODE模塊進一步推斷了其與突觸后膜電位的調節、樹突膜、GABAA復合體、GABA門控氯離子通道活性、細胞外配體門控離子通道活性相關。這一結果也與藥材-成分-靶點網絡圖分析得到的桂芍鎮癇片關鍵作用靶點一致，體現了離子通道類靶點（γ氨基丁酸受體、α7煙堿型乙酰膽堿受體）和細胞內信號傳導（與突觸重塑和癲癇耐藥性有關）在桂芍鎮癇片抗顳葉癲癇作用中的重要性。KEGG通路分析顯示桂芍鎮癇片抗顳葉癲癇作用主要與神經活性配體-受體相互作用信號通路、尼古丁成癮通路有關，這兩條通路都與γ氨基丁酸受體、α7煙堿型乙酰膽堿受體、阿片受體和腎上腺素受體等靶點聯系緊密，進一步呼應了藥材-成分-靶點網絡分析結果，說明受體類靶點及其相關的信號通路參與桂芍鎮癇片的抗顳葉癲癇作用，而尼古丁成癮通路值得深入研究關注。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學和分子對接方法探討了桂芍鎮癇片抗顳葉癲癇作用機制。通過對核心成分和關鍵靶點的分析，推測其主要作用于腦內受體和離子通道，調節膜電位，影響細胞內信號傳導、細胞凋亡和突觸結構等環節，多成分、多靶標、多通路協同發揮抗顳葉癲癇作用。本研究還顯示，除了減輕氧化損傷和抑制炎癥，桂芍鎮癇片的核心成分也可能通過影響腦內遞質代謝和離子通道發揮神經保護和抗顳葉癲癇作用。雖然以上機制需要進一步驗證，但本研究初步揭示了桂芍鎮癇片的核心物質基礎和潛在的生物學靶點，為開展深入研究提供了依據。

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