大麻哈魚放流群體耳石溫控標記研究

閆春梅，鄭偉，韓葉，李忠強，肖治國，陳偉強，柳鵬

（吉林省水產科學研究院，長春 吉林 130033）

冷水性溯河產卵洄游大麻哈魚（Oncorhynchus keta Walbaum），俗稱太平洋鮭、大馬哈魚等[1]，曾在吉林省圖們江流域廣泛分布。近些年由于興修水利等人為因素破壞了大麻魚產卵洄游通道，影響自然繁殖，生殖洄游親本數量銳減，野生資源衰退，目前已處于瀕危狀態[2]。圖們江流域大麻哈魚群體遺傳多樣性較豐富[3]，可以通過人工增殖放流的方式補充大麻哈魚資源量。吉林省已開展大麻哈魚增殖放流活動十余年，年放流數量達40～50 萬尾。隨之展開的大麻哈魚放流效果評估研究也已經歷了從掛牌標記[4]、剪鰭法[5]、熒光標記[6,7]到微衛星標記[8-10]、耳石標記[11,12]等多個階段。剪鰭法和金屬線標法甚至熒光標記法均對魚體造成不同程度的傷害，且需逐尾操作，不適宜大規模標記。微衛星法對魚體沒有傷害，但操作門檻高，需要專業的分子生物學作為技術支撐，且耗資巨大，亦不適用于大規模標記。

耳石是硬骨魚類內耳的鈣質結晶，能準確記錄生活史中經歷的溫度變化，閱讀耳石輪紋的周期性、明暗度、寬窄度等信息即可推斷魚類生活的歷史水溫變化[13]。耳石溫控標記法即通過短期調控環境水溫，改變耳石上的日輪形成方式，形成終身不變的標記，為評估大麻哈魚人工增殖放流效果提供技術支持。目前，耳石溫控標記法已在紅點鮭（Salvelinus namaycush）[14]、太平洋鮭（Oncorhynchus spp）[15]、胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）[16]、大西洋鱈（Gadus morhua）[17]上獲得了成功經驗。本研究采用改變孵化期水溫的方式標記大麻哈魚耳石，根據不同的日輪圖譜確定其來源。

1 材料與方法

1.1 大麻哈魚發眼卵

試驗用大麻哈魚發眼卵由吉林省延吉市青龍漁業有限公司從圖們江流域大麻哈魚生殖洄游群體經人工繁殖所得。受精卵流水孵化，水溫8～10℃，發育至發眼期后經干法運輸至吉林省水產科學研究院繼續全程流水控溫孵化。

1.2 標記圖譜

本研究按照摩斯密碼規則設計兩組標記圖譜：CHN 和JL。摩斯密碼規定字母C 密碼為“嗒嘀嗒嘀”；H 為“嘀嘀嘀嘀”；N 為“嗒嘀”；J 為“嘀嗒嗒嗒”；L 為“嘀嗒嘀嘀”。嘀為1 個單位時長，嗒為3 個單位時長[18]。受大麻哈魚發育時長限制，本研究將嗒設為2 個單位時長，以縮短標記天數。以24 h 為1 個單位時長。以字母C 為例，嗒為2 個單位時長即48 h 高溫，嗒嘀之間為字母內間隔24 h 低溫，嘀為1 個單位時長即24 h 高溫。因此，字母C 表示為48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H 模式。字母C 和字母H 之間為字母間間隔低溫24 h，即24C。

試驗分4 組：1 組為恒溫組，全程（11±0.5）℃流水孵化；2 組為CHN 組，按照摩斯密碼規則，標記圖譜為48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H-24C-24 H-24C-24H-24C-24H-24C-24H-24C-48H-24C-2 4H；3 組為JL 組，按照摩斯密碼規則，標記圖譜為24H-24C-48H-24C-48H-24C-48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H-24C-24H；4 組為48 h 變溫組，標記圖譜為48H-48C-48H-48C-48H-48C-48H。各組標記模式圖見圖1。以高溫標記字母，低溫標記間隔的原則進行。其中白色區域代表高溫區，間隔線代表低溫區。線條及白色區域的寬度代表持續時間。

圖1 耳石溫控標記各試驗組溫控方式模式圖Fig.1 Model diagram of temperature control mode in each test group

