黃、渤海魚類DNA 條形碼信息平臺構建及應用

曲欣宇，劉璐，李純厚，王晨陽，彭子為，劉敏姝，焦天琪，陳治，樊鑫

（1.山東交通學院，山東 威海 264209；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東 廣州 510300；3.海南熱帶海洋學院，熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室，海南 三亞 572022；4.海南熱帶海洋學院，海南省熱帶海洋漁業資源保護與利用重點實驗室，海南 三亞 572022）

DNA 條形碼（DNA barcoding）被定義為生物體內一段或者幾段能夠代表物種的、標準的、有足夠變異的且易擴增的基因片段。與商品條形碼對應商品信息類似，此類片段與物種信息存在唯一的對應關系而得名。國際生命條形碼協會（the International Barcode of Life,iBOL）建議以線粒體COI（CO1 或COX1）基因作為動物DNA 條形碼[1]。作為生態學研究的重要工具，DNA 條形碼通過序列分析和核苷酸差異比對，可準確鑒定物種，有助于發現新物種、隱存種和新記錄種[2]。基于分子生物學分析手段的DNA 條形碼對分類學基礎的要求較低。以DNA 序列為檢測對象，在整個生物個體發育過程中遺傳信息不會改變。在一些特殊情況下，DNA 條形碼也可以得到有效應用[3]：如1）標本受到嚴重損壞或標本經過加工，形態發生變化，單靠肉眼無法觀察識別；2）生物發育過程中常經歷“變態”過程，卵和幼體存在差異；3）某些生物具有世代交替的現象，形態學方法難以分辨識別；4）外形極為相近的近緣物種；5）在魚類早期發育過程中，復雜多樣的“同種異型”（包括雌雄異型）和“異種同型”現象時有發生，傳統形態學分類困難；6）對于瀕危物種，個體取樣會對生物造成不可修復的損傷，近距離觀察同樣存在較大困難。與基于物種外觀或者解剖特征的傳統分類學相比，DNA 條形碼檢測樣本范圍廣、準確率高、節省時間和精力。憑借這些優勢，DNA 條形碼廣泛應用于生物、醫藥、食品等科學領域。

隨著DNA 條形碼技術應用和不斷發展，產生了海量的DNA 條形碼與對應的物種分類信息。快捷有效地管理和共享這些信息成為制約DNA 條形碼進一步使用和發展的因素。構建DNA 條形碼數據信息系統為解決這一問題提供了有效辦法。DNA條形碼數據信息系統既可以作為存儲DNA 條形碼序列和樣品信息的媒介，又可以為后續條形碼研究和物種分類鑒定提供生物信息平臺[4,5]。2007 年，生命條形碼協會（Consortium for the Barcode of Life,CBOL）建立了生命條形碼數據庫系統（Barcode of Life Database Systems,BOLD systems）[6]，這是全球第一個集存儲、分析和利用為一體的DNA 條形碼數據系統，截止2020 年2 月已收錄了800 多萬條DNA 條形碼序列，涵蓋了30 多萬種動物、植物和真菌等生物[7]。為了深入研究特定生物類群，生命條形碼協會還設立了一些具有針對性的特殊條形碼數據庫，如魚類條形碼數據庫--Fish Barcode of Life（http://fishbol.org/）。2011 年我國建立了首個DNA條形碼平臺--中國生命條形碼數據門戶中心（http://www.barcodeoflife.cn/）[8]。此后，國內各領域又針對性地建立了一系列條形碼數據庫（表1）。

表1 我國DNA 條形碼數據庫構建代表舉例Tab.1 Representative examples of DNA barcode database construction in China

隨著第二代生物測序技術的出現，高通量測序技術在傳統DNA 條形碼研究中應用，DNA 宏條形碼技術（DNA metabarcoding）應運而生。相比于傳統DNA 條形碼技術能綜合、快速、有效地分析復雜混合樣品和大尺度范圍樣品，能自動識別多個物種，既降低成本又擴展了該技術的應用范圍[9]。然而，DNA 宏條形碼技術依然存在一些問題：（1）需要控制測序錯誤率，提高測序質量。DNA 宏條形碼技術的文庫構建依托于PCR 擴增產物，測序時易產生堿基不平衡現象，增加數據誤差，降低測序質量[10]；（2）樣品前處理差異和實驗過程差別會影響樣品DNA的濃度和質量，而DNA 宏條形碼技術的實驗結果直接取決于DNA 是否完整[11]；（3）DNA 片段的選擇、對照數據庫的規模和精確度與樣品的識別準確率直接相關[12]；（4）物種間可變引物和模板錯配會產生PCR 偏差，可能導致某些物種的漏檢或錯檢，還會影響DNA 宏條形碼技術的定量應用[13]。基于以上幾個因素，再考慮到實驗結果的準確性和實驗經濟成本、時間成本等問題，采用一代測序技術構建DNA 條形碼信息平臺更為可行。

