非編碼RNA 對肺癌中鐵死亡調(diào)控作用的研究進展

杜林，陳峰，徐醫(yī)軍 綜述，張遜 審校

（天津市胸科醫(yī)院胸外科，天津 300222）

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是所有不被翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA 的統(tǒng)稱，按照核苷酸大小分類分為小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）[1-3]。ncRNA 可通過調(diào)控mRNA 來影響相關(guān)靶基因的表達，各種ncRNA 之間也存在相互作用。在2012 年，研究人員意外發(fā)現(xiàn)了一種依賴Fe2+催化作用的細胞程序性死亡方式，將其命名為細胞鐵死亡[4]。鐵死亡的生物學(xué)特征主要表現(xiàn)為線粒體萎縮、膜密度增加、線粒體嵴減少以及活性氧簇（ROS）聚集等[5]。鐵死亡的發(fā)生機制包括：（1）Fe2+的代謝：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferring receptor，TFR）介導(dǎo)Fe2+的轉(zhuǎn)運，鐵蛋白的兩條肽鏈重鏈和輕鏈可以調(diào)控Fe2+的儲存。（2）脂代謝異常和ROS 的積累：脂氧合酶（LOX）催化不飽和脂肪酸的過氧化并影響鐵死亡，核因子e2 相關(guān)因子2-kelch 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（NRF2-KEAP1）系統(tǒng)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，抵抗外源性和內(nèi)源性的氧化損傷，調(diào)節(jié)機體抗氧化蛋白的表達。（3）谷胱甘肽（GSH）的抗氧化作用：鐵蛋白和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）調(diào)控GSH 的合成，GSH是一種鐵死亡的抑制劑，能通過清除細胞自由基抑制鐵死亡，而其合成異常也可導(dǎo)致鐵死亡。近期研究表明，鐵死亡在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，成為近年來研究的熱點。因此本文對近期ncRNA 調(diào)控肺癌中細胞鐵死亡的相關(guān)研究進展進行介紹，為肺癌鐵死亡相關(guān)研究提供參考。

1 lncRNA 通過影響脂代謝和ROS 積累，調(diào)節(jié)細胞鐵死亡

由于外界因素誘導(dǎo)，細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被擾亂，脂質(zhì)相關(guān)基因表達異常，導(dǎo)致細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物大量積累，隨即引發(fā)細胞鐵死亡[6-7]。因此，對脂質(zhì)氧化代謝的調(diào)控是影響鐵死亡的重要機制。Sato 等[8]采用肺癌PC9、A549 和H358 細胞系，對lncRNA LINC00336 調(diào)控細胞鐵死亡的機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)LINC00336定位于細胞核內(nèi)，過表達LSH 基因可誘導(dǎo)LINC00336轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，無論是在肺腺癌細胞系還是在肺鱗癌細胞系中都有高表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ELAV樣RNA 結(jié)合蛋白1（ELAV-like RNA-binding protein 1，ELAVL1）是LINC00336 的上游調(diào)控因子，LSH 可通過抑制p53 的活性來誘導(dǎo)ELAVL1 的表達，進而ELAVL1 通過穩(wěn)定其轉(zhuǎn)錄水平來上調(diào)LINC00336的表達。隨后，通過RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）和RNA 蛋白拉拽沉淀證實了LINC00336 通過內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的吸附作用來抑制miR-6852 的活性，而miR-6852 的靶蛋白即是CBS，其同樣可發(fā)揮ceRNA 的作用來抑制CBS mRNA 的轉(zhuǎn)錄。因此，LINC00336 對CBS 有上調(diào)作用，最終抑制腫瘤細胞鐵死亡，促進腫瘤的形成與發(fā)展。該研究完整地呈現(xiàn)了LSH/p53/ELAVL1/LINC00336/miR-6852/CBS 軸的分子調(diào)控機制。另外，Chao 等[9]研究了lncRNA MT1DP 調(diào)節(jié)細胞鐵死亡的分子機制，發(fā)現(xiàn)MT1DP 可通過抑制miR-365a-3p 的表達，進而抑制細胞的抗氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活與加重。MiR-365a-3p 的異常表達可顯著下調(diào)NRF2 的表達水平，從而調(diào)節(jié)erastin 介導(dǎo)的肺癌細胞鐵死亡。這項研究最終證實了可通過MT1DP/miR-365a-3p/NRF2 軸來調(diào)控erastin 介導(dǎo)的肺癌細胞鐵死亡，這兩項研究成果為后續(xù)研究lncRNA 調(diào)控鐵死亡的分子機制提供了理想范例。