1.3 標記試驗

試驗選取大麻哈魚發眼期受精卵干法運至實驗室后，分為4 組，1 000 粒/組。1 組為恒溫對照組；2 組為CHN 標記組；3 組為JL 標記組；4 組為48 h 變溫組。在控溫在（11±0.5）℃的水族箱中暫養2 d 后，4 組均調溫至（8±0.5）℃，作為標記圖譜起始標記。24 h 后，4 組均調溫至（11±0.5）℃，按照各組標記圖譜開始溫控標記試驗。為減少受精卵受溫度變化影響，高低溫轉換需在1～2 h 內溫和過渡。每天記錄受精卵死亡情況，挑出死卵。各組標記結束后均轉換至（8±0.5）℃，持續24 h，作為標記圖譜結束標志。

1.4 標記效果鑒定

各組標記結束后，記錄各組死亡率，隨機取初孵仔魚樣品20 尾/組，置于95%乙醇中固定，鑒定標記效果。

1.4.1 耳石摘取

從95%乙醇中取出初孵仔魚，剪下頭部置于載玻片中央，用蒸餾水清洗3 次后，滴加6.5%次氯酸鈉溶液至浸沒整個魚頭。在解剖鏡下觀察浸蝕效果，待整個魚頭組織僅剩眼部及周圍少量組織后，小心將剩余組織移除，解剖鏡下觀察，將剩余液體中的耳石小心移至載玻片干凈部位，蒸餾水清洗耳石3 次，每次用濾紙吸凈周圍液體。室溫晾干。

1.4.2 耳石制片

載玻片干燥后，在耳石旁邊滴加1 滴中性樹膠，然后在中性樹膠上滴加二甲苯，使中性樹膠擴散至耳石區域，包埋住耳石而封片，室溫晾干后，Olympus BH-2 光學顯微鏡觀察耳石輪紋。

1.4.3 標記圖譜分析

按照設定的標記圖譜，人工調節水溫形成特殊的耳石標記日輪。溫控試驗前以24 h 低溫標記輪作為標記圖譜起始信號，標記結束后以24 h 低溫標記輪作為標記圖譜結束信號。繪制標記條形碼用于建立標記檔案。以樣品中耳石出現標記圖譜的仔魚數量占取樣總數的百分比計算標記率。以標記中死亡胚胎數量占起始樣品總數的百分比計算死亡率。

2 結果與分析

2.1 耳石標記圖譜鑒定

大麻哈魚耳石原基及中心核區形成于發眼期[19]，因此本研究在大麻哈魚發眼期后進行耳石溫控標記。根據國際通用摩斯密碼規則設計可辨識率高的標記圖譜，按照各組標記圖譜（圖1）實施溫控標記。結果顯示，4 組耳石樣本標記率達到100%。各組耳石中心核區均出現的第1 條暗帶，為大麻哈魚發眼卵由養殖場運輸至控溫實驗室過程中形成的標記輪。第2 條暗帶為控溫試驗開始前各組均調整水溫至（8±0.5）℃，形成的標記圖譜起始標記。之后各組輪紋均按照各組預先設計的標記圖譜實施控溫標記，各組標記輪紋與設計圖譜一致。CHN 組和JL組標記輪紋中，以白色區域代表標記圖譜形成模式，白色區域的寬度代表持續時間的長短。暗色輪紋僅作為分隔（圖2）。

圖2 耳石溫控標記圖譜Fig.2 Maps of otolith thermal marking

2.2 標記率及死亡率

各組標記結束后，記錄各組標記率及死亡率（表1）。由表1 表可知，除恒溫對照組外，各組所采樣品均檢測到與預期相符標記圖譜，標記率100%。除CHN 組死亡率略高于恒溫對照組外，其他標記組死亡率均低于恒溫組，各組差異不顯著（P＞0.05）。

表1 溫控標記各組標記率及死亡率情況表Tab.1 Marking rates and mortality in each group

3 討論

3.1 耳石標記時間

魚類耳石第一日輪的形成存在種間差異，如底鳉（Fundulus heteroclitus）的第一日輪形成于剛孵出時[20]；鯡（Clupea harengus pallasi）第一日輪形成于卵黃囊完全吸收后[21]；歐洲鳀（Engraulis encrasicolus）第一日輪形成于孵出第2 d[22]，而大麻哈魚耳石第一日輪則形成于發眼期[19]。因此，本研究選擇在大麻哈魚受精卵進入發眼期后開始實施標記。