相比于傳統形態學分類，DNA 條形碼技術和宏條形碼技術在物種鑒定方面具有不可取代的優勢。然而，后兩者依然存在一定的局限性。例如：二者在應用中無法區分死亡個體和存活個體，無法直觀地判定物種的發育階段，針對物種生物量和豐度無法開展定量分析，無法獲取性比等。因此，不能用兩種條形碼技術完全替代傳統形態學分類，而是在生物信息庫的建設過程中要充分結合傳統形態標本的觀察和DNA 條形碼技術的應用構建綜合性平臺。

我國黃海和渤海擁有豐富的魚類資源，有記錄的魚類多達三百余種[14]。常見的市場在售和漁業資源調查統計中的魚類對象也有幾十種，表明黃、渤海擁有大量的魚類生物學信息數據。然而，由于近些年的過度捕撈和環境污染，很多經濟魚類一度出現嚴重的資源衰退甚至枯竭，有效保護魚類生物種質資源迫在眉睫，開展黃、渤海魚類DNA 條形碼信息的收集工作勢在必行。盡管BOLD 系統、Fish-BOL系統和我國國家海洋水產庫已收錄了海量的（包括魚類在內）海洋生物DNA 條形碼數據，但是前兩個系統主要側重點在于歐、美和澳等國家的漁業物種信息，缺少對我國特定種類的收錄，同時無法體現由我國特定的水域環境和地理位置而造成的物種分化，而后者因涉及的水產和漁業生物種類繁多，具體到魚類分類的收錄內容和記錄種偏少，部分魚類形態圖像憑證不清晰，有些缺少條形碼記錄，憑證信息不全面或存在一些模糊標識。

本課題組以黃、渤海地區常見魚類[14-17]和DNA條形碼數據庫資料為基礎，搭建黃、渤海魚類生物的DNA 條形碼數據庫，為物種鑒定、信息瀏覽及查詢提供網絡平臺，以期快捷、有效、安全地管理數據和共享信息，完善魚類流通監管體系，并為黃、渤海魚類的分類鑒定、種質資源遺傳多樣性保護和質量安全的相關研究提供借鑒和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取魚類線粒體COI 基因片段作為DNA 條形碼標記。其中，DNA 條形碼數據來源于項目組采集的魚類憑證標本（圖1）及其對應的DNA條形碼序列。采集標本后，首先進行傳統形態學的分類鑒定，然后取背鰭基部肌肉提取DNA 基因組。擴增魚類樣本的線粒體COI 基因序列，通過DNASTAR 軟件進行序列比對分析[18]。分析所得數據經實驗驗證，對應的憑證標本均可追溯。將提交的DNA 序列信息使用NCBI 進行BLAST 比對，判斷其是否為污染序列或同源序列，以保證所得DNA條形碼序列和物種信息數據真實可靠。還收集了與DNA 條形碼對應的樣品基本信息、憑證標本采集信息等數據，作為保障DNA 條形碼序列真實性的可追溯信息。

圖1 部分魚類憑證標本圖Fig.1 Specimen of some fish certificates

另一部分數據從GenBank 數據庫中檢索收集，根據黃渤海魚類志等有記錄的參考資料，選擇基因名稱為“COI”、“CO1”、“COX1”的序列。采用BLAST進行數據校正分析、構建系統樹檢驗數據準確性和Barcoding Gap 校驗防錯等，以保證條形碼數據的可靠性。也將一并記錄魚類的分類階元、拉丁名、條形碼序列相關信息等。針對存在同源序列，筆者選取序列長度最長的一條序列作為DNA 條形碼使用。

