龍膽瀉肝湯對大鼠急性肝性腦病的防治作用研究*

吳梓君，范栢爽，羅嘉儀，魏欣，李思勤，王麗莉，何新，

（1．天津中醫藥大學，天津 301617；2．中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050；3．廣東藥科大學，廣州 510006）

肝性腦病，又稱為肝昏迷，是一種由于急、慢性肝功能嚴重障礙或各種門靜脈-體循環分流異常所致的，以代謝紊亂為基礎的、輕重程度不同的神經精神異常綜合征[1]。其臨床表現隨著病情的加重依次表現為人格改變、行為失常、撲翼樣震顫直至出現意識障礙、昏迷和死亡。世界消化病學會將肝性腦病分為A，B，C 3個類型[2]，其中與急性肝衰竭相關的A型肝性腦病具有病勢兇險、預后差、病死率高達80%等特點[3]，因此對肝性腦病的積極防治尤為重要。目前主要的治療方法有藥物治療、手術治療和營養治療等[4]，其中運用中醫中藥方法，如：中藥口服、中藥保留灌腸、針灸等[5-7]治療肝性腦病是對肝性腦病治療研究的熱點，正在被廣泛探索。

龍膽瀉肝湯出自汪昂的《醫方集解》，該方由龍膽草（6 g）、黃芩（9 g）、梔子（9 g）、澤瀉（9 g）、木通（12 g）、當歸（3 g）、生地黃（9 g）、柴胡（6 g）、車前子（9 g）、生甘草（6 g）10 味中藥組成[8]。具有清瀉肝膽實火，清利肝經濕熱的功效，是治療肝膽實火上炎證和肝經濕熱下注證的經典方劑，現代臨床上主要用于治療急性黃疸型肝炎[9]、急性膽囊炎[10]、急性膀胱炎[11]等屬肝經實火、濕熱者。研究發現，黃芩中的黃芩素及其衍生物[3，12]、當歸中的多糖[13]等對大鼠肝性腦病具有良好的治療作用；以柴胡為君藥的小柴胡湯可通過激活NRF2信號通路治療大鼠A型肝性腦病[14]。因此對于龍膽瀉肝湯治療肝性腦病的研究，多見于龍膽瀉肝湯中單味中藥或個別中藥成分對肝性腦病的治療及相關機制的研究，但對于該方劑整體對肝性腦病的作用尚未有相關報道。基于此本研究以硫代乙酰胺（TAA）所致的急性肝性腦病大鼠為疾病模型，研究龍膽瀉肝湯對肝性腦病的防治作用，為臨床應用龍膽瀉肝湯治療肝性腦病提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠，32只，體質量為（220±20）g，SPF 級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養于室內溫度 （25．0±1．0）℃，相對濕度在（50．0±10．0）%的房間內，期間保持 12．0 h 光照和12．0 h避光循環，大鼠自由飲水、飲食，適應性飼養1周后開始相關實驗研究。

1.1.2 藥物與試劑 龍膽、黃芩、梔子、澤瀉、木通、當歸、生地、柴胡、車前子、甘草飲片，購于北京同仁堂，均符合《中國藥典》（2020版一部）規定；硫代乙酰胺（批號：G217BA0025，生工生物工程（上海）股份有限公司）；乳果糖口服液（批號：20020003，北京韓美藥品有限公司）；水合氯醛（批號：20120629，天津科密歐化學試劑有限公司）；10%甲醛固定液（天津科密歐化學試劑有限公司）；PBS（批號：20210911，北京索萊寶科技有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒（批號：P279185，美國 R&D Systems公司）；白細胞介素-6（IL-6）試劑盒（批號：I14016563，武漢華美有限公司）；γ-氨基丁酸（GABA）試劑盒（批號：34358236，美國 Mybiosource公司）；谷氨酸（Glu）試劑盒（批號：20210816C，美國Mybiosource公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（批號：32337166，美國Mybiosource公司）。

