丙型肝炎流行病學臨床檢驗技術應用的研究進展

張 平

(甘肅省天水市麥積區疾病預防控制中心，甘肅 天水 741020)

丙型肝炎在全球范圍內均具有較高的發病率，丙型肝炎病毒(HCV)感染是其主要誘發因素，而HCV感染的傳播途徑復雜多樣，除了常見的血液傳播以外，HCV病毒還可能通過性接觸、母嬰物質交換，甚至一些綜合性途徑、隱性途徑傳播[1]。據世界衛生組織統計數據顯示，不同年齡段、種族的人群均對HCV易感，每年因此類感染而死亡的人數達到35萬例，其中僅有近25%的患者出現特異性癥狀[2]。考慮到HCV感染傳播途徑具有顯著的復雜性，且早期癥狀較隱匿，早期提升丙型肝炎大面積篩查能力、推進HCV檢驗技術研究、完善HCV防控機制、有效控制HCV感染是全面降低丙型肝炎發病率及提升人類健康水平的有效方式。

近年來，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、熒光定量PCR等多種檢驗技術已在臨床有所應用，采用各項技術分別從不同的角度對HCV、HCV-RNA的相關因子進行針對性檢測，借助不同類型的試劑來進行HCV篩查。分析以上檢驗技術并發掘各項技術的優勢有助于臨床靈活根據HCV傳播途徑來合理選擇篩查手段，進而實現全面防控HCV。

1 ELISA

ELISA是臨床較常用的抗-HCV檢測手段，其利用酶結合物與HCV抗原抗體復合物融合后產生的顯色反應分析HCV陰陽性。ELISA憑借簡單的操作步驟、低成本等在臨床抗-HCV檢驗中占有一定的地位，然而不同廠家的ELISA HCV基因重級抗原質量、抗原片段比例及診斷閾值的計算方法有所不同，加之ELISA檢測對變異抗原體的敏感度較低，可將其作為早期HCV感染篩查手段，避免其漏診[3]。何小宇對100份抗-HCV試劑分別采用ELISA及Ortho公司的抗-HCV試劑(CLIA 法)進行檢測發現，以上兩種方法雖在診斷效能上差異無統計學意義(P>0.05)，但ELISA弱陽性(1≤S/CO值<3.8)檢出率僅占20.75%，低于CLIA檢測的50.98%，對單行ELISA檢測者最好配合臨床癥狀、特異性血清學檢驗結果進行分析[4]。

2 間接ELISA

間接ELISA檢驗也是臨床應用度較高的一種檢測方法。孫麗的研究結果顯示[5]，100份抗-HCV標本依次經間接ELISA、雙抗原夾心ELISA法檢測的陽性檢出率分別為86.08%、97.47%，差異有統計學意義(P<0.05)。間接ELISA陽性檢出結果不理想或與抗-HCV ELISA試劑與血清中高免疫球蛋白G(IgG)的含量有關，抗-HCV ELISA試劑與血清中IgG結合形成少量非特異性吸附，可對HCV陽性檢測結果產生干擾，應盡量在檢測前稀釋樣本以避免血清中非特異性IgG所形成的固相吸附反應導致假陽性。

3 雙抗原夾心ELISA

雙抗原夾心ELISA檢驗技術能夠彌補間接ELISA在抗-HCV檢測特異性結果中的不足，雙抗原夾心ELISA檢測試劑可對受測者體內相關抗體給予2次特異性反應，對于減少間接ELISA檢驗單次特異性反應所致假陽性有積極意義。有學者就雙抗原夾心ELISA與間接ELISA在抗-HCV檢測中的效能進行對比后發現，雙抗原夾心ELISA檢測的診斷符合率、特異度分別為96.23%、98.73%，而間接ELISA檢測的診斷符合率及特異度僅有86.69%、84.81%，差異有統計學意義(P<0.05)[6]；該結果不僅與雙抗夾心ELISA檢測對抗-HCV基因產生的2次特異性反應有關，還可能跟雙抗夾心ELISA采取酶類標記抗原替代間接ELISA酶標標記二抗、對包含多種免疫球蛋白的總抗體檢測有關。在以上檢測技術的綜合作用下，檢測特異度得到顯著提高，檢測結果不會受非特異性免疫球蛋白反應的干擾。

4 化學發光微粒子免疫測定技術(CMIA)

CMIA檢驗技術的出現彌補了傳統的ELISA檢驗技術在檢驗反應周期、發光信號峰值達到時間上的不足，此項技術在各類抗體、酶、脂肪酸等檢測中有較高的靈敏度，其包被載體的磁性微粒面積較大。磁性微粒與項目稀釋液混合后，樣本中的HCV抗體可與微粒融合良好，對于加快反應樣本下沉、分離效率等有積極作用；有CMIA相關研究指出[7]，與ELISA血清學監測相比，CMIA在低風險人群HCV篩查中的靈敏度達到100.00%。CMIA檢測樣本中HCV抗體HCV包被微粒子在激發液的作用下能夠出現特異性反應，臨床上根據CMIA檢測中化學發光信號的呈現情況可獲得特異度較高的抗-HCV含量檢測結果，且CMIA不具有放射性，可保證受測者反復檢驗的安全性。薛海玲等就CMIA、ELISA在丙型肝炎病毒抗體(HCV-Ab)檢測中的應用效果進行對比后發現[8]，當S/CO值≥1.0且<5.0時，處于1.0≤S/CO<2.0范圍內的45例陽性標本經ELISA檢測均為陰性，CMIA與ELISA檢測結果符合率僅為58.33%，提示CMIA的靈敏度與ELISA檢測相比優勢較大，且CMIA全自動化操作、較短的反應時間、較少的干擾物作用等優勢均可對HCV的定量檢測產生積極影響；但CMIA仍可能受到外標本因素的影響，例如離心時間過短、合并溶血或黃疸等不良反應，或正處于HCV感染恢復期內、病原體含量過低等。CMIA作為HCV初篩手段較ELISA有更高的精準度，考慮到CMIA同樣可能受到外部因素的影響，后續臨床診斷過程中可適當配合高特異度血清學檢驗。