1.2 數據庫的設計

本信息平臺主要由以下三個數據庫組成：DNA條形碼數據庫、標本數據庫和物種文獻數據庫，三個數據庫采用統一的規范格式建立數據，以避免數據形式不統一造成數據存儲、共享過程產生障礙。數據庫采用SQL server 服務開展存儲和檢索。其中，物種文獻數據庫以NCBI Taxonomy 數據庫的分類階元分類為基礎，同時借鑒參考《黃渤海魚類圖志》、FishBase（http://fishbase.org/）和國家水產種質資源庫（http://zzzy.fishinfo.cn/）等構建而成。每個物種作為一條記錄，擁有唯一明確的分類階元關系，以拉丁名作為唯一標識和主鍵。物種的英文名、中文名、俗名、同種異名、形態特征、生態習性、地理分布和參考文獻等信息也將一并展示。本數據庫中，物種的拉丁名和分類地位作為必要信息出現。標本數據庫展示課題組所采集樣品的詳細信息，包括拉丁名、憑證編碼、標本保存位置、樣品照片、特征描述、提交者以及錄入時間等。本數據庫以物種拉丁名作為外鍵，并關聯于物種文獻數據庫的拉丁名。對于在標本數據庫中，入庫編號、物種的拉丁名作為必要信息。DNA 條形碼數據庫展示以上兩數據庫所對應的DNA 條形碼，每條DNA 條形碼對應唯一的物種信息。該數據庫包括物種拉丁名、英文名、中文名、DNA 編碼、序列長度、基因位點、物種序列二維碼、數據來源等。以物種拉丁名為外鍵，與物種文獻數據庫的拉丁名關聯。

1.3 共享平臺的模塊設計

搭建門戶網站是國內外實現數據開放和共享的主要方式之一。本系統包括三個模塊：（1）數據門戶模塊（面向用戶）：在網頁門戶展示項目進展、數據統計和新聞信息。用戶利用搜索框鍵入關鍵詞后可查詢數據庫中的物種文獻、標本和DNA 條形碼序列信息。該模塊同樣支持通過魚類物種圖鑒瀏覽物種名錄，選擇感興趣的物種，查詢對應的信息；（2）物種鑒定模塊（面向用戶）：針對開展了分子測序的樣品，分析其測序鋒圖，根據Q 值檢驗單個堿基和雙向測序序列質量，對比合成該測試樣品的線粒體COI 序列片段。將待鑒定序列與數據庫進行同源比對，參考比對結果及閾值鑒定物種；（3）管理模塊（面向開發者）：執行可視化數據平臺管理，后臺數據查詢、導入、增刪改、備份和日志維護等功能。

1.4 平臺框架的實現

基于CentOS 7.8.2003 x86_64 操作系統構建的服務器服務以上三個模塊。為實現數據門戶和物種鑒定的兩個功能，筆者采用“瀏覽器+服務器端”的架構。用戶通過瀏覽器訪問服務器，檢索查詢信息和鑒定物種。服務器端以表現層、數據訪問層、設計層進行開發（圖2）。表現層包括信息檢索、物種鑒定和數據統計等功能，利用PHP+sqlite 輕型數據庫技術開發網站實現表現層功能；在數據訪問層的實現方面，數據門戶模塊通過SQLdb 連接服務器端的SQL Server 數據庫，系統支持內容模型、多語言、自定義表單、篩選、多條件搜索，允許以物種拉丁名、物種學名、物種分類階元等為關鍵詞查詢標準數據集信息；在數據庫設計層中放入PHP 空間即可直接使用，可選mysql、pgsql 等數據庫，滿足各類存儲需求。

本研究采用高效、簡潔、兼容的模板標簽，基于LayUI 的響應式管理后臺，滿足各類設備隨時管理的需要，自主研發的高速多層框架及緩存技術，代碼整齊規范，便于二次開發（圖2）。基于第三方開源代碼PHP QR Code 的編碼方式將各種魚類基于原物種拉丁名和COI 序列進行編碼，將構建信息平臺所使用的魚類DNA 條形碼提交至二維碼生成器，獲得各物種二維DNA 條形碼圖片。

圖2 信息平臺構建框架Fig.2 The construction framework of the information platform

2 結果與分析

2.1 數據統一規范管理

黃、渤海魚類DNA 條形碼信息平臺包括物種文獻數據庫、標本數據庫和DNA 條形碼數據庫。物種名稱和基本信息將這三個數據庫緊密聯系在一起，建立“物種—標本—DNA 條形碼”三者的相互對應關系，達到利用DNA 條形碼清晰明確地反映對應魚類物種信息的目的。本平臺數據中，一個魚類物種可能對應多個樣品標本，這是因為同一物種所采樣品的形態和年齡存在差異，此外，樣品的采樣時間和地點亦可能不同。反之，由于遺傳信息的高度保守性，同一物種的多個樣品有且只有唯一的DNA 條形碼。目前，本標準庫已收錄309 個魚類物種的900 多條DNA 條形碼序列（圖3）。

