葡萄籽原花青素低聚體抑制A1型星形膠質細胞極化機制

王 青，楊智超，董藝薇，苑舒文，李彥青，宋麗娟，黃建軍，馬存根，3

(1. 山西中醫藥大學神經生物學研究中心，國家中醫藥管理局益氣活血法治療多發性硬化重點研究室, 山西 晉中 030619；2. 國藥同煤總醫院神經外科/山西省衛健委神經疾病防治研究重點實驗室，山西 大同 037003；3. 山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009)

中樞神經炎性脫髓鞘疾病是一類以炎性反應和廣泛原發性髓鞘脫失為主要特征的疾病。其中復發-緩解型的多發性硬化(multiple sclerosis，MS)、視神經脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是我國最常見的脫髓鞘疾病，病程通常表現為復發-緩解交替進行，多次發作造成神經功能不可逆的損傷，是中青年非創傷性致殘的主要原因之一[1-2]。長期以來，減少髓鞘的炎性免疫損傷是治療的重要靶點，但尚未取得理想的療效。

星形膠質細胞(astrocytes，AS)是中樞神經系統(central nervous system，CNS)最豐富的膠質細胞，以連續和基本不重疊的方式整齊有序地覆蓋整個CNS，可通過參與髓鞘形成、維護血腦屏障、調節突觸功能和調節能量代謝以維持CNS的穩態。一旦中樞受損，AS迅速作出反應，大量反應性AS增生，并借由本身的功能和表型的轉化對周圍的神經元和膠質細胞產生有益或有害的影響。如NMOSD、MS及其動物模型-實驗性變態反應性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和雙環己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ)誘導的脫髓鞘模型中均存在著的數量眾多的反應性AS[3-4]，可通過釋放多種抑制性因子如硫酸角質素蛋白聚糖、少突膠質細胞髓鞘蛋白和髓鞘相關蛋白，以及炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和補體1q(complement 1q，C1q)等損傷神經元和髓鞘細胞[3，5]。而靶向AS可明顯緩解髓鞘脫失，如Dalahmah等[6]發現半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)可通過促進AS的增殖和炎性反應加重少突膠質細胞的損傷。因此，隨著對反應性AS功能及其作用機制的深入研究，它已逐漸成為保護和促進髓鞘再生的一類重要潛在靶細胞。

葡萄籽原花青素低聚體(grape seed proanthocyanidins，GSPs)是最為安全有效的抗氧化劑之一，具有抗炎、抗惡性腫瘤、免疫調節、抗衰老和神經保護等藥理作用，被廣泛應用于食品、化妝品、藥品和保健品等領域[7-9]。基于其優良的抗炎作用，我們前期探索了GSPs對CPZ脫髓鞘小鼠的治療作用，發現GSPs可顯著緩解CPZ誘導的髓鞘脫失，減少中樞炎性因子的分泌[10]，同時誘導膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性的AS在病灶區的富集，說明GSPs可能通過AS發揮神經保護作用。因此，本研究以體外原代AS為研究對象，初步探討了GSPs靶向AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 原代星形膠質細胞的培養將新出生2-7 d的C57BL/6小鼠，用冰低溫麻醉2～10 min后，用75的乙醇對幼鼠的頭部和頸部進行消毒后進行斷頭處理。將大腦取出后，置于冰浴的高糖DMEM(Gibco，11995040)中，在體視顯微鏡下仔細剝離腦膜，用滅菌后的眼科剪將腦組織剪成1 mm3的碎片。將組織碎片置于0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific)中，溫和搖動培養10 min后，添加完全培養液中止胰蛋白酶反應。完全培養液是含有10%胎牛血清的高糖DMEM。消化的組織以300×g×5 min離心，小心地去除上清液，并重懸于高糖DMEM中，通過40 μm的nylon膜將組織分離成單細胞懸液。獲得的單細胞懸液接種于T75培養瓶中，以獲得原代混合膠質細胞。培養瓶提前用100 mg·L-1的多聚賴氨酸(分子量為15～30萬)包被后在4 ℃過夜，用PBS洗滌3次并在使用前干燥。原代混合膠質細胞培養2 d后更換新鮮的完全培養液，此后每3 d更換1次培養液，通常7～11 d混合膠質細胞會鋪滿培養瓶底。將長滿的培養瓶放置于搖床以180 r·min-1的轉速搖動24 h以去除小膠質細胞(microglia，MG)。然后加入新鮮的AS培養基(ScienCell，1801)，并以240 r·min-1的轉速搖動6 h以去除少突膠質細胞前體細胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)。剩下的細胞在實驗前差速貼壁30 min，進一步純化AS。