1.1.3 主要儀器 動物行為視頻分析系統（型號：EthoVision XT 8．5，諾達思信息技術公司）；快速血氨測定儀（型號：NX10N，日本Fujifilm公司）；全自動生化分析儀（型號：7020，日本Hitach公司）；高速離心機（型號：ALLEGRA-64R，美國Beckman公司）；十萬分之一天平（型號：AX205，瑞士Mettler Toledo公司）；微型漩渦混合儀（型號：WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司）；臺式pH計（型號：FE28-Micro，瑞士Mettler Toledo公司）；酶標儀（型號：M200PRO，瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 龍膽瀉肝湯的制備 按照龍膽瀉肝湯的配伍比例稱取一定量飲片，加入10倍量蒸餾水，浸泡30 min，回流提取兩次，每次1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮后于無菌瓶中保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 實驗分組、造模及給藥 適應性飼養后，將32只SPF級Wistar大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為正常組、模型組、陽性藥組（乳果糖，6 g/kg）和龍膽瀉肝湯組（7 g/kg）。根據分組，大鼠分別按體質量灌胃不同藥物，連續給藥7天。在第5天給藥結束后開始造模，模型組、乳果糖組和龍膽瀉肝湯組大鼠均腹腔注射TAA 300 mg/kg[3]，連續兩天，正常組腹腔注射給予等體積生理鹽水，造模期間大鼠自由飲食、飲水。從首次腹腔注射TAA開始，為防止大鼠出現電解質紊亂等并發癥，每隔12 h于皮下注射電解質液（包括：3 mL 10%葡萄糖、2 mL生理鹽水和20 μmol KCl的等量混合液）。

1.2.3 大鼠一般狀態觀察及大腦功能分級 TAA造模后，觀察大鼠的一般狀態，包括精神狀態、毛色、飲食量、二便等；比較各組大鼠體質量情況，在造模后每隔12 h進行稱質量。利用Zimmermamn法[15]大鼠腦功能分級進行評分，比較造模后各組大鼠的行為活動是否正常，從而初步判定各組大鼠的腦功能分級情況。具體分級評分標準如下表1所示。

表1 大鼠腦功能評分表

1.2.4 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗是用于測定動物空間認知能力和記憶能力的經典實驗。大鼠每日訓練4次，每次120 s，共訓練5 d，第6天開始進行檢測。于直徑1．5 m的圓形黑色水池中注入自來水，使水面高于平臺約1．5 cm，水中加入黑色染料混勻，控制水溫在19～22℃。將水池分為4個象限，在每個象限上方都貼有1個形狀不相同的塑料牌，按順序依次讓大鼠頭朝池壁從4個象限入水，從大鼠入水即刻計算機開始跟蹤。當訓練時間已到或大鼠已爬上平臺，停止跟蹤，并讓大鼠在平臺上休息20 s，記錄下大鼠尋找到平臺所花費的時間（即逃避潛伏期）。于末次定位航行實驗結束后，撤去平臺，統計出大鼠穿越原平臺位置的次數（即穿環指數）。

1.2.5 血氨及結腸內容物pH測定 行為學檢測后，將各組大鼠麻醉，于大鼠眼內眥取少量血液，采用快速血氨測定儀檢測全血中氨的含量。取大鼠回盲部后端結腸大約10 cm，用蒸餾水沖洗腸組織內部，獲得結腸內容物沖洗液，將該沖洗液離心后，取上清液，用0．45 μm微孔濾膜過濾后，測量pH值。

1.2.6 血清生化指標及炎癥因子測定 于大鼠腹主動脈處取血，處理后采用自動生化檢測儀檢測丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBiL）的含量。利用酶聯免疫反應（ELISA）試劑盒測定血清中IL-6和TNF-α的含量。

1.2.7 肝、腦臟器系數測定 取大鼠肝臟、大腦，將血液沖洗干凈用濾紙吸干水漬后進行稱重，計算臟器系數。

1.2.8 肝組織病理學檢查 剪取大鼠左葉肝臟組織，置于10%多聚甲醛組織固定液中保存，隨后進行常規包埋、切片、脫蠟和蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡下（×100）觀察肝臟組織病理變化。

1.2.9 神經遞質及MDA的檢測 稱取一定量大鼠腦組織，制備成10%的組織勻漿液，按照試劑盒說明書的步驟進行操作，檢測各組大鼠腦組織中的GABA、Glu和MDA的含量。

1.2.10 數據處理及分析 利用GraphPad Prism軟件對數據進行統計分析，結果用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察、大腦分級評分及體質量變化 各組大鼠在造模前精神狀態良好，被毛密而潤澤，正常飲食水，二便正常，陽性藥組大鼠糞便略有增加；造模后，模型組大鼠被毛松散，毛色偏黃無光澤，飲食減少，飲水增加，尿液增多，糞便減少，出現活動減少、步態不穩、反應遲鈍、共濟失調等癥狀；各給藥組均出現與模型組類似癥狀，但較模型組相比癥狀有所緩解，各組大鼠大腦分級評分如表2所示。