3.2 耳石制片

魚類耳石通常有三種制片方式：剖片、壓片和磨片，其中，剖片和壓片適用于發眼期至破膜階段的胚胎期，磨片則適用于稚魚至成魚階段的大規格魚類。本研究在大麻哈魚發眼卵至破膜階段進行溫控標記，不需要用磨片。壓片方式未摘出耳石，而是用蓋玻片直接將整個胚體壓制成片，耳石外有組織覆蓋，鏡下觀測耳石輪紋清晰度不夠。經試驗驗證，最終選擇剖片方式進行耳石制片。

剖片是在解剖鏡下利用解剖工具摘取耳石。經過多次試驗驗證，破膜期魚體規格小，耳石僅有0.25 mm×0.35 mm[23]，解剖鏡下摘取耳石難度很大,且存在標本不潔凈等問題。本研究使用次氯酸鈉這種腐蝕性溶液，將耳石周圍組織腐蝕掉，使耳石的摘取變得容易，且耳石干凈，鏡下觀察耳石輪紋清晰，利于標本的長期保存。

3.3 標記效果

大麻哈魚耳石標記圖譜主要用于區分放流大麻哈魚的不同屬地。要求標記圖譜具有獨一無二及高度可辨識特征。本研究將國際通用摩斯密碼規則融入大麻哈魚耳石標記圖譜的設定，主要因為摩斯密碼編碼簡單清晰，二義性小，編碼主要是由兩個字符表示：“.”和“—”，一短一長，通常也稱為“嘀”、“嗒”。通過不同的排列順序來表達不同的英文字母、數字和標點符號。

本研究設立CHN 和JL 兩組字母組合作為標記圖譜。大麻哈魚耳石標記最佳標記時間在發眼期至破膜期之間，受精卵破膜之后活動范圍變大，攝食活動等會不同程度地影響標記圖譜，使標記難度增加。因此，本研究將標記天數控制在20 d 左右。同時考慮到標記圖譜的清晰性，將短標記“嘀”設為24 h，長標記“嗒”設為48 h，使長標記和短標記區分更加明顯。CHN 組標記整個標記期用時22 d，JL 組標記用時19 d。將摩斯密碼規則應用于耳石標記，保證了標記的清晰性、準確性及高度可辨識性。

為了驗證耳石溫控標記法是否影響大麻哈魚孵化率，本研究以恒溫對照組作為參照，標記過程中每天記錄各組卵粒死亡情況。標記結束后，統計各組受精卵死亡情況。恒溫對照組標記受精卵共死亡36 粒，死亡率3.6%，CHN 組死亡率稍高于對照組，共死亡38 粒，死亡率3.8%，JL 組和48 h 恒溫對照組死亡率均小于恒溫對照組，分別為3.0%和3.1%。組間差異不明顯。可見，耳石溫控標記法不會對大麻哈魚卵孵化率造成不良影響。同時，檢測CHN 組、JL 組和48 h 恒溫對照組所有采集樣本的耳石輪紋。結果顯示，除恒溫對照組外，其他三組所有采集的耳石樣本均出現與各組預設標記圖譜相一致的清晰輪紋，各組標記率均達100%。

3.4 耳石溫控標記的應用

耳石終生生長，具有代謝惰性，一旦沉積，耳石材料不可能被重吸收或者改變。因此，可以從魚類耳石入手，利用魚類耳石能準確記錄生活史中的經歷事件，如溫度波動、攝食及饑餓、光周期等特點，人為短期地對水溫進行調控以改變耳石上的一個或多個生長輪紋的特征，形成終身可識別的標記。再通過閱讀耳石輪紋生成的周期性、寬度及光密度等信息識別放流群體。本文僅僅通過人工調控溫度波動就能對胚胎、仔魚耳石進行有效地大規模標記，方法簡單，費用低廉，可以滿足對大麻哈魚放流進行長期跟蹤評估的技術要求。