1.2 免疫熒光染色法待細胞融合度達到80%左右時，移除培養液，PBS洗滌3次后，室溫4%多聚甲醛固定10 min，0.3%的TritonX-100通透10 min。牛血清白蛋白工作液室溫封閉后，加入抗GFAP抗體(CST，12389)，4 ℃孵育過夜。加入FITC標記的二抗，避光室溫孵育1.5 h。DAPI避光孵育染核20 min，滴加抗熒光淬滅封片液(Thermo，P36970)，封片后使用熒光顯微鏡檢測(Leica，DM40008)。

1.3 細胞活力檢測實驗原代AS進行實驗之前，免疫熒光法染色AS標記物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)進行純度檢測，其陽性率超過95%。將原代AS接種于96孔板，培養24 h后，分別用不同濃度(0、2.5、5、10、20、30和50 mg ·L-1)的GSPs孵育24 h。乳酸脫氫酶(LDH)法：將96孔板以300×g離心5 min，每孔吸取上清液置于另一平底96孔板，按照LDH檢測試劑盒(Solarbio，BC0685)說明書檢測各組上清液中LDH的含量。MTT法：將MTT工作液(5 mg ·L-1)加到96孔板，每孔加入10 μL，在CO2培養箱里孵育4 h，棄去培養液，每孔加入100 μL的DMSO，溶解后在490 nm處檢測其光密度optical density(OD)值。

1.4 DPPH、ABTS自由基清除實驗DPPH實驗：分別將10 μL的空白提取液、陽性標準品溶液和不同濃度的GSPs(0、2.5、5、10、20和30 mg·L-1)加入到190 μL的DPPH工作液中，室溫避光孵育30 min，在最大吸收峰515 nm處檢測吸光度(OD)值，計算清除率/%=(A空白-A測定)/A空白×100%。ABTS實驗：空白組：將24 μL的ddH2O加入到180 μL的ABTS混合液中；GSPs組和陽性對照組維生素C(Vitamin C，Vc)：分別將6 μL的陽性標準品溶液和不同濃度的GSPs加入到180 μL的ABTS混合液和18 μl蒸餾水中，反應10 min后，于最大吸收峰593 nm處測定吸光度值，計算清除率/%=(A空白-A測定)/A空白×100%。

1.5 A1型反應性星形膠質細胞模型的建立、藥物干預和細胞因子檢測原代AS用3 μg·L-1的IL-1α(PeproTech，315-01A)、30 μg·L-1的TNF-α(PeproTech，215-11A)和400 μg·L-1的C1q(MyBioSource，MBS143105)孵育24 h，建立A1型AS。30 μg·L-1的GSPs(購自沐凡生物科技有限公司)加入上述的模型中，孵育24 h以干預AS的極化。實驗分組為正常組(Nor)、A1型AS組(Model)和GSPs干預組(GSPs)。24 h后更換新鮮的AS培養液，收集上清采用ELISA法檢測相關的細胞因子。使用R&D公司的夾心ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-17和轉化生長因子(Transforming growth factor-β，TGF-β)等細胞因子。使用凡科維公司ELISA試劑盒檢測睫狀神經營養因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)、H2O2和ROS等因子。細胞因子單位為ng·L-1。

1.6 RT-PCR法PBS洗滌細胞2次后，收集各組的原代AS，使用RNAiso Plus+(TaKaRa，9108)從細胞中提取總RNA。將提取的總RNA用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6110A)逆轉錄為第一鏈cDNA。使用TB Green? Premix Ex TaqTMROX plus(TaKaRa，RR42LR)和CFX96 Optics Module熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進行定量PCR擴增。引物序列參考已經發表的文獻，由上海BioTNT公司合成[11-12]。采用2-ΔΔCt法計算mRNA表達量。Tab 1是使用的引物序列。