表2 對各組肝性腦病大鼠大腦分級評分（±s）

表2 對各組肝性腦病大鼠大腦分級評分（±s）

注：與正常組相比，***P＜0．001；與模型組相比，###P＜0．001。

分組 動物數正常組 8模型組 8陽性藥組 8龍膽瀉肝湯組 8評分11．0±0．00 2．5±0．84***7．5±1．05###8．5±0．55###

各組大鼠造模前后體質量變化如圖1所示，給藥前及給藥期間，正常組、模型組、陽性藥組和龍膽瀉肝湯組大鼠體質量增加，造模12 h后，除正常組外，其余各組大鼠體質量降低，正常組大鼠在禁食后體質量降低。

圖1 各組大鼠造模前后體質量變化情況（±s）

2.2 對肝性腦病大鼠行為學的影響 如表3所示，在造模前各組大鼠隨訓練時間的延長，逃避潛伏期逐漸減少，與訓練第1天相比，其余幾天均具有顯著性差異（P＜0．001），與訓練第 2 天相比，訓練第 4、5天的逃避潛伏期顯著減少；訓練第4、5兩天大鼠逃避潛伏期之間無顯著性差異，表明各組大鼠學習穩定、水平相當，可用于進一步研究。與正常組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著增加（P＜0．001），與模型組相比，陽性藥組和龍膽瀉肝湯組的逃避潛伏期顯著降低；穿環指數顯示，與空白組相比，模型組大鼠的穿環指數顯著減少（P＜0．001），與模型組相比，陽性藥組和龍膽瀉肝湯組穿環指數顯著增加。龍膽瀉肝湯可改善肝性腦病大鼠的學習和記憶能力。

表3 各組大鼠尋臺潛伏期和穿環指數的變化（±s）

表3 各組大鼠尋臺潛伏期和穿環指數的變化（±s）

注：與正常組相比，***P＜0．001；與模型組相比，##P＜0．01，###P＜0．001。

分組動物數造模0 h尋臺潛伏期（s）造模4 8 h穿環指數（次）1 7．7 7±6．1 0 5．1 7±2．2 9 9．3 3±3．2 0 1 8．8 5±5．7 4 3 1．6 7±8．2 4*** 2．3 3±0．8 2***1 8．7 5±7．0 6 1 3．5 0±1．6 4### 7．6 7±1．7 5##1 9．9 8±5．4 5 2 0．8 3±0．6 1## 6．6 7±2．0 7#造模4 8 h尋臺潛伏期（s）正常組模型組陽性藥組龍膽瀉肝湯組8 8 8 8

2.3 各組大鼠血氨和結腸內容物pH比較 血氨結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的血氨含量顯著升高（P＜0．001），而給予各給藥組干預后，與模型組相比，各給藥組均顯著降低了血氨。

表4 各組大鼠血氨和結腸內容物pH的變化（±s）

表4 各組大鼠血氨和結腸內容物pH的變化（±s）

注：與正常組相比，***P＜0．001；與模型組相比，###P＜0．001。

分組正常組模型組陽性藥組龍膽瀉肝湯組動物數8 8 8 8血氨（μg/dL） pH 59．67±9．85 6．65±0．13 276．33±23．55*** 7．63±0．18***164．00±17．3### 6．73±0．23###82．33±20．57### 6．81±0．28###

大鼠結腸內容物pH值結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的腸道pH值顯著增加（P＜0．001），在給予各給藥組干預后，與模型組相比，各給藥組均顯著降低了腸道pH值，幾乎接近正常腸道pH值。

2.4 各組大鼠血清肝功能指標及炎癥因子變化 在生化指標中，與正常組相比，模型組大鼠的ALT、AST、ALP 和 TBiL 水平均顯著上升（P＜0．001），表明造模后大鼠肝臟損傷，而給予各給藥組干預后，與模型組相比，各給藥組均可顯著降低大鼠血清中ALT、AST、ALP和TBiL的含量。龍膽瀉肝湯可顯著改善肝性腦病大鼠肝功能，發揮保護肝臟的作用。

在對炎癥因子的改變中：與正常組相比，模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量顯著增加（P＜0．001），給予龍膽瀉肝湯后，與模型組相比，大鼠血清中 IL-6和 TNF-α 的含量顯著降低（P＜0．01）。表明肝性腦病大鼠給予龍膽瀉肝湯后可降低血清中IL-6和TNF-α的含量，從而發揮抗炎的作用。

