美拉德反應修飾的酪蛋白遞送生物活性物質的應用研究進展

張晶晶，李艾黎，程金菊

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來，隨著人們生活水平的提高和食品科學的發展，將食物中天然存在的生物活性物質添加到食品中開發功能性食品進而促進人們身心健康已成為食品領域的研究熱點。然而，生物活性物質在食品加工和貯藏過程中易受諸多環境因素（高溫、強酸強堿、離子強度光照以及氧氣等）的影響、其低水溶性或與食品體系中其他食品成分的不相容性以及在胃腸環境中的不穩定性等均可導致生物活性物質的破壞和降解，極大降低了其生物利用率，限制其在食品工業化生產中的應用[1]。為解決這一問題，科研人員利用一些遞送體系對其進行保護，以期提高其穩定性和生物利用率。這些遞送體系包括乳狀液、復合凝聚物和納米遞送載體等。

美拉德反應作為一種綠色的蛋白改性方法，其制備的蛋白質-多糖共價復合物具有較好的溶解性和較高的穩定性，這使得它們在食品和醫藥工業中作為生物活性物質的遞送載體具有很好的應用前景。酪蛋白是被廣泛使用、價格低廉、天然存在和一般認為安全的原料，具有很高的營養價值和良好的感官品質。同時，酪蛋白中有大量的脯氨酸，阻礙了酪蛋白折疊成團，使其結構呈開放式狀態，是改性研究的良好基材[2]。利用美拉德反應生成的酪蛋白-多糖共聚物的功能特性（如環境穩定性、乳化性、溶解性等）相比天然酪蛋白明顯改善，且其作為營養素的遞送載體在其包埋、增溶、靶向釋放等方面表現出良好的特性，因而逐漸受到研究者的重視[3]。

本文主要概述了酪蛋白的結構與性質、美拉德反應修飾酪蛋白的制備方法以及其在生物活性物質遞送體系中的應用，探究遞送體系在胃腸模擬消化系統中的靶向釋放，對美拉德反應修飾的酪蛋白在遞送生物活性物質方面的合理利用具有指導意義。

1 酪蛋白的結構與性質

1.1 酪蛋白的組成與結構

酪蛋白是指牛乳在20 ℃、pH值為4.6時沉淀的蛋白質，呈酸性，是一種含磷蛋白質，約占乳蛋白質量分數的80%。根據對游離態鈣離子的敏感程度，酪蛋白分為4 類，包括αs1-（38%（相對含量，下同））、αs2-（10%）、β-（34%）和κ-酪蛋白（15%），4種蛋白通過疏水和靜電相互作用共同構成酪蛋白。酪蛋白具有核殼模型，αs1-、αs2-、β-酪蛋白的多肽鏈被磷酸鈣的微簇結構部分連接，形成酪蛋白的“核”結構；“殼”結構是由κ-酪蛋白在一個外部較低密度片段區域上的“毛發層”結構所形成，提供靜電相互作用和空間位阻。這種“核殼”結構共同維持著酪蛋白的各種理化性能。

1.2 酪蛋白的基本性質

作為乳中的主要蛋白質，酪蛋白是由高含量的疏水性或親水性氨基酸殘基片段組成的嵌段共聚物，在乳中以膠束形式存在。酪蛋白膠束是天然的納米遞送系統，其內部包含大量的水（平均每克蛋白結合3～4 g水）[4]，這樣的多孔結構為其引入特定的非酪蛋白分子提供了可行性。因此，目前有研究采用酪蛋白膠束對生物活性物質進行包埋遞送[5-6]。

但天然酪蛋白作為營養素載體在應用過程中存在溶解度低、pH耐受范圍窄以及膠束再聚集等問題。此外，酪蛋白富含脯氨酸，其結構中的富脯氨酸多肽不利于α-螺旋和β-折疊的形成，并且無二硫鍵，因此，酪蛋白沒有太多規則的二級或三級結構，被稱為流變性的或者無定形態的結構，這種開放式的結構使得它們易被胃蛋白酶水解，引起被包埋活性物質在強酸性環境中被破壞或降解，而不能達到在小腸中靶向釋放的目的。如何通過對酪蛋白進行修飾，提高遞送體系的環境適應性及其在胃中的穩定性，增強活性物質的腸道吸收是研究的核心問題。通過美拉德反應對酪蛋白進行共價修飾，改善其功能性質并應用于生物活性物質的包埋遞送是目前的研究熱點之一。