5 電化學發光免疫分析法(ECLIA)

常規的丙型肝炎抗體、核心抗體檢測篩查窗口期最長可達2個月，ECLIA高靈敏度的優勢能夠協助醫生迅速檢測到較微量的HCV抗體。有學者對ECLIA與ELISA在HCV檢測中的一致性進行分析后發現，兩種檢測方式在ECLIA S/CO值處于1.0～15.0范圍內、ELISAS/CO值處于1.0～4.0范圍內時，符合率整體偏低[9-10]。巫文勛等就化學發光免疫測定法(CLIA)、ELISA在丙型肝炎初期篩查中的應用價值進行對比后發現，CLIA檢測具有較高的靈敏度，經第三方試劑驗證不符的51例HBsAg標本，經CLIA法測值準確檢測出49例[11]。黃燕青的研究顯示，CLIA、ELISA在HCV抗體檢測中與金標準PCR的Kappa一致性依次為0.898、0.832，其中的CLIA診斷優勢較顯著，CLIA全自動化操作將免疫反應與發光信號反應相融合，加快了標本中抗原檢測的效率，同時彌補了ELISA在定量檢測上的不足，對提高篩查精準度有顯著作用[12]。

6 膠體金法快速試驗(GICA)

膠體金是一種較為理想的免疫標記物，其檢測HCV的原理為：與白磷、枸櫞酸鈉等還原劑相互作用后，其中所含的氯金酸能夠聚合為金顆粒，并在靜電環境下形成較穩定的膠體狀，膠體中的負電荷能夠與蛋白質分子中的正電荷基團進行良好融合，且經靜電作用結合不易破壞蛋白質生物特性。王安然對GICA法、ELISA對抗-HCV特異性抗體的檢驗效果進行研究后發現，膠體金法能夠提高檢驗效率[13]；膠體金高電子密度、體積小、顏色反應顯著等優勢為其廣泛應用于細胞生物學、免疫學奠定了基礎，臨床利用顯微鏡可在膠體金法檢測后觀察到金標蛋白結合處的黑色顆粒聚集，迅速完成定性免疫檢測。但是，GICA檢測仍可能受到病毒載量、某種抑制病毒核酸擴增等因素的影響，此方法雖能縮短ELISA的檢測時間，但采取GICA檢測期間聯合HCV-RNA檢測能夠弱化短時間檢測中反應不充分、過濾膜破損所致檢驗結果模糊等不良情況的影響，進而降低檢測精準度。GICA以膠體金為標志物，臨床可通過分析標記物產生的層析反應檢測抗原及抗體反應，借助直觀操作縮短檢測的耗時，這種低成本操作強化了這一檢測手段在基層醫院的臨床應用價值；此外，GICA檢測利用高電子密度特性吸引目標物質聚集，不會對受測者產生放射性同位素污染，對于擴寬GICA的應用范圍有積極作用[14-15]。

7 熒光定量 PCR

熒光定量 PCR是臨床低水平核酸定量檢測中特異度較高的一種檢測方式，能夠檢出丙型肝炎患者血清中低表達量的HCV-RNA，彌補傳統檢測方法難以明確現行、既往HCV感染的不足，同時降低生物污染率；此檢測方式主要利用反應中形成的系統熒光曲線明確循環數量，通過擴增特異性HCV基因片段來測定病毒中的核苷酸序列，臨床上可將其作為標準化HCV-RNA基因分型檢測結果[16]。有學者就ELISA、熒光定量PCR在HCV感染診斷中的價值進行對比后發現，熒光定量PCR、ELISA檢測陽性率分別為96.36%、89.09%，差異有統計學意義(P<0.05)[17]，提示熒光定量PCR在丙型肝炎診斷中的價值較顯著。HCV感染需要一定的抗體產生時間，而ELISA僅在定性分析上有一定效用；熒光定量PCR能夠利用自身定量分析的優勢明確受測者體內HCV-RNA含量，直觀地顯示受測者的HCV水平，同時能夠反映出治療期間抗病毒藥物殺滅HCV病原體的效果[18]。

8 結語

丙型肝炎早期癥狀的隱匿性決定了丙肝患者需要借助客觀、高特異性手段來明確診斷，ELISA、CMIA、ECLIA、GICA、熒光定量PCR等檢測手段分別在檢測耗時、操作方式、特異度等方面各具優缺點。后續工作中應繼續深入研究各種檢測手段的特性，建立更加完善的HCV流行病學檢測方案，推動HCV核酸定量、基因分析檢測技術的廣泛應用，靈活聯用以上檢測技術，在最佳窗口期內最大程度地減少誤診、漏診。