氨氮濃度對金魚藻生長及生理指標的影響

黃曉麗，王慧博，竇乾明，霍堂斌

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江流域漁業生態省野外科學觀測研究站，黑龍江 哈爾濱 150070）

由于我國人口增長、工業和農業的飛速發展，大量外源性氮的輸入，湖泊水體氮素過剩與氮素污染問題日益突出[1,2]，水體富營養化和區域環境惡化等已威脅到農業灌溉用水，甚至居民飲用水的安全[3]。水體中過量的氮素可通過水生植物吸收或利用、根系微生物作用等方式加以去除[4,5]。沉水植物能吸收氮素，根系還能控制底泥中營養物質的釋放，在緩解和消除湖泊氮素污染中發揮重要作用[4,6]?；謴秃椭亟ǔ了参锶郝涫钱斍皣H上應用較為廣泛的富營養化水體原位生態修復技術[7]。因此，研究氮素對沉水植物的影響對于深入理解富營養化水體氮素去除機理具有重要意義。

沉水植物可有效去除氨氮并吸收利用氨氮（NH4+-N）與硝酸鹽氮（NO3--N）合成自身細胞物質[8,9]。對此已進行了相關的研究，證實其去除效率隨氮負荷的升高而下降，且較高的氮素濃度對沉水植物有脅迫作用[10,11]。高濃度NH4+-N 均顯著影響沉水植物的生長速率、光合作用速率，導致葉綠素含量下降，體內活性氧或自由基超出抗氧化系統的清除能力，抗氧化酶活性異常，膜質過氧化傷害[8,12,13]。

金魚藻（Ceratophyllum demersum L.）是一種全世界分布廣泛的沉水植物，也是淡水湖泊的常見優勢種。金魚藻無根系，可通過改良的葉子附著在底泥上生長，因其對水質變化反應敏感，且常出現在中等至高度富營養化的湖泊中，被認為是觸發淺水湖泊穩態轉換的先鋒種之一[9,14,15]。目前，關于NH4+-N 對金魚藻的生長、水質凈化效率、氮素吸收能力、生理指標變化等影響已有研究[9,14-17]，但多為結合pH、磷、NO3--N 等復合污染條件下開展，部分研究僅為短期實驗，且測定的生理指標較為單一。關于NH4+-N 對金魚藻生長、生理指標及相應氮素去除效率的綜合研究還鮮有報道。本研究采用靜態水培法，考察不同NH4+-N 濃度下金魚藻的生長狀況，監測水溶液中3 種無機氮濃度的梯度變化，分析培養前后金魚藻體內的蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量的變化，旨在為富營養化水體修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用金魚藻采自廣東省中山市小欖鎮綠森園藝培育池塘，在無污染物的溫室條件下不加氮的營養液中培養一周以上。選取生長良好、長勢一致的水培植株，徑高（15.62±3.43）cm，用去離子水洗凈，然后移入實驗玻璃缸開始實驗，每個玻璃缸中金魚藻的初始生物量為35 g，用陶瓷環和海綿固定。

儀器與試劑有：TU-1901 型紫外可見光分光光度計（北京普析通用公司）；PHS-25 型pH 計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）；GFL-70 烘箱（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）；FA2104B 電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）。NH4+-N、NO3--N 和亞硝酸鹽氮（NO2--N）標準品均購自國家標準物質研究中心。硫酸銨、霍格蘭氏營養液配制和三種無機氮分析實驗所用的試劑均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

實驗容器為長35 cm、寬15 cm、高25 cm 的玻璃缸。NH4+-N 濃度設置2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1、8.00 mg·L-1、16.00 mg·L-1和20.00 mg·L-15 個梯度（EG 1～EG 5）。在玻璃缸中加入10.0 L 含不同濃度NH4+-N 的霍格蘭氏培養液中，總磷濃度均為0.5 mg·L-1，移入經過預培養的金魚藻。實驗期間水溫為（25±1.0）℃，各實驗組營養液初始pH 為7.25±0.37。實驗開始后每天測定培養液的pH，利用0.01 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調節pH 在7.00～7.50 范圍內。利用專業的水草燈補光，白日光照強度為40～60 μmol·m-2·s-1，補光時間為12 h，晚上不照明。實驗設置不加植物無NH4+-N 的溶液空白（BC），對比分析金魚藻對水溶液中NH4+-N 的去除情況；設置不加NH4+-N 只加植物的對照組（PC），對比金魚藻在有無NH4+-N 條件下的生長狀況，每個處理組設3 個平行。每24 h 向各處理組補充自來水并混合均勻，保持培養液體積不變。實驗過程中，分別在培養的第1 d、2 d、5 d、7 d、9 d、12 d、14 d、16 d、19 d 和21 d 上午8：00～9：00，采集水體樣品，測定水體中NH4+-N、NO2--N 和NO3--N 的濃度，比較金魚藻對NH4+-N 的去除效果。在培養第1 d 和第21 d，測定金魚藻的生物量，然后取一部分用去離子水沖洗干凈，吸干表面水分，剪碎后取樣測定蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量。所有分析指標測定3 次平行取平均值。