2 美拉德反應修飾酪蛋白的制備方法

美拉德反應又稱羰氨反應，是涉及氨基酸、蛋白質或任何含氮化合物的氨基與還原糖的羰基、醛或酮之間的縮合反應。國內外對蛋白質和糖進行美拉德接枝反應的基礎方法主要有兩種：干熱法和濕熱法。近年來，也有研究者在傳統方法的基礎上結合輔助手段進行方法改進，如超聲波處理、微波處理、脈沖電場技術等，這些改進方法都已被成功地應用到美拉德反應產物的制備中。

2.1 傳統制備方法

2.1.1 干熱法

干熱法是最先使用的美拉德修飾蛋白質的方法，多用于蛋白質和多糖的接枝反應。1990年，Kato教授首次采用干熱法制備了卵清蛋白-葡聚糖接枝物，其乳化性在pH值為3和10時得到了極大改善，可作為大分子乳化劑應用于食品工業中[7]。隨后，用干熱法對蛋白質進行美拉德反應的修飾受到越來越多人的關注，并在醫藥[8]、材料[9]、化妝品[10]等領域得到了廣泛應用。

干熱法非常適合于蛋白質與多糖之間的美拉德反應，一方面是因為蛋白質在水溶液中受到多種分子間作用力及疏水相互作用的影響，許多反應基團被包埋在蛋白質的結構內部；另一方面，多糖立體效應較強，其化學反應具有較強的取向性[11]。此外，干法美拉德改性技術生產成本低、加工技術簡單且反應條件溫和，使得美拉德反應在食品修飾過程中更容易控制。然而，基于目前的報道，干熱法制備美拉德反應產物時間普遍較長，通常為幾天到幾周。例如Spotti等[12]通過干熱法制備乳清蛋白-葡聚糖美拉德產物時，反應時間為5 d；Wang Yongquan等[13]在80 ℃、相對濕度為79%的條件下反應9 d制備了脫酰胺小麥面筋蛋白-麥芽糊精接枝物。而酪蛋白不需要通過變性暴露其活性氨基基團，從而極大縮短了達到理想反應程度的時間。Corzo-Martínez等[14]在水分活度0.67、50 ℃條件下反應4 h制備了酪蛋白美拉德反應產物，且顯著增強了酪蛋白的發泡性，但酪蛋白本身溶解性較差，使其在工業上的應用受到了極大的限制，通過干熱法對酪蛋白進行美拉德反應修飾極大提高了其溶解性，其他功能性質也在一定程度上有所改善。

Fechner等[15]利用干法反應，在相對濕度79%、60 ℃條件下制備的酪蛋白酸鈉-麥芽糊精美拉德反應產物可以穩定水包油型乳狀液，使乳狀液的粒徑更小和更均一，且其在酸性條件下能夠降低VB12的釋放，是一種較穩定的乳化劑。Corzo-Martínez等[16]發現酪蛋白與半乳糖、乳糖和葡聚糖反應時，黏度隨反應時間的延長而增加，并且與半乳糖在50 ℃反應48 h時黏度達到最高。張雅婷[17]研究了酪蛋白和葡聚糖在相對濕度78%、60 ℃下制備的美拉德產物，葡聚糖提供的空間位阻效應使其在pH 2～7范圍內均可保持結構的相對穩定，并且明顯改善了酪蛋白等電點處的乳化活性。高威[18]在研究酪蛋白與葡萄糖和麥芽糖接枝物的凝膠性時發現，經美拉德修飾的酪蛋白凝膠強度是未修飾酪蛋白的1.43 倍。此外，酪蛋白經修飾后，其溶解性、乳化活性、乳化穩定性、持水性和黏度都有不同程度的提高[18]。

雖然干熱法制得的酪蛋白-多糖復合物的溶解性、乳化性、穩定性等均得到了一定程度的提高，但酪蛋白-多糖復合反應的速度極慢，且蛋白質與多糖的空間結構對共價反應的影響很大。另外，反應條件的控制也很嚴格且容易生成不溶性的大分子。因此，干熱法在實際應用過程中受到了極大的限制。

2.1.2 濕熱法

濕熱法一般用于蛋白質與單糖或雙糖的接枝反應，耗時較短，一般為幾到十幾個小時，當反應溫度≤90 ℃時反應速率緩慢，≥100 ℃時反應速率較快。Brands等[19]將酪蛋白和二糖（乳糖、乳果糖、麥芽糖或麥芽酮糖）在pH 6.8、120 ℃油浴下反應60 min，建立了酪蛋白-二糖美拉德反應的動力學模型，并使用多響應建模進行了廣泛的測試。王海霞[20]在反應溫度為100 ℃、pH值為9.0的條件下僅需3 h即制備了牦牛乳酪蛋白-葡萄糖接枝物，研究發現，美拉德修飾在一定程度上改善了牦牛乳酪蛋白的乳化活性和乳化穩定性、發泡性和泡沫穩定性、吸油性以及抗氧化活性。

