浙北海域抗生素抗性基因與細菌群落的耦合關系

摘要：隨著抗生素的廣泛使用，抗生素抗性基因（ARGs）在環境中不斷傳播與富集，現已成為一種新型污染物，影響生態平衡。研究表明，海域生態環境已成為ARGs的重要儲存庫。浙北海域是我國重要海域之一，魚類資源豐富，水產養殖業發達。本文采集不同點位的底泥樣品，通過試驗研究浙北海域抗生素抗性基因與細菌群落的耦合關系，有利于浙北海域的生態環境保護。

關鍵詞：抗生素；抗性基因；細菌群落；耦合關系；浙北海域

中圖分類號：X55 文獻標識碼：A 文章編號：1008-9500（2023）04-00-03

DOI：10.3969/j.issn.1008-9500.2023.04.005

Coupling Relationship between Antibiotic Resistance Genes and Bacterial Communities in the Northern Zhejiang Sea Area

XIE Sa

（Ningbo Dingbang Enterprise Management Consulting Co.， Ltd.， Ningbo 315103， China）

Abstract： With the widespread use of antibiotics， antibiotic resistance genes （ARGs） continue to spread and accumulate in the environment， becoming a new type of pollutant that affects ecological balance. Research has shown that the marine ecological environment has become an important repository for ARGs. The northern Zhejiang sea area is one of the important sea areas in China， with abundant fish resources and developed aquaculture industry. This paper collects sediment samples from different locations and conducts experiments to study the coupling relationship between antibiotic resistance genes and bacterial communities in the northern Zhejiang sea area， which is beneficial for the ecological environment protection of the northern Zhejiang sea area.

Keywords： antibiotics; resistance genes; bacterial community; coupling relationship; northern Zhejiang sea area

陸源污染是造成浙北海域水質富營養化的主要原因。長江、錢塘江等外流域河流注入東海的污染物是浙北海域的主要陸源污染物，其次是本海域沿岸生產生活污水中攜帶的污染物，陸地表面隨雨水入海的面源污染物，企業、個人非法向海洋傾倒的垃圾等污染物。本文采用高通量熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）技術，對浙北海域7個區域的32個點位底泥樣品中150種抗生素抗性基因（ARGs）和6種可移動遺傳元件（MGEs）進行定量分析，使用相關性分析找出主要ARGs與細菌群落的耦合關系，并結合生物理化性質進行冗余分析，研究影響ARGs和細菌群落分布的主要環境因子。

1 采樣與樣品處理方法

1.1 樣品采集

本次試驗選取浙北海域32個采樣點，依據水文和地理特征分為7個海域。杭州灣海域的采樣點編號分別為HZ1、HZ2、HZ3、HZ4、HZ5；象山港海域的采樣點編號分別為XS1、XS2、XS3、XS4、XS5；三門灣海域的采樣點編號分別為SM1、SM2、SM3、SM4、SM5；舟山島海域的采樣點編號分別為ZS1、ZS2、ZS3、ZS4；漁山保護區海域的采樣點編號分別為YS1、YS2、YS3、YS4；象山東海域的采樣點編號分別為JICR1、JICR2、JICR3、JICR4；外島鏈海域的采樣點編號分別為IC1、IC2、IC3、IC4、IC5。根據《海洋監測規范 第3部分：樣品采集、貯存與運輸》（GB 17378.3—2007）的要求，采集32個點位的沉積物。

1.2 樣品處理

利用箱式采樣器，采集浙北海域32點位的底泥樣品，將多份樣品分裝于聚乙烯袋，再將聚乙烯袋放置在冰箱中（溫度-20 ℃），在一周內將樣品轉移到實驗室，在溫度-80 ℃下保存[1]。

1.3 基本理化性質的測定

1.3.1 pH的測定

稱取10 g通過1 mm篩孔的風干底泥置于25 mL燒杯中，加蒸餾水10 mL混勻，靜置30 min，用經過三點校正的pH計測定上清液pH，每個點位平行測定3次，最后結果取算數平均值。