Tab 1 Primers for RT-PCR

1.7 Western blot法移除培養液，用PBS洗滌細胞兩次以去除雜質。然后將各組細胞用RIPA裂解液(Sigma，R0278)在冰上裂解1 h后，在 4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min。在RIPA蛋白裂解液中添加混合的蛋白酶抑制劑(Thermo，87786)防止蛋白質降解。蛋白質濃度通過BCA蛋白質測定法測定。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(30 μg)并半干轉到PVDF膜(Millipore，USA)。用5%脫脂奶粉封閉后，分別用抗C3d抗體(CST，97425)、抗c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)JNK抗體(ABcam，ab199380)、抗P-JNK抗體(ABcam，ab278616)和抗GAPDH(ABcam，ab9484)在4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，用種屬對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。洗滌后，使用增強型化學發光(ECL)系統(GE Healthcare Life Sciences，USA)可視化蛋白條帶。

1.8 統計學方法各組數據以均數±標準差描述，采用GraphPad Prism 8.0軟件(GraphPad software，La Jolla，CA)進行統計分析。單因素方差分析(ANOVA)后，兩兩比較采用Tukey′s post-hoc test，單一比較通過未配對t檢驗評估。

2 結果

2.1 GSPs對原代星形膠質細胞活力的影響不同濃度的GSPs干預24 h后，分別采用LDH法和MTT法檢測了藥物對原代AS毒性和細胞增殖的影響。結果表明低、中濃度的(2.5、5、10、20和30 mg ·L-1)GSPs對原代AS沒有細胞毒性，也不影響細胞的增殖，但高濃度(35、40和50 mg·L-1)對細胞有明顯的細胞毒性(Fig 1A)，且抑制細胞的增殖(Fig 1B)。這表明GSPs的給藥濃度在30 mg ·L-1之內對原代AS的活力沒有影響，為后續實驗藥物濃度的確定提供了依據。

Fig 1 Low concentration of GSPs had no effect on viability of primary AS LDH assay and MTT assay were used to detect the toxicity of different concentrations of GSPs to primary AS. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 mg·L-1

2.2 GSPs在體外氧自由基清除實驗為了確定GSPs的最優給藥濃度，檢測了GSPs的抗氧化作用，基于細胞活力實驗結果，GSPs的最大給藥濃度為35 mg·L-1。與Vc組相比，GSPs在體外對DPPH和ABTS自由基具有強大的清除作用，且具有濃度依賴性，且在30 mg·L-1時清除率分別達到95%和92%(Fig 2)。因此，將GSPs的給藥濃度確定為30 mg·L-1。

Fig 2 GSPs had a strong scavenging effect on DPPH and ABTS free radicals in vitro in a concentration-dependent manner**P<0.01 vs Vc.

2.3 GSPs對原代AS極化的影響為了研究GSPs對AS極化的影響，從新生小鼠中提取分離原代AS，并使用免疫熒光法測定AS特異性標記物GFAP。如Fig 3A所示，絕大多數細胞呈GFAP陽性，顯綠色熒光。DAPI染核，胞核呈藍色，為總細胞數。用IL-1α、TNF-α和C1q孵育原代AS，發現A1型標記C3d和C1q在基因水平明顯增加(Fig 3B)。進一步對蛋白水平進行了檢測，發現與正常組相比，模型組C3d和C1q的表達明顯升高(Fig 3C、3D)，表明A1型AS模型成功建立。為了探索GSPs對AS極化作用，用30 mg·L-1的GSPs干預A1型AS的極化，發現藥物可顯著降低C3d和C1q的表達(Fig 4A、4B)，抑制其向A1型極化。

Fig 3 GSPs inhibited AS polarization to type A1

Fig 4 GSPs inhibited AS polarization to type A1

2.4 GSPs對A1型AS分泌的細胞因子的影響研究表明，A1型AS可通過分泌細胞因子發揮作用。因此，我們檢測了GSPs(30 mg·L-1)對其分泌的細胞因子的影響。發現GSPs明顯抑制促炎因子TNF-α、IL-1α和IL-6的分泌(Fig 5A)，減少氧化應激因子H2O2的表達(Fig 5B)，促進抑炎因子TGF-β和神經營養因子CNTF(Fig 5C)的分泌。

Fig 5 GSPs inhibited secretion of inflammatory factors and promoted secretion of anti-inflammatory factors and neurotrophic factors

2.5 GSPs對A1型星形膠質細胞JNK的影響研究表明，IL-1α、TNF-α和C1q激活的AS中JNK信號通路被激活，與AS的炎癥反應有關，因此，接下來檢測了GSPs對JNK的影響，發現GSPs明顯下調了AS中JNK的磷酸化水平(Fig 6)。

Fig 6 Phosphorylation of JNK in AS inhibited by GSPs was determined by Western blot**P<0.01 vs Model.

