改造細菌基因組的雙重選擇系統的構建

李文靜, 楊桂霞, 周賢軒, 陳婷婷, 石春紅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

基因敲除技術目前已廣泛應用于動植物、微生物,利用Red同源重組系統可以達到基因敲除、引入、替換等遺傳學修飾的目的[1]。Red同源重組系統指λ噬菌體基因組中包含一個Red重組編碼區段,可啟動外源性DNA和細菌染色體的同源重組[2]。導入細菌的DNA片段與染色體的相應序列發生同源重組,將目的基因置換下來,以達到基因敲除的目的。

反選擇標記基因與正選擇標記基因相反,含有反選擇標記基因的細菌在特定的篩選條件下不能存活,反之則可以存活,從而在不引入抗性基因的情況下達到篩選目的。利用Red同源重組技術,結合正反向選擇標記基因的雙重選擇作用,可以實現細菌基因組中基因的敲除與回補[3-5]。

本文構建的tetA-sacB是一種具有獨特優勢的兩步反選擇系統。位于細胞質膜中的tetA基因產物可以阻止四環素在細胞中積累,從而產生四環素抗性，還會使細胞對鐮刀菌酸等親脂性螯合劑敏感[6]，因此tetA基因產物對細胞生長具有正反2個方面的選擇效應[7]。sacB基因是編碼果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢桿菌基因,可以將蔗糖轉化為果聚糖,果聚糖在周質中積累,會對大腸桿菌的生長起抑制作用[8-9]。tetA-sacB雙重選擇系統的優勢如圖1所示。通過基因工程技術將這2個基因構建到一個自殺質粒中,該質粒含有tetA-sacB雙基因盒,在細菌基因的敲除與回補過程中可以利用正反選擇作用進行篩選。

圖1 不同基因敲除方法的比較

由圖1a可知,帶有抗性基因的DNA片段在同源序列H1和H2的引導下,可以用來進行基因敲除,但無法實現后續基因回補的篩選。由圖1b可知,含有tetA-sacB的雙基因盒中每個基因產物都發揮獨立的作用,可以用于基因敲除的篩選;而且,含有鐮刀菌酸和蔗糖的培養基對攜帶tetA和sacB基因的細菌細胞的生長具有強烈的抑制作用,可以通過這種抑制作用進行反向篩選,該雙重選擇系統嚴謹性強。

本文使用遺傳背景清楚且易于進行遺傳學操作的大腸桿菌MG1655,通過Red同源重組系統結合tetA-sacB雙重選擇系統,實現細菌基因組基因的敲除與回補,證明了該雙重選擇系統的可行性與選擇的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒和菌株

質粒pDNR-LIB、pAH162、pKD46,由本實驗室保存;大腸桿菌菌株BW25142和大腸桿菌MG1655均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR購于Takara公司;Taq DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司;SanPrep 柱式質粒 DNA 小量抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司;凝膠及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)回收試劑盒購于上海普洛麥格生物產品有限公司;限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ購于NEB有限公司;其他試劑均為分析純;引物設計采用Vector NTI軟件,由通用生物(安徽)股份有限公司合成。本實驗所用引物見表1所列。

表1 本實驗所用引物

表1中帶有下劃線的表示酶切位點或同源臂序列。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒pAH162-sacB的構建

以質粒pDNR-LIB為模板,使用引物P0493、P0494擴增sacB及其啟動子,以限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ分別雙酶切sacB片段和質粒pAH162。將sacB及其啟動子連接到pAH162的BamHⅠ和EcoRⅠ位點之間,轉化至大腸桿菌BW25142化學感受態。挑取單克隆進行菌落PCR驗證,驗證引物為P0493和P0028。從保存的陽性菌株中提取質粒并進行測序,構建含有tetA-sacB雙基因盒的質粒pAH162-sacB。

1.2.2 大腸桿菌MG1655中lacZ基因的敲除

利用λRed同源重組系統進行基因敲除。從構建的質粒pAH162-sacB中擴增帶有lacZ基因上下游同源臂的tetA-sacB片段,擴增引物為P0554、P0555。將tetA-sacB片段通過電擊轉化至攜帶溫敏性輔助質粒pKD46的大腸桿菌MG1655電感細胞中,該步為正向選擇,通過四環素抗性篩選陽性克隆。使用引物P0565、P0566、P0567、P0568進行菌落PCR驗證,保存篩選到的陽性菌種MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB。

1.2.3lacZ基因回補

以大腸桿菌MG1655為模板,使用引物P0565、P0568擴增帶有同源臂的lacZ基因。將lacZ基因電擊轉化至MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB電感細胞中,通過同源重組替換MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB中的tetA-sacB片段。在含有鐮刀菌酸和蔗糖的反選培養基上篩選陽性克隆,進行菌落PCR驗證。