根據《水和廢水監測分析方法（第四版）》中規定的方法測定水體中三種無機氮的濃度。采用納氏試劑分光光度法測定NH4+-N 濃度，采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定NO2--N 濃度，采用分光光度法測定NO3--N 濃度，利用pH 計測定溶液的pH。

金魚藻生物量測定方法：培養前后，用去離子水沖洗干凈金魚藻，吸干水分后，稱取濕重（Wet weight，ww）。取部分樣品，在105℃下烘干，測定金魚藻的含水率，以計算干重（Dry weight，dw）。金魚藻中蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定，蛋白含量為10%組織勻漿蛋白濃度，單位為gprot·L-1，葉綠素濃度單位為mg·g-1ww，植物可溶性糖和脯氨酸以μg·g-1ww為單位。

1.3 數據統計與分析

數據采用平均值±標準差表示，利用Microsoft Excel 2016 軟件處理數據、作圖；采用SPSS 軟件（25.0 版，SPSS Inc.）對所測數據分別進行正態檢驗和方差齊性分析。對金魚藻生物量、水中三種無機氮含量、金魚藻生理指標的相關參數，以NH4+-N 濃度為控制因子進行單因素方差分析，如果處理間有顯著差異，進一步利用Turkey HSD 法進行多重比較。利用獨立樣本t-檢驗分析兩個不同處理組的差異顯著性。以P＜0.05 為差異顯著水平，P＜0.01 為差異極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 金魚藻在不同濃度NH4+-N 溶液中的生長情況

在21 d 的培養中，不含NH4+-N 的對照組金魚藻能夠正常生長，但有部分葉片脫落；在不同NH4+-N 濃度溶液中金魚藻長勢良好，生長旺盛，無葉片枯黃或死亡現象。各濃度組中金魚藻的總生物量均有增加（圖1）。在2.00 mg·L-1濃度組中總生物量增長最高，濕重增加23.86 g，干重增加0.45 g；其次為4.00 mg·L-1和8.00 mg·L-1濃度組，總生物量的增加量按干重計分別為0.27 g 和0.22 g，按濕重計分別為9.01 g 和16.28 g；最小值出現在20.00 mg·L-1濃度組，干重增長量僅為0.073 g，濕重增長量為11.03 g。

培養21 d 時，不同濃度的NH4+-N 溶液培養下金魚藻的總生物量增長量具有極顯著性差異（P＜0.0001）（圖1）。在2.00 mg·L-1NH4+-N 濃度下，金魚藻總生物量增長量顯著高于對照組和8.00～20.00 mg·L-1NH4+-N 濃度組（P＜0.05）。在4.00mg·L-1NH4+-N 濃度下，金魚藻總生物量增長量均顯著高于8.00～20.00 mg·L-1NH4+-N 濃度組（P＜0.05）。較高濃度NH4+-N（16～20 mg·L-1）抑制了金魚藻的生長，總生物量增長量均低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同NH4+-N 濃度培養下金魚藻總生物量變化Fig.1 Total biomass of hornwort C.demersum exposed to different ammonia concentrations