2.5 對肝性腦病大鼠臟器系數的影響 如圖2所示，在肝和腦臟器系數中，與正常組相比，模型組大鼠的肝和腦臟器系數均顯著增加（P＜0．001），在給予各給藥組干預后，與模型組相比，陽性藥組可顯著降低肝性腦病大鼠的肝和腦臟器系數，龍膽瀉肝湯組對肝臟器系數有一定程度的降低，但未有顯著性差異，其對腦臟器系數降低顯著（P＜0．001）。

圖2 大鼠造模48 h后肝、腦臟器系數變化（±s）

2.6 對肝性腦病大鼠組織形態的影響 各組大鼠肝臟病理學結果如圖3所示：正常組大鼠肝臟被膜光滑，小葉結構正常，肝細胞未見變性或壞死；模型組大鼠肝細胞輕中度水樣變性，可見明顯的肝細胞溶解、壞死，壞死區可見中度炎細胞浸潤，纖維組織增生較明顯，小葉結構失常；陽性藥組大鼠肝細胞多見輕中度水樣變性，可見明顯的肝細胞溶解、壞死，與模型組比較差異不明顯。龍膽瀉肝湯組大鼠肝細胞輕度水樣變性，肝細胞溶解與壞死減少，少量纖維組織增生，小葉結構尚正常。

圖3 各組大鼠肝臟病理形態的變化（HE染色，×100）

2.7 各組大鼠大腦神經遞質及MDA變化 結果顯示：與正常組相比，模型組大鼠大腦中GABA和MDA 的含量顯著增加（P＜0．001），給予龍膽瀉肝湯后，與模型組相比，大腦中GABA和MDA的含量顯著降低。與正常組相比，模型組大鼠大腦中Glu的水平顯著降低（P＜0．001），給予龍膽瀉肝湯后，與模型組相比，大腦中Glu的水平顯著增加。表明龍膽瀉肝湯通過降低肝性腦病大鼠腦中興奮性神經遞質GABA的含量，增加抑制性神經遞質Glu及MDA含量，發揮治療肝性腦病的作用。

表5 各組大鼠血清肝功能指標及炎癥因子的變化（±s）

表5 各組大鼠血清肝功能指標及炎癥因子的變化（±s）

與正常組相比，***P＜0．001；與模型組相比，##P＜0．01，###P＜0．001。

分組正常組模型組陽性藥組龍膽瀉肝湯組動物數8 8 8 8 ALT（U/L） AST（U/L） ALP（U/L） TBiL（μmol/L） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）22．17± 6．62 88．50± 9．58 150．33± 9．89 0．17±0．05 26．65±10．16 22．42±2．09 1 030．00±144．94***2 433．22±117．79***733．33±118．15*** 3．07±0．34*** 125．32±24．95*** 57．34±7．87***699．08±147．10## 1 760．02±102．53### 506．67± 51．13### 1．96±0．40### 29．24±12．99### 28．95±2．63###462．32±164．10### 1 429．02±243．58### 342．67± 96．57### 1．86±0．65### 42．15±11．88## 34．10±6．04###

表6 各組大鼠腦中GABA、Glu和MDA含量的變化（±s）

表6 各組大鼠腦中GABA、Glu和MDA含量的變化（±s）

注：與正常組相比，***P＜0．001；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01，###P＜0．001。

分組正常組模型組陽性藥組龍膽瀉肝湯組動物數8 8 8 8 GABA（pg/mL） Glu（ng/mL） MDA（nmol/L）339．61±47．04 92．75±28．47 1．82±0．43 575．11±49．43***41．82±14．70*** 3．42±1．40**402．97±72．26### 79．17± 9．59# 1．86±0．24##389．22±40．14### 81．10± 8．08## 1．74±0．30##

3 討論

肝性腦病是在急、慢性肝病基礎上由于肝臟受損，使其對體內物質代謝紊亂，造成內源性物質失衡，引發的腦的神經功能紊亂。由于肝功能衰竭導致腦功能障礙的病理生理機制復雜，涉及多個方面，因此，肝性腦病的發病機制尚未明確，也沒有有效的防治手段，這種情況嚴重地影響了患者的生活質量和生存期，因此對于肝性腦病的治療一直是國內外研究的熱點[16-17]。建立良好的疾病動物模型，對疾病的用藥治療具有重要的意義。研究顯示，TAA在引發肝損傷的同時可引起腦代謝異常，多用于研究谷氨酰胺、GABA及氧化應激等在肝性腦病發病機制中的作用，其制備的A型肝性腦病模型可重復性好，造模時間短，成功率高，更接近人肝性腦病的發病特點，因而被廣泛使用[18-19]。