雖然濕熱法較干熱法在反應速度上有所提高，但從目前的報道看，濕熱法主要集中在結構簡單的蛋白質和小分子糖之間的反應。近年來，Meng Jun等[21]分別通過干熱法和濕熱法制備酪蛋白-葡聚糖納米顆粒，研究其理化性質以及對姜黃素的封裝能力；原子力顯微鏡觀察發現，與濕熱法相比，干熱法制備的納米顆粒粒徑更小且分布更均勻，并且有更好的熱穩定性、胃腸道穩定性和貯藏穩定性。由此可見，濕熱法制備的酪蛋白美拉德反應產物也存在一定的缺陷性和局限性。因此，國內外學者致力于通過新興加工技術彌補傳統方法中的不足，以期尋找有效促進酪蛋白-糖美拉德反應的方法。

2.2 新興加工技術

2.2.1 超聲波技術

超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波，分為低強度超聲波（0.1～1 MHz、≤1 W/cm2）和高強度超聲波（≤0.1 MHz、10～1 000 W/cm2）兩類。其中高強度超聲技術在食品工業中研究廣泛，其特有的空穴作用可以引起機械、物理、化學和生化作用，從而改變食品的理化性質。目前，國內外關于超聲波技術的應用主要集中在超聲降解、蛋白改性、催化反應以及化學聚合等方面，而在蛋白質-多糖的美拉德反應修飾中的應用報道卻較為少見。科學家們研究發現，超聲波在媒介中傳播時，會產生交替循環的波型運動（壓縮波和稀疏波），在循環過程中，由于壓力變化會形成空穴氣泡且氣泡會隨著循環過程不斷變大，達到臨界大小，最終劇烈崩潰。而氣泡破裂時會釋放巨大能量到周圍環境中，這為誘發美拉德反應提供了條件[22]。

近年來研究發現，超聲對蛋白質糖基化程度的改善效果顯著，與傳統的加熱相比，超聲輔助美拉德反應可提高接枝反應效率以及接枝產物的溶解性、乳化性和表面疏水性[23]。由于活性氨基酸位點通常隱藏在蛋白質內部，從而導致蛋白質-多糖之間的共價作用較弱。而高強度超聲波產生的能量可以加速蛋白質結構展開和肽鍵斷裂，并使一些疏水性基團暴露在蛋白質表面，從而增加了蛋白質和多糖之間反應基團的碰撞，提高接枝度[24]。夏琪娜[25]在研究超聲預處理結合美拉德反應對酪蛋白反應進程的影響中發現，超聲預處理后的酪蛋白-葡萄糖接枝物的接枝度、中間產物含量、褐變程度以及抗氧化性均顯著高于未超聲處理組。此外，超聲組酪蛋白的紫外吸收程度加強，說明其分子內部的疏水性基團逐漸暴露，內源熒光光譜表明蛋白分子結構變得松散，圓二色光譜表明超聲組酪蛋白的二級結構變得無序，蛋白分子趨于舒展。葛偉[26]研究發現，與未經超聲處理的酪蛋白-葡萄糖接枝物相比，超聲預處理接枝物的抗氧化性、乳化活性和乳化穩定性、凝膠強度和持水性、起泡性和泡沫穩定性均在一定程度上有所改善。

超聲波技術作為一種快速、無毒且節能的新興技術，能有效改善酪蛋白美拉德產物的功能性質。而對于超聲技術促進美拉德反應機理的闡述卻較為籠統，因此，構建反應動力學模型，結合產物結構及功能性質表征，探究超聲加速美拉德反應的反應機理還有待深入研究，從而實現美拉德反應修飾酪蛋白的定向調控。另外，過高的超聲功率可能會產生丙烯酰胺和5-羥甲基糠醛等有害成分，因此，超聲波技術帶來的負面影響也需要正確評估。

2.2.2 微波技術

微波是一種波長為1 mm～1 m、頻率為0.3～300 GHz的電磁波。微波技術因其高節能等優勢已廣泛應用于食品加工領域，包括輔助提取、加熱、干燥、巴氏殺菌和食品保鮮等[27]。