2 miRNA 通過影響GPX4 的表達調(diào)控肺癌細胞 鐵死亡

胱氨酸可在胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運受體（System Xc-）的作用下還原為半胱氨酸，而后者是GSH 合成的原料之一[10]。GSH 可在GPX4 的催化作用下由還原型轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸停瑫r對細胞內(nèi)的過氧化物進行還原，以抑制細胞鐵死亡[11]。因此System Xc-、GSH、GPX4 構(gòu)成了細胞內(nèi)重要的抗氧化體系，同時也是細胞鐵死亡的重要負調(diào)控因子。許多正負調(diào)控鐵死亡的相關(guān)因子都是通過調(diào)控這個重要的抗氧化體系來發(fā)揮作用的。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-3p 是二甲雙胍誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生細胞鐵死亡的靶點，說明miR-324-3p 不僅是鐵死亡的誘導(dǎo)因素，而且參與了二甲雙胍抗乳腺癌的作用機制[12]。Huang 等[13]以A549/DDP 肺癌細胞系為研究對象，結(jié)果表明，過表達miR-324-3p 的細胞中GPX4 表達水平顯著降低，而熒光素酶標記的結(jié)果也表明，GPX4 是miR-324-3p 的直接靶點。該研究揭示了A549/DDP 細胞中miR-324-3p/GPX4信號軸的作用，且該信號軸也可能是逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌順鉑耐藥的潛在靶點。

miR-338 是另一種可靶向調(diào)控GPX4 的miRNA，在肝癌、胃癌、肺癌等腫瘤組織中的表達量與正常組織相比均顯著降低[14-15]。Chen 等[16]和Tarangelo等[17]采用PCR 對肺癌組織、癌旁組織、肺癌細胞系和正常肺部細胞系的miR-338 和GPX4 mRNA 水平進行檢測，并采用雙熒光素酶法驗證miR-338 和GPX4 的關(guān)系，結(jié)果表明，與癌旁組織、正常細胞相比，肺癌組織以及肺癌細胞系中miR-338 表達水平均顯著降低，雙熒光素酶也證實miR-338 和GPX4的直接作用。此外，對miR-338 進行過表達處理，可以明顯提高腫瘤細胞系ROS 水平，并有效抑制腫瘤細胞生長和遷移，而加入細胞鐵死亡抑制劑，可以削弱甚至逆轉(zhuǎn)miR-338 的抑制腫瘤細胞生長和遷移作用。最終證實miR-338 可通過負調(diào)控GPX4 的表達進而促進腫瘤細胞鐵死亡，從而抑制腫瘤細胞的生長和遷移。

3 lncRNA 通過調(diào)控p53 的表達促進肺癌細胞鐵死亡

眾所周知，p53 介導(dǎo)的細胞衰老和細胞凋亡是抑制腫瘤生長、遷移的關(guān)鍵。但除此之外，p53 還可以通過調(diào)節(jié)RNA 轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯來誘導(dǎo)細胞鐵死亡的發(fā)生[18-19]。一方面，p53 通過抑制溶質(zhì)載體家族7 成員11 的表達，或通過提高亞精胺/精胺n1-乙酰轉(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶2 兩種重要蛋白的表達來增強細胞鐵死亡；另一方面，p53 可通過直接抑制二肽基肽酶4 的蛋白活性來抑制erastin 所誘導(dǎo)的細胞鐵死亡的發(fā)生，還可通過誘導(dǎo)cyclin 依賴激酶抑制因子表達、減緩細胞內(nèi)GSH 的消耗和減少ROS 積累來抑制細胞鐵死亡。由此可見，p53 對細胞鐵死亡的調(diào)控具有明顯的生物雙向性，這與細胞系、細胞環(huán)境息息相關(guān)。因此p53 上下游相關(guān)通路的調(diào)控對鐵死亡的影響是十分復(fù)雜的。Song 等[20]和Kenneth 等[21]對比了A549 等7 種肺癌細胞系和MRC-5 等2 種正常肺部細胞系的細胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA p53RRA 的表達水平，結(jié)果表明，在腫瘤細胞中，p53RRA 表達水平顯著下調(diào)。證明p53RRA 可以直接作用于靶蛋白功能域，從而調(diào)控p53 的表達和移位，促進細胞鐵死亡，抑制腫瘤的進展。