臨床評價藥物對肝性腦病的治療作用，主要以患者的認知障礙程度、血氨及肝功能水平作為主要的觀察指標[20-22]。本研究采用經典的Morris水迷宮試驗考察動物的學習與記憶能力[23]，選擇逃避潛伏期和穿環指數作為評價指標。結果顯示，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長，穿環指數顯著減少，而在給予龍膽瀉肝湯后，大鼠的逃避潛伏期顯著降低，穿環指數增加，表明龍膽瀉肝湯可改善肝性腦病大鼠的空間學習和記憶能力。血氨的累積是肝性腦病發展的重要因素[24]，因此降低血氨水平是治療肝性腦病的有效措施之一。同時體內氨的增多引起腸道pH值的改變，可能引起腸道菌群的失調[25]。在本研究中，模型組大鼠的血氨值和結腸內容物pH值均顯著增加，給予龍膽瀉肝湯后血氨水平及腸道pH顯著降低。此實驗選擇ALT、AST、ALP、TBiL四個指標用于評價肝損傷情況。ALT和AST是臨床常用于評價肝損傷的重要標志[26]，且ALT是急性肝細胞損害的敏感標志；ALP和TBiL是反映肝膽功能的主要標志。研究結果顯示，模型組大鼠血清中四個指標水平均顯著增加，給予龍膽瀉肝湯治療后，4個指標水平顯著降低，表明龍膽瀉肝湯具有良好的保肝作用。

在藥理/毒理實驗中，動物的受損臟器質量可以發生改變，故臟器系數也隨之而改變[27-28]。臟器的系數增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等。結果顯示，模型組大鼠的肝、腦臟臟器系數顯著增加，而給予龍膽瀉肝湯治療后，肝臟器系數有所減小，但未有顯著性差異，腦臟器系數顯著減小，表明龍膽瀉肝湯可以改善肝性腦病大鼠的臟器系數。

研究表明，肝性腦病的發生與炎癥因子的增多有關[29-30]，肝細胞的損傷可誘發全身釋放促炎因子，如TNF-α、IL-6等[31]。結果顯示：模型組大鼠血清內TNF-α和IL-6的含量顯著增加，給予龍膽瀉肝湯后，TNF-α和IL-6的含量顯著降低，表明龍膽瀉肝湯具有良好的抗炎保肝作用。

神經遞質功能障礙也是肝性腦病發病機制之一[32-33]。GABA是一種重要的中樞神經系統抑制性神經遞質，過量的GABA的神經傳遞造成了部分肝性腦病的發生[34-35]。Glu是中樞神經系統中含量最為豐富的興奮性神經遞質，其含量的減少將導致大腦抑制作用的增加[36]。在本研究中，模型組大鼠的GABA含量顯著增加，Glu的含量顯著降低，給予龍膽瀉肝湯后，大鼠大腦GABA水平顯著降低，Glu水平顯著增加，表明龍膽瀉肝湯可調節肝性腦病大鼠大腦神經遞質的失衡。

研究顯示肝性腦病與氧化應激相關，在多種急性肝衰竭大鼠模型中，大鼠腦的抗氧化能力降低。MDA是機體內多種不飽和脂肪酸在氧自由基作用下發生脂質過氧化而產生的最重要的產物之一，可以反映機體脂質過氧化速率和強度，也能間接反映過氧化損傷程度。在此研究中，模型組大鼠腦中MDA的含量顯著升高，給予龍膽瀉肝湯后，MDA的含量顯著降低，表明龍膽瀉肝湯可改善肝性腦病大鼠的氧化應激水平，發揮治療肝性腦病的作用。

綜上，龍膽瀉肝湯對TAA所致的大鼠急性肝性腦病模型具有顯著療效，通過改善模型大鼠的學習和記憶能力，降低血氨和腸道pH值，降低臟器系數和肝功能生化指標，降低模型大鼠血清中炎癥因子含量，調節腦組織中GABA、Glu及MDA水平，多方面綜合發揮治療肝性腦病的作用。