圖3 以藍點馬鮫（Scomberpmprus niphonius）為例展示DNA 條形碼數據庫檢索Fig.3 DNA barcode database retrieval is demonstrated taking mackerel Scomberpmprus niphonius as an example

標本數據庫含有相對完整的相關采集信息和標本信息，主要分為樣品編碼、分類階元、分布范圍、采樣地、一張或多張樣品照片等；物種文獻數據庫主要介紹該物種的分類地位、別名、同種異名、分布、習性和形態特征等基本要素；DNA 條形碼數據庫主要涵蓋了各種魚類的COI 基因序列，一部分由筆者采集到的魚類標本通過實驗得到的序列片段，另一部分是由NCBI、BOLD 等數據庫收集到且經校驗后的序列片段。雖然依靠自身采樣測序實驗等所獲取的數據更加詳實可靠，但是在實際操作中，非習見種的采樣存在一定的困難和偶然性，所獲得的樣本數據量較小。因此，參考其他數據庫的擴充途徑是切實可行且必要，能夠有效彌補原有自建數據庫數據量不足的短板。

2.2 平臺客戶端

本平臺有兩種訪問模式，首先是網頁訪問模式，有黃、渤海魚類分類信息和DNA 條形碼數據使用需求的用戶可以訪問https://www.fishdna.com.cn/，該網站具有全面的信息查詢和檢索功能。可分別在三個數據庫頁面中以魚類拉丁名即學名檢索物種信息，并通過頁面鏈接圖標進行數據庫切換（圖4）。黃渤海魚類DNA 條形碼信息平臺數據庫每隔2 周更新維護一次。新增加的樣品按照各子數據庫的內容要求上傳標本信息、文獻分類信息和對應的DNA條形碼序列。

圖4 黃、渤海魚類DNA 條形碼數據庫構成Fig.4 Composition of DNA barcode database of fish in the Yellow Sea and Bohai Sea

另一種訪問模式是通過手機瀏覽器訪問，借助移動終端平臺，用戶可以更加方便、快捷地進行網頁瀏覽，隨時隨地查詢物種信息，項目成員則可以及時維護平臺、上傳和更新數據。本平臺的數據每3個月備份一次，保障數據避免丟失（圖5）。

圖5 手機瀏覽器訪問數據庫的可視界面Fig.5 Visual interface of mobile browser accessing database

2.3 物種鑒定系統

準確高效地鑒定物種是構建黃、渤海魚類DNA條形碼數據庫的高階目標。需要鑒定物種的用戶訪問黃、渤海魚類DNA 條形碼數據庫平臺，選擇目標物種（圖6），完成數據檢索后下載，為保證數據準確性，采用生物學軟件進行序列比對和構建系統關系樹。通過對比未知物種與目標物種DNA 條形碼的相似度，判斷二者親緣關系。

圖6 以藍點馬鮫（Scomberpmprus niphonius）為例演示物種鑒定Fig.6 Species identification progress taking mackerel Scomberompurus niphonius as an example

2.4 黃渤海魚類二維DNA 條形碼流通監管體系

黃、渤海魚類DNA 條形碼二維碼的建設分為DNA 條形碼序列的獲得和DNA 條形碼信息跨平臺轉換兩部分，包括DNA 提取、PCR 擴增和測序等分子生物學相關實驗步驟以及序列拼接和二維碼轉換等生物信息學步驟，用戶可以通過掃描二維碼得到物種條形碼序列信息（600 bp 左右），將得到的序列與黃渤海魚類DNA 條形碼數據庫中對應物種序列進行比對，即可獲知該魚的物種信息（圖7），通過以上操作可形成完整的二維DNA 條形碼監管體系。

圖7 黃、渤海魚類二維DNA 條形碼流通監管體系Fig.7 Two dimensional DNA barcode circulation supervision system of fishes in the Yellow Sea and Bohai Sea

3 討論

黃、渤海魚類生物DNA 條形碼信息平臺的網頁內容和平臺設置具有較強的閱讀性，任何對黃渤海魚類感興趣的個人和單位均可通過該網址鑒定和查詢黃渤海魚類。通過用戶界面的簡單快捷操作，沒有專業分類學經驗的研究人員也能夠完成對黃渤海魚類的鑒定，充分實現整個鑒定過程的準確、遠程、便捷。黃、渤海魚類生物DNA 條形碼信息平臺的建立具有重要的理論意義和廣泛的應用前景。首先，數據庫的不斷更新和整合能夠對渤海魚類DNA 條形碼進行拾遺補缺，促進魚類生物學的研究。其次，借助DNA 條形碼技術，能夠提供準確的物種鑒定，及時發現瀕危種、新種和外來種等，助力黃、渤海區域漁業資源和生物多樣性的保護[19,20]。在魚類工廠化繁育和增殖放流過程中，能夠保證種質資源的準確性和穩定性，確保增養殖過程和放流過程的順利開展。最后，在生產生活中，黃、渤海魚類DNA 條形碼信息平臺的應用能夠規范魚類制品加工、流通等環節，有效杜絕以次充好和以假亂真等現象[21]。