1.3.2 底泥細沙比的測定

底泥細沙比用比重計法測定。

1.3.3 硝態氮及銨態氮的測定

底泥硝態氮用氯化鈣浸提-紫外分光光度法測定，底泥銨態氮用氯化鉀浸提-靛酚藍比色法（分光光度法）測定。

2 結果與討論

2.1 各點位底泥中ARGs與MGEs的組成和分布

32個底泥樣品中共檢出150種ARGs、4種轉座子基因和2種整合子基因。在所有底泥樣品中，ARGs檢出數量為28～112種，平均每個底泥樣品檢出68種；MGEs檢出數量為3～5種，平均每個底泥樣品檢出4種。檢出的ARGs主要種類為多重耐藥性類（34.05%），由多到少的排序為β-內酰胺類（20.92%）、大環內酯類-林可酰胺類-鏈陽性菌素B類（11.58%）、氨基糖苷類（10.98%）、萬古霉素類（9.79%）、四環素類（7.00%）、氯霉素類（3.48%）及磺胺類（0.55%）[2-3]。每個點位底泥樣品檢出的ARGs數量有所不同，在7個區域中，至少有兩個區域檢測到的分度結果差異顯著。檢出的ARGs按照抗性機制比例由高到低分為外排泵、抗生素失活、細胞保護及其他類，比例分別為63.38%、24.61%、4.90%、2.11%。

7個區域中，三門灣海域5個采樣點檢出的ARGs平均個數最高，此地受抗生素污染較為嚴重，這5個點位都分布在灣區沿海，檢出率最高的是SM1，其他4個點位檢出率較低。對于杭州灣海域，HZ1離錢塘江入海口最近，檢出的ARGs個數最高，研究發現，ARGs的分布呈現從入海口到海洋逐漸降低的趨勢，入海口排放是造成海洋抗生素污染的關鍵因素。對于外島鏈海域，IC1靠近象山東海域，ARGs檢出個數最高，此采樣點的個數與象山東海域采樣點的平均個數相似，說明IC1采樣點可能受象山東海域影響。對于象山港海域，XS1和XS2檢出的ARGs個數相對于XS3、XS4、XS5較低。對于舟山島海域，ZS1和ZS2檢出的ARGs個數高于ZS3和ZS4。對于漁山保護區海域，4個采樣點ARGs檢出個數相似。

7個區域所有點位都檢出cIntI-1和intI-1兩類整合子，轉座子為2～4個[4]。

大量科學研究表明，平均每個細胞內含有4個16S核糖體核糖核酸（16S rRNA）。為了更加全面地分析ARGs在整個細菌群落的傳播風險和相對豐度，將ARGs和MGEs的豐度歸一化到單個細菌水平。相對豐度為平均每個細胞中ARGs和MGEs的基因拷貝數。在所有采樣點中，ARGs的相對豐度范圍為0.03～0.40 copies/cell，平均相對豐度為0.14 copies/cell。

32個底泥樣品中，主導ARGs類型為多重耐藥類（65.26%）、β-內酰胺類（14.11%）、氨基糖苷類（8.01%）。多重耐藥類抗性基因（MexF、oprJ、oprD），β-內酰胺類抗性基因（fox5、blaSFO、blaTEM），氨基糖苷類抗性基因（aphA1（aka_kanR）、aacC）為底泥樣品中的主導ARGs。MGEs的豐度范圍為0.001～0.260 copies/cell，平均每個細胞內有0.04個MGEs。對于32個點位的ARGs相對分度，比較分析發現，象山港海域的XS3、XS4、XS5的ARGs相對豐度高于XS1和XS2，這個規律與ARGs檢出個數一致，但這三個點位的抗性基因相對豐度是這

32個點位中最高的[5]。象山港海域有豐富的水產資源，水產養殖業發達，在高密度的水產養殖模式下，為有效控制細菌的生長和疾病的發生，提高產量，縮短生長周期，通常會加大抗生素的使用量。