近年來，國內外研究學者研究了微波場中的美拉德反應。研究發現，微波加熱可導致蛋白質中的二硫鍵斷裂、疏水性基團暴露，有利于蛋白質結構的展開。此外，微波處理還可以通過解開碳鏈間的纏結促進多糖分子的重排及其相互作用[28]。微波引起的這些變化有利于美拉德反應在溫和的條件下高效進行。研究表明，影響蛋白-多糖共價反應及產物性能的微波條件主要是微波功率和反應時間。Ge Huacai等[29]研究了微波功率對丙烯酸接枝殼聚糖反應的影響，結果表明，丙烯酸-殼聚糖的接枝度和接枝效率均隨著微波功率的增大而顯著升高，且使接枝產物達到相同的吸水性，傳統干熱法需240 min，而微波輻射（120 W）僅需30 min，反應速率提高了8 倍。另外，微波加熱能顯著改善酪蛋白的功能性質。畢偉偉[30]研究結果表明微波加熱可以穩定地促進美拉德反應的進行，與水浴加熱相比，微波加熱的酪蛋白二硫鍵含量變化顯著、熒光強度增加，β-轉角含量上升。此外，微波加熱可顯著提高酪蛋白-β-環糊精的凝膠性、持水性、表觀黏度、起泡性和泡沫穩定性以及自由基清除率。另一項研究發現，微波場內酪蛋白-乳糖體系的流變性發生了改變，酪蛋白在等電點處的溶解度有所改善，且其在消化過程中抗氧化活性顯著提高[31]。

然而，微波加熱的不均勻性是微波技術的短板，可能會影響食品質量，因此，應繼續對該領域深入研究，以期避免微波產生的冷點和熱點。

2.2.3 脈沖電場技術

脈沖電場技術是一種新興的非熱食品加工技術，其優勢在于效率高、能耗小、副產物少，對環境友好且能夠充分保護物料的風味特征等[32]。國內外研究學者發現，脈沖電場技術在增強蛋白質和多糖之間的相互作用中發揮著重要作用[33]。有研究者認為，蛋白質-多糖混合溶液經脈沖電場技術處理后能夠降低化學反應的活化能[34]，電化學反應產生的自由基會使蛋白質二級結構部分展開，疏水性基團和自由巰基暴露[35]。同時，脈沖電場提供的電能可使多糖鏈分解[36]。這些變化有利于增加反應分子之間的碰撞概率，促進蛋白質和多糖之間的共價結合。研究發現，利用脈沖電場技術（總處理時間7.35 ms、電場強度范圍10～30 kV）可成功制備牛血清白蛋白-葡聚糖美拉德產物，且其功能特性如溶解性、乳化活性、抗氧化性以及乳液穩定性都得到了顯著改善[37]。

然而，國內外關于脈沖電場技術輔助美拉德反應修飾酪蛋白的相關文獻還鮮有報道，但基于相關理論，此種方法對酪蛋白的美拉德反應修飾是非常可行的。此外，脈沖電場技術還不能大規模地應用于美拉德反應產物的制備中，且脈沖電場技術處理的臨界強度和熱效應之間的關系還沒有得到充分的研究論證，還需進一步的研究。

2.2.4 靜電紡絲技術

靜電紡絲是一種利用靜電作用力將聚合物溶液或者熔體轉變為微納米纖維的技術。在靜電紡絲過程中，蛋白質-多糖混合射流通過電場時，電荷在其表面積聚。這些不均勻分布的電荷會引起射流的無定向噴射，導致蛋白質和多糖分子之間的重新排列和更為緊密的接觸。溶劑經加熱后蒸發，蛋白質和多糖緊密包裹成具有高比表面積和多孔性的干纖維[38]。這些特性有助于蛋白質和多糖在較為溫和的反應條件下進行美拉德反應，從而避免不期望的褐變發生。

靜電紡絲技術已成功應用于蛋白質和多糖的美拉德反應產物的制備方法中[39]，Kutzli等[40]采用靜電紡絲技術結合加熱處理制備乳清分離蛋白-麥芽糊精接枝物，并獲得了最高產率（（44.52±7.46）%）。此外，靜電紡絲輔助美拉德反應制備的接枝物在其功能特性上也得到了極大地改善。Kutzli等[41]通過靜電紡絲法制備豌豆分離蛋白-麥芽糊精纖維，并在加熱時間12 h/24 h、加熱溫度65 ℃/70 ℃、相對濕度75%的條件下進行美拉德反應，研究結果表明，較高的溫度和較長的反應時間會促進美拉德反應；并且與未加熱的纖維相比，美拉德反應產物具有更高的蛋白溶解度。這種方法改善了蛋白的功能特性。因此將靜電紡絲技術與傳統干熱法相結合，可使美拉德反應產物的商業化制備成為可能。然而，國內外關于靜電紡絲技術輔助美拉德反應修飾酪蛋白的相關文獻還鮮有報道，因此其對酪蛋白的功能性質及結構表征還有待深入研究。

