BRAF(V600E)基因突變與兒童先天性色素痣的增殖活性及組織病理學特征的相關性研究

陳見友 蘇 偉 劉曉雁 張高磊

首都兒科研究所附屬兒童醫院皮膚科，北京,100020

先天性色素痣(congenital melanocytic nevi，CMN)是由來源于神經嵴的黑素細胞良性增生而形成，在出生時或生后數周內即可發現。CMN的分類在過去只是單純根據大小來進行的。近年來，專家共識建議根據預計成人大小(predicted adult size，PAS)、伴隨痣數量和數個形態描述性指標來進行分類。小型CMN是指PAS<1.5 cm，中型CMN是指1.5 cm≥PAS<20 cm(M1:1.5～10 cm,M2: >10～20 cm)，大型CMN是指20 cm≥PAS<40 cm(L1: >20～30 cm, L2:>30～40 cm)，而巨型CMN是指PAS≥40 cm(G1: >40～60 cm, G2: >60 cm)[1]。

CMN通常是良性的黑素細胞腫瘤，主要存在NRAS 或BRAF兩種體細胞突變。既往國外文獻報道顯示，中小型CMN更容易出現BRAF V600E突變，而大/巨型CMN則更容易出現NRAS(Q61K)突變[2-4]。超過80%的黑素細胞痣含有BRAF突變[5],而BRAF(V600E)突變是黑素瘤中最常見的驅動因子，在RAS/絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)中編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶[6-7]。

伴有BRAF(V600E)突變的黑素瘤具有某些組織病理學特征，包括表皮內散在黑素細胞、表皮內黑素細胞巢狀形成、表皮增厚和較大的痣細胞[8]。然而，伴有BRAF(V600E)基因突變的CMN的增殖活性和組織病理學特點尚無相關報道。

本研究中，我們的主要目標是確定BRAF(V600E)基因突變對CMN的增殖活性和組織病理學特征的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究經首都兒科研究所倫理審查委員會批準(SHERLL2020054)并根據《赫爾辛基宣言》進行的。2018年12月至2020年12月, 在首都兒科研究所附屬兒童醫院皮膚科門診收集了185例CMN 患者。入選標準為：生后既有或者生后1個月內發現的色素痣。排除標準：藍痣、spitz 痣、出生1個月后才發現的色素痣或發病時間不詳的色素痣。入組前，每位患者由監護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本組織的處理 185例CMN全部手術切除并將標本分成兩部分, 其中一部分放在福爾馬林里固定并進行HE染色，然后根據Marchetti等提出的方法進行評估[4]；第二部分：將多余的皮損及脂肪組織去除后迅速置于-80℃冰箱保存。根據既往文獻報道的方法進行DNA提取[3]，根據制造商的操作說明使用QIAamp DNA 迷你試劑盒Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)。我們進行了BRAF和NRAS基因突變檢測。其中，發現24例CMN具有BRAF(V600E)突變，并作為突變組，從其余患者中隨機選取24例沒有BRAF V600E突變的CMN作為對照組，根據患者的性別、年齡、痣的大小和解剖部位進行嚴格匹配。

1.2.2 組織病理學分析 一共獲得了48個HE染色的切片。對HE染色的切片進行組織病理學分析，并量化以下參數:(1)組織病理學分類(交界痣, 復合痣或皮內痣)；(2)主要顯微解剖生長模式；(3)交界部位黑素細胞巢的數量；(4)黑素細胞浸潤的深度:①表皮內；②真皮淺層(1分)；③真皮中層(2分)；④真皮深層(3分)；⑤皮下脂肪層(4分)；(5)結構特征和細胞異型性。顯微解剖生長模式量化為:①表皮內為主；②表皮部分和真皮部分幾乎相等；③主要在真皮。任何結構紊亂和/或細胞異型性的存在被視為陰性或陽性。

1.2.3 免疫組化方法評價CMN的增殖活性 一共獲得了48例CMN的石蠟塊。進行Ki67的免疫組化檢測。該抗體為小鼠抗人單克隆抗體(Clone OTI8H5, ZSBG-Bio, CHINA)。在400倍顯微鏡放大視野下計數ki67陽性痣細胞數(每視野實際覆蓋面積0.11 mm2)。ki67陽性痣細胞可在真皮-表皮交界處形成巢，能夠與表皮角質形成細胞區分。隨機選取10個高倍視野記錄陽性痣細胞數。用平均陽性痣細胞數表示Ki67指數，并評價陽性細胞的位置和分布規律。