2.2 金魚藻對水溶液中NH4+-N 的去除

在培養期間，溶液空白（BC）中NH4+-N 濃度變化不大（0.018～0.25 mg·L-1），可能為配置溶液過程中帶入的NH4+-N；對照組（EC）中NH4+-N 濃度略低于溶液空白（BC）且偶爾有波動（0.0041～0.24 mg·L-1）。總體而言，不同處理組中的NH4+-N 濃度均隨培養時間延長而下降。經過21 d 的培養（圖2），金魚藻對不同處理組（2.00～20 mg·L-1）中NH4+-N 的平均去除率分別為97.96%、99.30%、81.44%、57.46%和47.21%。隨著水溶液中NH4+-N 濃度的增加，金魚藻對NH4+-N 的平均去除率逐漸降低（圖2）。在2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1和8.00 mg·L-1NH4+-N 濃度下，金魚藻對NH4+-N 的平均去除率達到80%的時間分別為9 d、14 d 和21 d。在16.00 mg·L-1濃度下，金魚藻對NH4+-N 的去除率顯著降低（P＜0.05），當溶液濃度達到20 mg·L-1時，去除率僅為47.21%。

圖2 金魚藻培養水溶液中NH4+-N 的去除效率Fig.2 Removal efficiency of NH4+-N in the water with hornwort C.demersum cultivation

2.3 水溶液中NO3--N 和NO2--N 濃度的變化

溶液空白（BC）和對照組（EC）中NO3--N 和NO2--N 濃度均呈波動變化，數值范圍分別為0.19～0.72 mg·L-1和0.019～0.74 mg·L-1（圖3-a）。因在配制溶液過程中未加入NO3--N 和NO2--N，因此，溶液中測到的NO3--N 和NO2--N 可能為初始配置溶液時帶入，或是由NH4+-N 轉化而來。各處理組中NO3--N 濃度整體呈先升高后降低的趨勢，最高平均值出現在16 mg·L-1條件下第14 d，為1.88 mg·L-1。隨著NH4+-N 濃度的升高，水體中的NO3--N 累積的濃度也隨之增加。在培養2～14 d 后，高濃度NH4+-N（16～20 mg·L-1）組的NO3--N 濃度顯著高于溶液空白、對照組和低濃度組（2～4 mg·L-1）。

各處理組和對照組的NO2--N 濃度變化趨勢差異顯著，溶液空白（BC）和對照組（EC）中NO2--N 平均含量均低于0.5 mg·L-1（圖3-b）。在培養5 d 時，部分處理組中NO2--N 顯著升高，最大值達2.13 mg·L-1。在培養的21 d 內，與NO3--N 相似，各處理組中NO2--N 濃度整體也呈先升高后降低的趨勢。不同濃度組累積NO2--N 最高濃度出現的時間無明顯規律。金魚藻能夠促進水體NO3--N 和NO2--N 的去除，在16 d 時，各處理組中NO3--N 和NO2--N 均顯著下降。結合NH4+-N 去除情況分析，在同一處理組，NH4+-N 的去除量大于NO3--N 和NO2--N 之和，表明金魚藻能夠吸收利用NH4+-N 維持生長。

圖3 金魚藻培養水溶液中NO3--N 和NO2--N 濃度的變化Fig.3 The changes in NO2--N and NO3--N concentrations in the culture water of hornwort C.demersum

2.4 金魚藻生理指標的變化

培養21 d 時對照組（EC）和各處理組的葉綠素含量、植物可溶性糖含量和脯氨酸含量均顯著增加（P＜0.05）（表1）。與培養前相比，培養21 d 各處理組中金魚藻的10%組織勻漿蛋白濃度顯著增加，而對照組的蛋白濃度顯著降低。各處理組之間，隨著NH4+-N 濃度的增加，金魚藻的10%組織勻漿蛋白濃度、葉綠素a、總葉綠素、植物可溶性糖和脯氨酸含量均逐漸降低，最大值均出現在2.00 mg·L-1濃度組（表1）。不同濃度NH4+-N 對金魚藻生理指標的影響存在一定的差異。2.00 mg·L-1濃度組的各項指標顯著高于對照組與其他濃度組（P＜0.05）。高NH4+-N濃度（16～20 mg·L-1）組的葉綠素a、總葉綠素、植物可溶性糖和脯氨酸含量顯著低于其他濃度組（P＜0.05），兩者之間無顯著性差異。較高NH4+-N 濃度對葉綠素含量影響較大，大于8.00 mg·L-1時，三種葉綠素濃度均低于對照組。

表1 不同濃度NH4+-N 溶液中金魚藻生理指標的變化Tab.1 Changes in physiological indices in culture water of hornwort C.demersum exposed to different NH4+-N concentrations