2.2.5 高靜水壓技術

高靜水壓處理技術作為一種新型的非熱食品加工技術，普遍應用于果蔬、乳制品及肉制品加工中，且主要用于食品的殺菌[42]、保藏[43]以及生物活性成分的提取[44]等。但國內鮮有研究報道高靜水壓在蛋白-多糖共價結合方面的應用，國外的一些學者卻已逐步將高靜水壓技術運用到蛋白-多糖的美拉德反應中，以提高其反應速率以及蛋白質的功能特性。

Ma Xiaojuan等[45]在研究不同氨基酸-糖模型體系中高靜水壓技術對美拉德反應的影響時發現，在賴氨酸-糖模型體系中，Amadori化合物的降解速率降低，而在精氨酸-糖模型體系中，其降解速率增加；此外，研究還表明除了高靜水壓對美拉德反應造成的影響外，高溫也能加速美拉德反應的發生。Tian Yuting等[46]研究了高靜水壓處理對紅曲米酒在陶器貯存期間揮發性成分的變化和感官品質的影響時發現，高靜水壓處理可顯著降低酒中雜醇類的含量并保持內酯的濃度，貯存18個月后，經高靜水壓處理的酒總糖分下降更快，游離氨基酸含量更低，酮含量更高，這些變化可歸因于高靜水壓處理加快了體系中美拉德反應和氧化反應的反生。Santos等[47]在一項類似的研究中同樣得出了高靜水壓處理可加速釀酒體系中美拉德反應的發生。

目前，關于高靜水壓法對蛋白-多糖共價復合反應的影響的研究還略顯不足，關于高靜水壓的工藝條件、壓力對不同種類的蛋白與多糖共價反應的影響，以及壓力對共價復合產物性質的影響等還需要做進一步深入的研究。

3 美拉德反應修飾酪蛋白作為遞送載體的類型

作為一種綠色安全的蛋白改性方法，美拉德反應不僅能改善蛋白質的功能特性，還賦予了食品誘人的色澤和濃郁的芳香。因此，研究人員將蛋白質與糖的美拉德反應產物作為食品級遞送系統的新型載體來封裝、保護和控制生物活性物質的釋放，以期提高其生物利用率。下文介紹了基于美拉德反應修飾的酪蛋白作為遞送載體的不同類型，包括乳狀液、復合凝聚物以及納米遞送載體。

3.1 乳狀液

乳狀液是一種以水包油或油包水形式穩定分散相的功能因子傳遞體系，可將疏水性生物活性物質及其他功能因子包裹在乳狀液油滴中，從而提高其在水溶液中的穩定性和溶解度[48]。以蛋白質為載體制備的乳狀液體系易受到pH值、離子強度、溫度以及消化酶等因素的影響而發生聚集以及相分離，此外，乳狀液是熱力學不穩定系統，往往會由于乳析、絮凝和聚合等不穩定現象導致破乳，不能完全滿足有效載體體系的要求[49]。所以必須用其他方法改善乳狀液的性能。乳狀液的穩定性與乳化劑有關，乳化劑可以吸附在油滴表面形成界面層[50]。酪蛋白作為一種大分子乳化劑，通過美拉德反應將蛋白質和多糖共價連接在一起形成新的乳化劑，其界面膜及其所帶的靜電荷間排斥作用和空間位阻共同使得熱力學不穩定的兩相混合體系具有長期穩定性[51]，以此可解決上述問題。

越來越多的研究已經證實，通過美拉德反應制備的酪蛋白-多糖共聚物作為乳化劑可明顯改善乳狀液的物理化學穩定性[52]。Wang Lixin等[53]在干熱條件下制備了由酪蛋白-羧甲基殼聚糖共聚物穩定的水包油乳狀液，研究發現，與單一酪蛋白穩定的乳狀液相比，共聚物穩定的乳狀液具有更高的凍融穩定性、pH穩定性、熱穩定性以及貯藏穩定性。O’regan等[54]研究了VB12在由酪蛋白酸鈉-麥芽糊精接枝物穩定的雙重乳液中的穩定性和釋放特性，與純蛋白質穩定的乳液相比，美拉德改性復合物由于可以在油滴周圍形成致密的保護膜，減少水相和油滴的接觸，防止油滴聚結而具有更小的乳液粒徑和更穩定的空間結構。此外，該遞送體系在生物活性物質的生物利用度和控釋方面均有所提升，使其成為有前景的生物活性物質遞送載體[55]。Gumus等[56]將葉黃素包埋于由酪蛋白和葡萄糖經美拉德反應穩定的乳狀液中，美拉德反應產物穩定乳液與單純的酪蛋白穩定的乳狀液相比具有更高的pH穩定性，這可歸因于葡聚糖產生的空間位阻和靜電排斥作用防止油滴聚集；體外胃腸模擬實驗表明，美拉德改性酪蛋白乳液能有效抵抗胃蛋白酶的消化。