1.2.4tetA-sacB雙重選擇系統

tetA-sacB雙重選擇系統使用反選擇培養基。100 mL的tetA/sacB反選擇固體培養基含有1.5 g瓊脂,0.4 g胰蛋白胨,0.4 g酵母提取物,0.8 g氯化鈉,0.7 g磷酸二氫鉀,11.0 mg氯化鋅,2.4 mg鐮刀菌酸,6.0 g蔗糖。lacZ基因通過電擊轉化至MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB電擊感受態中。加入LB復蘇后的菌液轉接至50 mL上述液體反選培養基中,42 ℃過夜振蕩培養[10]。蘸取過夜培養的菌液劃線于反選固體培養基,42 ℃培養箱培養1～2 d。挑取單克隆進行PCR驗證,利用tetA對鐮刀菌酸的敏感性和sacB對蔗糖敏感性的反向選擇作用篩選陽性克隆。

1.2.5β-半乳糖苷酶活性分析

將野生型菌株MG1655、敲除菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB以及回補菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB(Comp)進行β-半乳糖苷酶活性分析[11]。3種菌株于37 ℃過夜培養,按體積分數1%接入3 mL新鮮LB培養基中培養至對數期。取相應菌液量接入新鮮培養基至總體積為3 mL,37 ℃振蕩培養約6 h。取一部分菌液測OD600,一部分菌液做β-半乳糖苷酶活性分析，每種菌株設置3個平行,取300 μL菌液于12 000 r/min離心2 min,棄上清。加入500 μL Z-buffer工作液,30 μL 0.1% 十二烷基硫酸鈉(SDS),50 μL氯仿,混勻后于30 ℃水浴5 min。加100 μL 2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),開始計時,當溶液開始變黃色,加入250 μL 1 mol/L Na2CO3,停止計時。12 000 r/min離心10 min,測上清液的OD420,利用公式(1 000×OD420)/(反應時間×菌液體積×OD600),計算β-半乳糖苷酶活性。

2 結果與分析

2.1 質粒pAH162-sacB構建分析

若將反選擇標記基因sacB構建到pAH162中,則重組質粒pAH162-sacB含有tetA-sacB雙基因盒,該雙基因盒可以在細菌基因組的基因敲除與回補實驗過程中起雙重選擇作用。構建質粒pAH162-sacB結果如圖2所示。

由圖2a可知,質粒pAH162含有tetA基因,質粒pDNR-LIB含有sacB基因,以pDNR-LIB為模板擴增sacB及其啟動子片段,通過酶切連接的方法將sacB及其啟動子構建到pAH162的BamHⅠ和EcoRⅠ位點之間。

圖2b中：M為DNA Marker；泳道1為不加模板的空白對照；泳道2為擴增的sacB基因及其啟動子,條帶大小為2 071 bp。由圖2b可知，將酶切連接的重組質粒轉化至大腸桿菌BW25142,對轉化板上的單克隆進行PCR檢驗，結果如圖2c所示。圖2c中：M為DNA Marker;泳道1為pAH162對照;泳道2～9為轉化板上的單克隆PCR驗證結果,陽性菌株中引物P0493可以與引物P0028配對,應有2 891 bp的目的條帶。由圖2c可知,泳道3、4、6 與預期符合,為陽性克隆,泳道5、7、8、9為陰性克隆。提取陽性菌株質粒進行測序,結果表明重組質粒pAH162-sacB構建成功。

圖2 質粒pAH162-sacB構建結果分析

2.2 大腸桿菌MG1655中lacZ基因的敲除分析

利用tetA-sacB片段替換大腸桿菌MG1655中的lacZ基因,通過tetA基因產物表達的四環素抗性篩選陽性克隆。敲除大腸桿菌MG1655中的lacZ基因結果如圖3所示。圖3b中：M為DNA Marker；泳道1為大腸桿菌MG1655陰性對照,條帶大小為3 607 bp;泳道2、3為陽性克隆,分別用引物P0565/P0566、引物P0567/P0568擴增出的目的條帶,符合預期。陽性菌株保存于-80 ℃。

由圖3a可知,以pAH162-sacB為模板,擴增帶有lacZ基因上下游同源臂(H1和H2)的tetA-sacB基因片段,用tetA-sacB替換lacZ基因。敲除成功的陽性克隆基因攜帶tetA基因,從而具有四環素抗性,可以利用四環素抗性進行正向篩選。由圖3b可知,陽性克隆中引物P0565/P0566配對,P0567/P0568配對,可以分別擴增出2條大小為651、2 081 bp的特異性條帶。