3 討論

金魚藻在0～20 mg·L-1的NH4+-N 溶液中能正常生長，外觀無明顯變化。低濃度（＜4.00 mg·L-1）的NH4+-N 促進了金魚藻的生長，總生物量增長量、可溶性蛋白、葉綠素a、植物可溶性糖和脯氨酸含量均高于無NH4+-N 的對照組，且變化趨勢相同。這表明在低濃度NH4+-N 脅迫下，金魚藻的生長不受影響，能夠利用NH4+-N 合成自身細胞物質[18,19]。這一結果與前人研究結論相似，在低濃度NH4+-N 培養下，金魚藻可溶性蛋白、總氮的含量增加[20]，促進金魚藻片段萌發[15]。氮素是沉水植物生長的必需營養元素之一，是合成植物生理代謝活動中蛋白質、葉綠素、核酸等有機化合物的重要組分。對于有根的沉水植物，可以通過根和莖葉從水體和底泥中吸收養分[21]，對營養物質的同化作用取決于周圍水體和底泥中營養元素的可利用性。金魚藻無根，營養吸收主要依賴于葉片[22]。其葉生物量比率高，葉裂片呈細絲狀，表皮較薄或缺失等，均利于其與周圍水體進行物質交換[22,23]。本研究結果證實，金魚藻在無NH4+-N 的貧營養條件下仍然可以累積生物量，這可能有賴于其較高的葉生物量比率獲取更多光照。

金魚藻吸收利用水體中的氮素，實現了對水體的凈化[9,23,24]。本實驗中，低濃度組（＜4.00 mg·L-1）的NH4+-N 去除效率顯著高于其他組，結合植物生物量變化，表明金魚藻去除NH4+-N 的能力與植物的生長狀況密切相關。在相同NH4+-N 濃度條件下，金魚藻總生物量增長越大，相應的NH4+-N 去除效率越高?？紤]到本研究未添加抑菌劑，實驗體系內可能存在微生物的作用，如氨氧化微生物將NH4+-N 轉化為NO3--N 和NO2--N。在同一處理組中，NH4+-N的最終去除量遠大于NO3--N 和NO2--N 之和，結合溶液空白中兩者濃度的波動變化，表明微生物對氮素去除貢獻率相對較小，金魚藻仍起主導作用。

本研究中，低濃度（2.00～4.00 mg·L-1）的NH4+-N溶液促進了金魚藻的生長，但隨著NH4+-N 實驗濃度的升高，金魚藻的生長量逐漸降低，生長受到抑制。已有研究表明，NH4+-N 在10.00 mg·L-1濃度時（pH7）抑制了金魚藻生長，生物量下降[25]。水體中的NH4+-N 有兩種形式，分別是非離子氨（NH3）和離子態氨（NH4+）。研究表明，NH3對金魚藻起主要脅迫作用[26]，0.41 mg·L-1NH3即可明顯抑制金魚藻的生長，其耐受范圍大約為0.683～0.820 mg·L-1。高含量NH3會降低金魚藻生長速率光合速率和SOD 活性，膜脂過氧化程度增加，且存在較強的劑量-效應和時間-效應關系[25,26]。水體中NH3的濃度主要受水體pH的影響，因此金魚藻對NH4+-N 的耐受力與水體pH相關。在本研究中，實驗過程NH4+-N 溶液pH 控制在7.25±0.37，各處理組NH3濃度均在可耐受范圍內，這可能是金魚藻仍可正常生長，在較高NH4+-N脅迫下（16.00～20.00 mg·L-1）生物量仍然有所增長，且有一定氮素去除能力的原因。這一結果證實了在pH 適宜的條件下，金魚藻能夠長期耐受超富營養水平（20.00 mg·L-1）的氮脅迫。

綜上所述，本研究結果表明：

（1）低濃度（2.00～4.00 mg·L-1）NH4+-N 溶液能夠促進金魚藻的生長，總生物量增長量、可溶性蛋白、葉綠素a、植物可溶性糖和脯氨酸含量均有所增加。較高NH4+-N 脅迫下（16.00～20.00 mg·L-1），金魚藻的生長量和生理指標顯著降低，生長受到抑制。

（2）隨著水溶液中NH4+-N 濃度的提高（2.00～20.00 mg·L-1），金魚藻對NH4+-N 的平均去除率逐漸降低，不同處理下分別為97.96%、99.30%、81.44%、57.46%和47.21%。金魚藻去除NH4+-N 的能力與生長狀況密切相關。