由此可見，以美拉德酪蛋白-多糖共聚物作為乳化劑形成的乳狀液具有更高的物理化學穩定性，在制備功能性飲料方面具有良好的應用前景。此外，當酪蛋白與多糖通過美拉德反應形成共價復合物時，多糖阻礙了胃蛋白酶對酪蛋白的水解，從而使其在胃中具有較高的穩定性[57]，這使得此種遞送載體可用于設計腸道特異性藥物的傳遞，從而預防或治療腸道疾病。

3.2 復合凝聚物

復合凝聚法是一種新興的包埋技術，是指帶相反電荷聚電解質間發生去溶劑化而導致相分離，最后形成了兩相體系，即富含去電解質的凝聚相和與之平衡的稀釋相[58]。復凝聚反應形成的可溶性復合物或者復聚物作為活性物質的遞送載體已成功應用于β-胡蘿卜素[59]、功能性油脂[60]以及益生菌[61]等的包埋，并顯示出了高包封率和控釋能力[62]，而廣泛應用于食品與醫藥領域[63]。

值得注意的是，蛋白質-多糖復合凝聚物主要依靠靜電相互作用、氫鍵、疏水鍵和空間位阻等非共價鍵相互作用形成[64]，這些作用力又容易受到離子強度、溫度、電荷密度、pH值以及體系濃度等條件的影響，導致復凝物出現聚集現象，從而影響體系穩定性[65]。目前常用交聯劑的交聯作用通過表面修飾降低顆粒的表面能，從而減少顆粒的聚集[66]。但是化學交聯劑（如戊二醛）存在一定的安全性問題，而酶類（如轉谷氨酰胺酶）對pH值、底物和溫度有嚴格的要求，都不適合食品工業化的生產[67]。近年來，由蛋白質和糖通過美拉德反應產生的共價接枝復合物通過增加空間排斥作用穩定復合凝聚體，進而用于包封活性物質，獲得了越來越多的關注[68]。Ifeduba等[69]將硬脂酸大豆油包埋于經美拉德改性的明膠-阿拉伯膠復合凝聚體中，研究發現，與未改性體系相比，美拉德改性的微膠囊表現出更高的膠體穩定性和抗氧化能力。研究者還將其應用于酸奶中，在80 ℃下加熱30 min時，美拉德改性的微膠囊表現出了更高的熱穩定性，且其在冷藏14 d內也表現出了更高的氧化穩定性[69]。美拉德改性的微膠囊體系氧化穩定性的提高可能是由于美拉德反應產物可以通過螯合金屬離子、自由基鏈和過氧化氫的分解、活性氧的清除，顯示出優異的抗氧化能力。Zhou Huihui等[70]制備了由明膠-葡聚糖美拉德接枝物穩定的復合凝聚體包埋茶多酚，平均粒徑為86 nm，體外胃腸模擬實驗表現出了其對茶多酚的高負載率和緩釋作用。此外，茶多酚對人乳腺癌細胞MCF-7具有抗腫瘤活性，噻唑藍實驗結果表明，游離茶多酚與復合凝聚體包埋的茶多酚相比，細胞活性無顯著差異，這為開發茶多酚的遞送體系治療乳腺癌提供了科學的指導方法[70]。

由此可見，基于美拉德反應的蛋白質-多糖復合凝聚物可成功應用于生物活性物質的遞送載體中，并能顯著提高遞送體系的穩定性，在包埋益生菌和功能性油脂方面顯現出了極大優勢，可作為功能性食品的開發應用于食品工業中。此外，還可作為藥物遞送載體應用于醫藥領域。然而，美拉德反應修飾的酪蛋白基復合凝聚物的功能性質、結構表征以及在生物活性物質的遞送方面的報道較少，還有待進一步深入研究。