3 討論

神經炎性脫髓鞘疾病中，大量的反應性AS增殖，雖然其作用機制尚不清楚，但Barres等[13]根據其表型和功能的變化，發現神經炎癥和缺血誘導了兩種不同類型的反應性AS，并將其命名為A1型和A2型。A1型AS大量存在于阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥和MS中[3，14]，并喪失了促進神經元存活、突觸重塑和吞噬的能力，同時分泌諸多神經毒性因子損傷神經元和髓鞘結構。如在EAE模型中，A1型可以通過高表達乳糖神經酰胺，促進髓鞘脫失和加重中樞炎癥的效應[5]。與之相反，A2型則上調了許多神經營養因子的表達，促進CNS受損組織的恢復和修復。如A2型可分泌CXCL8、CXCL1和CXCL10等趨化因子募集OPCs至脫髓鞘部位、高表達基質金屬蛋白酶-1(metalloproteinase-1，TIMP-1)和腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)促進髓鞘再生[13，15]。因此，抑制A1型或誘導A2型反應性AS可能對疾病產生有益的影響。本研究采用促炎因子C1q、TNF-α和IL-1α誘導高表達C3d的A1型AS，而GSPs可明顯抑制C3d的表達，表明GSPs可能通過抑制A1型AS緩解髓鞘脫失。

研究發現，屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的JNK信號通路，可以參與AS的激活[16]。我們的實驗證明了C1q、TNF-α和IL-1α誘導的A1型AS中存在JNK磷酸化的明顯增加，提示JNK信號通路的活化可能與AS的極化有關。而GSPs是原花青素低聚體的混合物，包括兒茶素、表兒茶素和原花青素B2等有效成分，采用網絡藥理學的方法預測其作用靶點，發現GSPs抑制中樞神經氧化應激和炎性因子的機制可能與JNK的磷酸化有關[17]。本研究發現GSPs能夠降低A1型AS中JNK的磷酸化，抑制AS向A1型極化，說明減少JNK的磷酸化GSPs影響AS極化的靶點，為進一步研究GSPs的作用機制奠定了基礎。

反應性AS的表型是動態變化的，其極化趨勢主要取決于微環境的不同刺激。如Barres等報道異常活化的MG可通過分泌C1q、TNF-α和IL-1α作用于AS，并誘導其向A1型極化。A1型AS通過分泌IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-17和C1q等促炎因子及H2O2和ROS等氧化應激因子攻擊和損傷神經組織的同時，還可以反作用于A1型AS加重和促進繼發性炎癥反應。如IL-17與其受體結合，可激活AS下游的核因子(nuclear factor κB，NF-κB)，導致促炎因子的產生。而抗炎因子如IL-4、IL-10和TGF-β等，可以逆轉A1型AS，激活AS的神經保護作用，誘導其向A2型極化[18]。如TGF-β信號能介導NF-κB的抑制，從而緩解中風后的神經炎癥。因此，有目的性地改變反應性AS的微環境，有利于獲得具有神經保護作用的表型。為了研究GSPs抑制A1型AS極化的作用機制，我們進一步檢測了體系中相關的炎性因子、氧化應激因子、抗炎因子和神經營養因子。結果表明，GSPs可以明顯減少IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-17和C1q的分泌，抑制H2O2的表達，同時提高TGF-β和CNTF的水平，說明GSPs抑制AS向A1型極化與其能改善促炎微環境密切相關。但本次實驗僅在體外探索了GSPs對AS的直接作用，由于在機體內AS的極化是由多種因素共同決定的，所以我們將進一步研究GSPs是否可以通過影響其它細胞產生效應。

綜上所述，本研究發現GSPs可明顯抑制AS向A1型極化，作用機制與其顯著抑制JNK的磷酸化有關。此外，GSPs還能減少炎性因子和氫自由基的產生，促進抗炎因子和神經營養因子的分泌，進而改善炎癥微環境，發揮神經保護作用。