圖3 大腸桿菌MG1655中lacZ基因的敲除分析

2.3 lacZ基因回補分析

由于含有鐮刀菌酸與蔗糖的培養基對攜帶有tetA-sacB基因片段的細菌生長有強烈的抑制作用。在回補lacZ基因的實驗中,可以利用tetA-sacB雙重選擇系統的反向選擇作用篩選陽性克隆，回補lacZ基因的結果如圖4所示。

圖4 lacZ基因的回補分析

由圖4a可知,以大腸桿菌MG1655為模板擴增lacZ基因,替換MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB中的tetA-sacB基因片段,在含有鐮刀菌酸和蔗糖的反選培養基上篩選,實現lacZ基因的回補。

圖4b中,M為DNA Marker;泳道1、2分別為陰性對照MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB通過P0565/P0566和P0567/P0568(圖3a)擴增出的條帶;泳道3為MG1655陽性對照;泳道4為成功回補lacZ基因的單克隆PCR結果,符合預期。保存陽性菌株于-80 ℃。

2.4 β-半乳糖苷酶活性分析

在大腸桿菌中,lacZ基因編碼合成了β-半乳糖苷酶。為了進一步驗證敲除菌株及回補菌株結果的可靠性,本文進行了β-半乳糖苷酶活性分析。β-半乳糖苷酶活性分析結果如圖5所示,圖5中：A為野生型大腸桿菌MG1655;B為敲除菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB;C為回補菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB。

由圖5可知,MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB因缺失lacZ基因,因此沒有β-半乳糖苷酶活性;野生型MG1655和回補菌株均表達較高的β-半乳糖苷酶活性,且無顯著差異。本實驗結果表明利用tetA-sacB的雙重選擇作用,實現了lacZ基因的敲除與回補。

圖5 菌株β-半乳糖苷酶活性分析

3 討 論

Red同源重組系統利用可正向選擇的抗生素抗性基因替換目標基因,實現細菌基因組中非致死基因的敲除[12]。抗性基因的正向選擇只適合基因敲除,不適合篩選基因組中非必須基因的回補,對驗證基因功能的相關研究不利。CRISPR/Cas9系統主要由Cas9蛋白和單鏈向導RNA(sgRNA)組成,在sgRNA的向導下通過堿基互補配對原則,利用Cas9蛋白對基因組進行剪切,使DNA雙鏈斷裂,實現基因敲除[13]。然而sgRNA的設計、脫靶效應、Cas蛋白和sgRNA的遞送等在一些情況下限制了CRISPR/Cas9系統的使用[14]。

本文將構建的tetA-sacB雙基因盒用于基因敲除，而共同表達2種反選擇標記基因tetA和sacB可以實現回補菌株的反向選擇。tetA基因可以作為正向標記基因,表達四環素抗性，同時tetA基因還可以用作反向篩選標記,含有鐮刀菌酸的培養基對攜帶tetA基因的細菌有致死作用,但是菌株篩選的陽性率較低[15]。sacB基因不需要抗生素抗性誘導細菌死亡[16],而是通過菌株對蔗糖的敏感性發揮反向篩選作用。sacB基因編碼胞外果聚糖蔗糖轉移酶,導致果聚糖富集,抑制細菌的生長。本文使用構建的tetA-sacB雙基因盒敲除大腸桿菌MG1655中lacZ基因,利用tetA基因產物表達的四環素抗性進行了正向選擇;在回補lacZ基因的過程中,利用tetA和sacB的反選擇作用進行篩選,陽性率高。

4 結 論

本文通過構建質粒pAH162-sacB,將2種反選擇標記基因tetA和sacB構建到一個雙基因盒,建立tetA-sacB雙重選擇系統。擴增tetA-sacB片段敲除大腸桿菌MG1655中的lacZ基因,通過四環素抗性正向選擇陽性克隆,成功篩選到陽性菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB。將lacZ基因原位回補替換MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB菌株中的tetA-sacB基因片段,利用tetA和sacB的反向選擇作用,在含有鐮刀菌酸和蔗糖的培養基上成功篩選到回補菌株。β-半乳糖苷酶活性分析結果表明，野生型菌株和回補菌株能夠表達β-半乳糖苷酶活性,且彼此間無差異,而敲除菌株因缺失lacZ基因,無β-半乳糖苷酶活性。本文利用tetA-sacB的正反選擇作用,成功實現了大腸桿菌MG1655中lacZ基因的敲除與回補,表明該雙重選擇系統選擇的有效性,可以應用到大腸桿菌的基因工程研究中,對細菌基因組進行遺傳學修飾。