3.3 納米遞送載體

納米遞送載體是指利用機械或化學方法制備的平均粒徑為10～1 000 nm的遞送體系，有研究表明，運用納米尺度的載體遞送生物活性物質，不僅可以在食品加工、貯藏過程中提高生物活性物質在氧氣、pH值、酶解等極端條件下的穩定性，還可以更有效地調控被包埋的生物活性物質的溶解性、穩定性、釋放速率以及在消化道中的滯留情況[71]，以及影響載體的消化特性，如胃蛋白酶對蛋白質的水解和脂肪酶對脂質的水解等。因此，納米載體遞送是生物活性物質理想的生物效價增效途徑[72]。而遞送載體對生物活性物質的遞送特性以及對其生物效價的增效作用是與載體的尺寸大小密切相關的，當載體的粒徑小于500 nm，尤其是小于100 nm時，可顯著地提高被遞送生物活性物質的生物效價，而且當載體粒徑為10～100 nm時，納米載體可通過上皮細胞滲透、腸細胞和M細胞轉運等方式直接進入血液循環中，從而更有效地提高活性物質的生物效價[73]。

酪蛋白作為一種天然生物大分子，綠色、安全、生物相容性好等特征賦予其得天獨厚的優勢，使其作為營養素納米載體的研究日益受到關注。Wei Xuelin等[74]成功制備了負載酚類物質咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）的酪蛋白納米靶向給藥系統，其粒徑分布均勻（（211.0±5.1）nm），并在室溫下貯存4 周后保持穩定；通過傅里葉變化紅外光譜和圓二色光譜分析證實了CAPE通過疏水作用與酪蛋白結合。天然酪蛋白在等電點附近pH值條件下溶解性和乳化性較差，且易受胃蛋白酶消化，目前美拉德反應是蛋白改性中最為理想的方法之一。

一些具有生物活性的抗氧化組分包括類胡蘿卜素、多酚、黃酮類等可預防心血管疾病、抗炎、抗癌和清除自由基等多種生物學功能，但其極易氧化，研究表明，可通過酪蛋白基納米遞送載體包埋從而提高其抗氧化性及生物利用率[75]。Sun Xianbao等[76]通過美拉德反應制備酪蛋白-麥芽糊精接枝物，并成功包埋原花青素（procyanidins，PAs），得到了酪蛋白-麥芽糊精PAs納米顆粒（casein-maltodextrin-PAs nanoparticles，CMPN），其粒徑和包封率分別為（158.69±1.70）nm和（93.48±0.20）%。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)陽離子自由基清除實驗表明，CMPNs的體外抗氧化活性在28 d貯藏期和不同溫度條件下（40、60 ℃和80 ℃）均保持良好的穩定性。細胞內超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力的分析也證實了CMPNs抗氧化保護作用的存在。在體外釋放實驗中，與游離PAs的快速釋放（釋放率80%）相比，包埋后的PAs1在20 min后的釋放率僅為30%，表明經納米載體包埋的PAs在很大程度上防止了胃蛋白酶的降解，這可能是由于糖基化蛋白質較大的空間位阻覆蓋了蛋白質上的酶水解位點，提高了其穩定性和生物利用率[76]。Xue Jin等[77]將表沒食子兒茶素沒食子酸脂（epigallocatechin gallate，EGCG）包埋于美拉德反應修飾的酪蛋白中，發現修飾后的酪蛋白對EGCG有較強的包封和保留能力，能有效保護EGCG在堿性pH值下的降解，并在腸液中表現出緩慢而持續的釋放。

以上研究結果表明，經美拉德反應修飾的酪蛋白作為納米遞送載體是生物活性物質理想的生物效價增效途徑。

4 美拉德反應修飾酪蛋白運載體系在消化系統中的靶向釋放

有研究已證實，遞送載體包埋生物活性物質能有效提高其穩定性，保護被包埋物質免受光照、溫度、pH值、離子強度等環境因素的影響而降解[78]。但由于生物活性物質的口服生物利用度低，而使其潛在的促進健康作用并未完全實現，因此，如何提高各種生物活性物質的生物利用度，充分發揮其生理功能已成為研究熱點。目前已經有研究人員設計了一些遞送體系提高生物利用率，主要通過保護被包埋物質不被胃蛋白酶水解，并在腸道pH條件下實現控制釋放以及實現靶向釋放，從而改善生物活性物質的口服吸收效果[79]。