在5 μm厚的福爾馬林固定石蠟包埋組織切片上進行免疫組化研究。在相同條件下，所有切片均采用免疫組化pv-9000兩步法進行Ki67蛋白染色。切片常規脫蠟水合，高壓修復，內源性過氧化物酶阻滯劑。室溫孵育10 min，蒸餾水洗凈，PBS泡5 min, 3次。加入Ki67一抗(克隆OTI8H5, ZSBG-Bio，中國1∶100稀釋)，37℃孵育1 h。用PBS浸泡洗滌2次，每次5 min。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS v.22進行統計分析。根據BRAFV600E基因突變狀態進行分層描述性統計，連續變量采用均值和標準差(SD)。采用配對t檢驗比較連續資料的均數。對二分類變量的組織病理學特征與Ki67指數進行相關及偏相關系數的顯著性檢驗。所有給定的P值都是雙尾性的，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 CMN(n=48, 共24對)數據見表1。突變組和對照組的CMN特征。突變組和對照組在性別、年齡、痣大小和解剖部位上都是嚴格匹配的。兩組間在年齡、性別、黑素瘤史和非黑素瘤皮膚癌史上沒有統計學差異。

表1 突變組和對照組CMN的特點

2.2 組織病理學特點 本研究中一共46例復合痣(46/48, 95.8%)。 其中, 突變組僅有2例皮內痣(4.2%), 而對照組中有5例皮內痣(10.4%)。所有的CMN均具有先天性生長模式，而且隨著真皮深度的增加，痣細胞巢和痣細胞的尺寸逐漸減小。痣細胞向真皮深層網狀延伸，甚至皮下脂肪層。累及網狀真皮層時，痣細胞在膠原束之間排列成行、索條狀和片狀。累及皮下脂肪層時，痣細胞常常沿皮下脂肪纖維間隔延伸，有時可浸潤脂肪小葉(圖 1)。痣細胞也可以累及毛囊上皮、皮脂腺、汗腺管、血管壁和立毛肌等部位。本研究中偶見有絲分裂象，其中突變組發現3例，對照組中2例，另外，對照組2例表皮內痣細胞呈paget細胞樣改變。突變組與對照組在痣細胞累及深度、痣細胞巢個數、細胞巢大小等方面的差異均有統計學意義，其P值分別為0.017, 0.008 和0.015(表2)。

圖1 1a:先天性生長模式，累及附屬器上皮組織，包裹在血管周圍，分布在膠原束間;伴有BRAF(V600E)基因突變的CMN比1b累及更深層次的皮膚組織 (1a、1b：HE,×40) 圖2 Ki67染色局限于陽性細胞的細胞核，呈明顯的顆粒狀染色，不均勻(免疫組化，×100) 圖3 細胞核染色呈棕色表明Ki67陽性表達(免疫組化,×400) 圖4 BRAF c.1799T>A的突變 圖5 NRAS c.181C>A的突變 圖6 Ki-67和痣細胞巢個數之間的相關性 圖7 Ki-67和痣細胞巢個數之間的相關性

表2 突變組和對照組CMN的統計學特征

2.3 免疫組化特點 Ki67染色僅限于陽性細胞的細胞核，呈不均勻的顆粒狀染色，偶爾核仁區染色明顯。未見細胞質染色。真皮-表皮交界處染色更為常見(圖 2、3)。突變組平均Ki67個數為4.4，而對照組為3.2，差異有統計學意義(P=0.034)(表2)。

2.4 基因突變情況 本研究通過一代測序方法進行基因檢測。185例患者中，24例(13%)出現BRAF(V600E)基因突變，11號外顯子c.1799T>A突變，導致第600位纈氨酸變為谷氨酸(p.VF600E)(見圖4)；8例出現NRAS(Q61K)基因突變，2號外顯子c.181C>A突變,導致第61號氨基酸由谷氨酰胺變為賴氨酸(p. Q61K)(圖5)。