2.2 各點位底泥中細菌群落的分布特征

利用高通量測序對32個點位底泥沉積物的微生物進行生物學分類，共有60個門、190個綱。在門水平上，相對豐度前十的菌群分別是變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、浮霉菌門、硝化螺旋菌門、匿桿菌門、ε-變形菌門，占總豐度的94.45%。其中，變形菌門是浙北海域沉積物中的主導菌門，相對豐度超過50%。在綱水平上，相對豐度前五的菌群分別是γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、厭氧繩菌綱、α-變形菌綱、類桿菌綱，占總豐度的70.75%。

2.3 主要ARGs與細菌群落的耦合關系

對32個點位大量檢出的8種ARGs（mexF、oprJ、oprD、fox5、blaSFO、blaTEM、aphA1（aka_kanR）、aacC）相對豐度與大量檢出的前10種門水平的細菌群落進行Spearman相關性分析。

不同的ARGs與細菌群落存在相應聯系，說明ARGs在海域中的宿主菌存在差異。對比分析發現，酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門與8類抗性基因都存在較強的相關性，原因可能是它們具有類似的宿主菌，也可能是MGEs使得ARGs在幾種菌落間發生轉移。值得注意的是，硝化螺旋菌門與氨基糖苷類抗性基因（aphA1（aka_kanR））和β-內酰胺類抗性基因（blaTEM）均有較強的正相關，硝化螺旋菌門大量存在于水體環境中，對微生物群落的氮循環起到關鍵作用，所以氨基糖苷類抗性基因和β-內酰胺類抗性基因的產生和轉移可能是影響海水中氮循環的關鍵，使海水中氮元素富集，破壞海洋生態環境，甚至引發赤潮等海洋災害。經分析，浙北海域的幾種主要抗生素抗性基因與細菌群落相互作用、相互影響，即存在耦合關系。

3 結論

經試驗測定，底泥樣品中多重耐藥類抗生素抗性基因的相對豐度最大，表明浙北海域受此類抗性基因的污染最大，原因可能是為了提高產量，水產養殖業大量使用多種復合型抗生素，經過海水傳播和富集，使細菌種群突變，具有多重耐藥性的細菌更具有優勢。海洋生態系統是ARGs的重要儲存庫，對比ARGs和MGEs的相對豐度，經Person相關性分析，相關系數為85%，大于50%，表明二者存在顯著的正相關，可能是因為ARGs的水平基因轉移促進ARGs在海域間的富集和傳播，使細菌產生多重耐藥性，對人體健康造成危害。Spearman相關性分析表明，大量檢出的主要ARGs和細菌群落相互作用、相互影響，即存在耦合關系。冗余分析表明，環境因子能夠影響ARGs和細菌群落的分布，氨氮是影響底泥中ARGs和細菌群落組成和分布的最主要環境因素。本研究選取浙北海域7個主要區域的32個點位的底泥樣品作為研究對象，對海域生態環境中ARGs的分布特征和傳播機制進行探究。但是，因為時間和技術的限制，未對浙北海域全域進行采樣，也未采集水體樣本，分析不夠全面，后續研究可在時間和空間上對浙北海域全域ARGs和細菌群落組成分布規律進行探討，補足水體樣本，再結合宏基因組進行深入分析。

參考文獻

1 朱 泋.本世紀的十大發現（四、五）激光的出現、抗生素的誕生[J].世界知識，1987（21）：1.

2 鄧 力，李法松.水環境中抗生素污染現狀與檢測方法[J].山東農業工程學院學報，2020（10）：43-45.

3 何 燕.嘉陵江流域抗生素抗性基因的分布特征和傳播機制探究[D].南充：西華師范大學，2020：11-12.

4 李云莉.中國沿海典型養殖水域抗生素及其抗性基因污染的初步研究[D].上海：上海海洋大學，2017：15-16.

5 王 玥.海水中大腸桿菌耐藥性及其整合子介導的耐藥基因研究[D].大連：大連海洋大學，2015：18-19.