4.1 胃

食物在經過口腔的初步消化后，通過食管到達胃，并與胃液混合。鹽酸、胃蛋白酶原和電解質等是胃液的主要成分。以蛋白質為乳化劑的乳狀液在胃消化過程中通常會由于pH值變化導致電荷損失、離子強度增強發生靜電屏蔽以及胃蛋白酶的水解作用，導致遞送體系發生顯著變化[80]。美拉德改性復合物相比單一蛋白質穩定的乳狀液相比，其在胃消化過程中通常具有更高的穩定性。Davidov-Pardo等[81]將白藜蘆醇包埋于酪蛋白酸鈉-葡聚糖美拉德復合物納米顆粒中，在模擬胃液條件下，不含復合物的納米顆粒懸浮液的粒徑顯著增加（＞1 000 nm），而改性復合物納米顆粒懸浮液的粒徑增加較小（約為530 nm），這可能是由于葡聚糖產生了較大的空間位阻以及美拉德修飾導致蛋白質上的酶水解位點減少，有效阻止了顆粒的絮凝和聚結，從而提高了美拉德改性復合物穩定的納米顆粒在胃消化過程中的穩定性。

Qiu Jiahuan等[82]通過干法美拉德反應制備酪蛋白-卡拉膠納米膠囊包埋辣椒紅色素（paprika oleoresin，PRP），在胃液中孵育3 h后，未經美拉德反應的物理混合物的平均粒徑和聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）值由513.4 nm和0.236增大到1 025.6 nm和1.000，而改性復合物的平均粒徑和PDI值分別由306.8 nm和0.153增加至575.9 nm和0.460，且其在孵育0.5 h后的釋放速率分別為56.2%和13.6%，由此可見，改性復合物納米膠囊在模擬胃液中具有相對較好的穩定性，并且PRP仍能與美拉德修飾產物有效結合，維持分散狀態，從而有利于其進入腸道完成釋放與消化。這可歸因于蛋白酶水解蛋白或多肽時，其傾向于剪切疏水氨基酸之間的肽鍵，即κ-酪蛋白肽鍵斷裂，這破壞了物理混合物中酪蛋白結構，酪蛋白之間聚集沉淀，導致物理混合物中PRP的快速釋放并且累計釋放率較大。而酪蛋白共聚物納米粒將疏水氨基酸保護在內核區域，使表面形成了具有保護作用的界面層，防止了胃蛋白酶和低pH值對其剪切和破壞，另外，PRP被包埋在疏水內核中，其空間位阻和范德華力也是阻止胃蛋白酶對PRP作用的重要因素，使得PRP不完全釋放，從而保持結構相對穩定[82]。

4.2 小腸

經胃消化后的食糜進入小腸后與腸液混合，小腸液呈弱堿性，pH值約為8～9，主要包括胰液和膽汁。小腸是食物營養物質吸收的主要場所。

在Qiu Jiahuan等[82]的研究中，模擬小腸消化后，酪蛋白-卡拉膠美拉德反應改性復合物納米膠囊包埋PRP的釋放量和釋放速率均略高于混合物，這說明共聚物的形成及包埋并未對在腸液中PRP的釋放產生影響。Larissa等[83]分別制備了酪蛋白酸鈉-麥芽糊精和酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德改性復合物包埋白藜蘆醇，在模擬腸液條件下，白藜蘆醇的釋放量在3 h內達到了90%。胰蛋白酶首先作用于共聚物表面的κ-酪蛋白，將其位于116～117位的賴氨酸殘基的羧基端肽鍵切斷后形成不同分子質量的多肽，導致共聚物結構被破壞，最后共聚物被完全水解，核內生物活性物質得到釋放。由此可見，共聚物表面所接枝的多糖形成的界面層對胰復合酶基本無阻礙作用。

美拉德反應修飾酪蛋白改性復合物作為生物活性物質的遞送體系，能在消化過程中防止或減少生物活性成分的降解，并將其充分轉運和溶解到混合膠束中以供小腸吸收。由此，其可作為理想的生物活性載體，有效提高生物活性物質的生物利用度。

5 結 語

本文綜述美拉德反應修飾酪蛋白的制備方法，在傳統方法的基礎上加以新興技術（超聲波、微波、脈沖電場、靜電紡絲以及高靜水壓技術）的輔助，能夠實現制備效率的提高和功能性質的改善；美拉德反應制備的酪蛋白-多糖共價復合物作為生物活性物質的遞送載體類型，包括乳狀液、復合凝聚物及納米遞送載體；探究遞送體系在胃腸模擬環境中的變化。大量研究表明，美拉德反應修飾酪蛋白作為生物活性物質的遞送載體顯著提高了其環境穩定性和生物利用率，使其能廣泛應用于食品工業化的生產中。然而，對于美拉德反應產物功能特性的驗證、控制反應過程中有害物質和晚期產物的生成以及選擇較為合適的美拉德產物設計不同生物活性物質的遞送載體還需進一步研究。