2.5 相關性分析 本研究發現，痣細胞巢的數量和Ki67之間、Ki67和痣細胞深度、痣細胞巢大小和痣細胞巢數量、痣細胞巢數量和痣細胞深度之間具有較強的相關性(線性回歸分析，Spearman相關系數分別為0.58、0.43、0.33和0.4;P值分別為0.015、0.002、0.02和0.005)(圖6、7)。

3 討論

目前關于基因突變對CMN的病理和增殖活性影響的文獻報道較少[5，9]。 這些報道是總體性研究，沒有區分色素痣是先天性的還是后天性的。據我們所知，本研究首次證實了BRAF V600E突變與先天性黑素細胞痣增殖活性和組織病理學之間的關系。

根據組織病理學特點，CMN可以分為交界痣、復合痣和皮內痣。組織學特征主要與痣的大小有關[1]。本研究中幾乎所有的痣都屬于復合痣(46/48, 95.8%)，組織病理學特征與CMN模式是一致的,如結構對稱、邊界清晰,痣細胞巢比較一致并均等的分布在表皮內，真皮內的痣細胞巢和痣細胞隨著深度的增加而逐漸成熟, 痣細胞包裹在血管和附屬器周圍或散在膠原束之間[10]。兩個匹配組的痣深度差異是顯著的。BRAF(V600E)突變組的痣細胞比非突變組延伸更深。這種現象可能是由于BRAF V600E基因突變后痣細胞增殖活性增強所致。我們可以初步得出痣浸潤深度不僅與痣大小有關，還與CMN中BRAF(V600E)基因突變有明顯相關性。 此外，本研究的結果擴大了對CMN基因型-表型相關性的認識。

Ki67單克隆抗體已廣泛應用于組織病理學，并在許多人類惡性腫瘤的分級中具有特殊價值，并與患者生存情況相關[11]。關于細胞增殖活性標記物Ki67在CMN中的表達的數據有限。Soyer在他的研究中納入了色素痣，并發現Ki67抗原表達在痣、原發性和轉移性惡性黑素瘤之間存在顯著差異[12]。CMN是一種良性皮膚腫瘤，增殖指數一般不太高，本研究中的最大值是11。BRAF(V600E)突變的CMN的增殖活性與對照組相比差異有顯著性。伴有BRAF(V600E)突變的CMN具有更高的增殖活性，一方面能夠促進CMN持續性增生擴大，另一方面，在受到其他刺激因素的作用下，如陽光照射、輻射和摩擦，更容易發展成惡性黑素瘤。

BRAF(V600E)基因突變不僅在色素痣中出現的頻率較高，也是黑素瘤發病機制中的重要驅動因素[7]。BRAF(V600E)可激活并維持色素痣中黑素細胞的增殖分化，同時還會誘導p16反應，出現細胞衰老現象(oncogene-induced Senescence，OIS)[6]，從而阻止黑素細胞的持續性增殖[13],機體通過這種生理性的動態平衡機制維持黑素細胞的良性增殖。但這種抑制是可逆的，當痣細胞出現p16INK4A 失活或者PI3K通路活化后，會逃脫這種抑制作用而轉化為惡性黑素瘤[14]。本研究中，所有BRAF(V600E)突變的CMN均是良性的，目前沒有惡變的臨床和病理學證據，說明這些CMN仍然處于良性的增殖狀態。隨著年齡的增長，在日曬、摩擦刺激等因素作用下，如果平衡狀態下的痣細胞出現p16INK4A 失活或者PI3K通路活化，可能惡性發展，最終形成黑素瘤。

本研究還發現，CMN的增殖活性與痣細胞巢的數量及痣細胞深度呈正相關，而與痣細胞巢的大小無關。因此，痣細胞巢的數量可能是痣細胞增殖活性的一個重要指標，可用于今后的研究中。本研究表明BRAF(V600E)基因突變可顯著增強兒童CMN的增殖活性，并影響其組織病理學特征。而另一方面，CMN的組織病理學特征可以反映其分子學背景的相關信息。對CMN基因型-表型相關性的進一步研究，將有助于臨床上對不同類型的CMN采取更加科學的管理和治療方法。