在通過DNA 條形碼鑒定物種的過程中，筆者根據Hebert 等[2]對動物界數萬種生物的COI 基因序列比較分析表明，98%的物種種內遺傳距離差異為0%～2%[22]。因此，當利用黃、渤海魚類DNA 條形碼數據庫進行鑒定時，只有當查詢序列與參考序列通過生物學軟件比對后發現具有小于或等于2%的遺傳差異時，才能夠被認定為是同一物種。

黃、渤海魚類DNA 條形碼信息平臺的建設也將隨著科技信息技術的發展而推進。近幾年，大家所熟知的微信、APP 等成為各種信息服務平臺開展用戶使用交流的平臺，信息傳播和應用過程中扮演了重要角色，而目前僅有電腦端和手機端兩種瀏覽器訪問模式。在今后的研究中，用戶通過以上平臺與筆者的信息平臺建立鏈接，無論是下載APP、關注公眾號或者使用微信小程序，都可以直接通過移動端進行檢索。以上服務終端的運營維護，能夠加快對平臺的宣傳，提高網站質量，保證數據共享和信息服務的便捷、準確和穩定，不僅可以推廣本研究平臺的使用，還能夠定期向用戶推送物種鑒定相關信息和文獻，將新物種、稀有物種、常見經濟魚類等依次面向公眾進行科普。為了促進本平臺在國內外的數據共享，幫助更多用戶實現數據檢索和使用，筆者在網頁主界面中添加了NCBI 數據庫、中國動物主題數據庫、世界魚類數據庫和BOLD 等數據庫鏈接框，以便用戶參考比對。同時，在后續的網頁設計和數據更新中還將設計中英文對照界面或增設網站英文版。

目前，本平臺條形碼數據僅限于物種的線粒體COI 序列，物種的鑒定方法只支持COI 基因的檢索下載。現有研究表明，只依靠單一的條形碼基因往往不能準確鑒定區分一些特定物種[23]。針對這一問題，在后續的研究中，本平臺將開展多基因條形碼鑒定，補充16S rRNA、12S rRNA、D-loop、cyt b 和核基因等作為新的DNA 條形碼序列，不斷豐富數據類型、充實數據庫，進一步提高物種鑒定的準確度，滿足不同類型研究的需求。在后期的數據庫建設中，需要加大對于黃、渤海不常見魚類、易忽視類群、形態鑒定極易混淆類群的條形碼信息采集力度，增加條形碼信息的覆蓋度，同時持續性地增加單一種類不同地理群體樣本條形碼的數量，為進一步發掘黃、渤海魚類的物種遺傳多樣性，更深層次地尋找分布規律，更好地開展魚類生態學、分子系統地理學研究提供數據基礎和良好平臺。

對于黃、渤海魚類的生產應用而言，保證種質極為重要，二維碼DNA 條形碼技術能通過溯源監控物種的真實性，通過DNA 條形碼數據庫比對和鑒定，確保甄別物種的準確性，避免因不易區分的物種混淆而造成不必要的經濟糾紛，保證消費者的切身利益。該數據庫也可為水產品養殖公司定制專屬鑒定系統，提供企業所經營物種的二維DNA 條形碼，對各養殖場和苗種繁育基地進行標示，便于企業統一管理和經營。食品采購商在購買海洋魚類時，通過掃描水產養殖公司提供的二維碼即可了解商品的基本信息（包括產地、生產日期、種類、加工方式等），同時還能夠通過DNA 條形碼信息辨別真偽，尤其適用于失去形態結構的初加工魚制品，真正實現“掃一掃，知真假”。同時，還可以實地抽檢，以便二次核實。超市、水產品交易市場等可使用二維碼對其經營的魚類冷鮮食品進行歸類整理，避免標識錯誤或地方名、俗名不統一的情況發生。隨著生物信息新技術和新方法的誕生和應用，DNA 條形碼技術在未來仍將持續發展，成為海洋生態學和海洋生物保護學重點研究內容。本平臺的建設將為黃、渤海魚類理論研究和產業發展提供可靠的信息服務和技術支持。