4 ncRNA 調(diào)控肺癌鐵死亡的其他機制

Lu 等[22]采用A549 肺癌細胞系進行順鉑耐藥誘導(dǎo)實驗，研究敲降或過表達miR-4443 對細胞鐵死亡的影響。實驗結(jié)果表明，過表達miR-4443 可以通過與鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）相互作用，進而抑制順鉑介導(dǎo)的細胞鐵死亡，并促進肺部腫瘤的體內(nèi)生長。另一項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1 在肺癌細胞鐵死亡中具有重要調(diào)節(jié)作用[23]。酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）是一種重要的脂肪酸激活酶，可通過調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)組合來影響細胞鐵死亡的敏感性，是一種經(jīng)典的細胞鐵死亡抑制因子。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NEAT1 和ACSL4 具有直接結(jié)合的分子靶區(qū)，表明NEAT1 與ACSL4 的靶向結(jié)合可以抑制ACSL4 的正常表達，導(dǎo)致肺癌細胞對細胞鐵死亡的敏感性。同時，NEAT1 增強了肺癌細胞對erastin 誘導(dǎo)細胞鐵死亡的敏感性，最終導(dǎo)致肺癌細胞的鐵死亡。

5 肺癌細胞鐵死亡ncRNA 的潛在調(diào)控靶點

5.1 參與肺癌細胞中鐵離子的轉(zhuǎn)運調(diào)控 細胞鐵死亡離不開鐵離子的介導(dǎo)。TFR1 可以與其配體結(jié)合并內(nèi)化，以維持細胞內(nèi)鐵離子的穩(wěn)定[24]。TFR1 受多種ncRNA 調(diào)控，其水平下調(diào)可激活細胞鐵死亡通路[25-26]。lncRNA PVT1 在肺癌細胞中有表達，且其對肺癌細胞增值的促進作用也已被證實[27]。PVT1 的下游靶向miR-214-3p 也可通過下調(diào)TFR1，從而對細胞鐵死亡有調(diào)節(jié)作用。但PVT1/miR-214-3p 軸對肺癌中鐵死亡的作用尚未見報道。

5.2 肺癌鐵死亡調(diào)控相關(guān)ncRNA 的生物信息學(xué)分析 Kirill 等[28]對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)9 個與鐵死亡預(yù)后相關(guān)的lncRNA，均可獨立地用來預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后，并可能成為新的治療靶點。Wu 等[29]則對非小細胞肺癌的臨床樣本基因表達譜進行生物信息學(xué)分析，最終確定了10 個既與非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)，又與細胞鐵死亡相關(guān)的lncRNA，然后選取其中9 個lncRNA 分子用于構(gòu)建非小細胞肺癌預(yù)后模型，并將非小細胞肺癌患者分為高風(fēng)險和低風(fēng)險兩組。結(jié)果顯示，高風(fēng)險組患者的預(yù)后更差。上述研究為臨床探索相應(yīng)的治療靶點與生物標志物提供了新穎而有益的科研思路。但是，關(guān)于ncRNA 調(diào)控肺癌中細胞鐵死亡機制的研究仍在起步階段，現(xiàn)有的文獻報道尚未完全揭示肺癌中鐵死亡的發(fā)生、發(fā)展與調(diào)控可靠的機制。首先，各項研究都是以肺癌細胞系樣本（如A549、H358 等）為主[30]，并未對臨床樣本進行大規(guī)模、系統(tǒng)化的深入研究與探討。其次，只有少部分研究探尋了某個lncRNA/miRNA 軸對下游因子以及鐵死亡相關(guān)因子的調(diào)控作用，很多研究都只停留在某個lncRNA 或miRNA 的單一作用上，也未研究其上游有哪些調(diào)控因子可以影響其表達，也并未對ncRNA 調(diào)控系統(tǒng)進行全面分析。第三，circRNA 對腫瘤中鐵死亡的影響已于其他腫瘤報道[31]，但是在肺癌領(lǐng)域仍未發(fā)現(xiàn)circRNA 對細胞鐵死亡的調(diào)控作用。第四，細胞鐵死亡有其特殊的細胞形態(tài)學(xué)特征，如線粒體嵴減少、細胞膜破裂等，但有某些關(guān)于細胞鐵死亡的研究并未給出明確的細胞電鏡結(jié)果，而現(xiàn)在的學(xué)術(shù)界普遍認為電鏡結(jié)果是證明細胞發(fā)生鐵死亡的金標準[32]。第五，細胞鐵死亡與藥物耐藥之間的研究僅停留在順鉑等1～2 種藥物上[33]，對于靶向藥、免疫檢查點抑制劑的耐藥，鐵死亡抵抗究竟是否參與其中尚不得知。相信隨著研究的不斷深入，一定能揭示出更多關(guān)于鐵死亡與腫瘤之間的奧秘，為對抗腫瘤提供更為有利的醫(yī)學(xué)武器。