贊化鹿茸丸治療腎陽(yáng)虛模型大鼠藥效學(xué)研究*

耿馨悅，高曉燕

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

腎陽(yáng)虛是指腎陽(yáng)氣虧虛，溫煦功能下降而導(dǎo)致的腰膝酸軟、畏寒肢冷、精神不振、舌淡胖苔白、脈沉弱無(wú)力為主要表現(xiàn)的證候[1-2]。腎陽(yáng)為機(jī)體陽(yáng)氣之本，有溫煦，推動(dòng)之功。腎陽(yáng)充足，機(jī)體活動(dòng)旺盛；腎陽(yáng)不足，則溫煦、興奮、蒸化、封藏等功能下降，將會(huì)引起機(jī)體衰弱以及生殖機(jī)能減退等證狀。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，腎陽(yáng)虛證廣泛存在于臨床內(nèi)、外、婦、兒、五官等各科疾病中，與多種慢性病、老年病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[3]。由于生活節(jié)奏的加快和工作生活壓力的增大，腎陽(yáng)虛的患病人群也越來(lái)越多，因此，探討研究治療腎陽(yáng)虛證的藥物具有臨床意義的。

腎陽(yáng)虛證臨床上的一般治療法則為：溫補(bǔ)腎陽(yáng)、溫陽(yáng)利水、補(bǔ)腎納氣、補(bǔ)腎固攝等。鹿茸丸源自《三因極一病證方論》，原方主治失志傷腎，腎虛消渴，小便無(wú)度，具有補(bǔ)腎益氣，滋陰溫陽(yáng)的作用。贊化鹿茸丸是在前藥方的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，被《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二冊(cè)收載，由鹿茸（去毛）、當(dāng)歸、酸棗仁（炒）、鹿角霜、柏子仁、熟地黃、肉蓯蓉、鹿角膠、黃芪、附子（制）10味藥組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血，扶腎壯陽(yáng)，調(diào)經(jīng)祛寒之功效。臨床上用于諸虛百損，心腎不交，肝腎不足引起的陽(yáng)痿不舉，疝氣腹痛，女子帶下，胞寒不孕，體質(zhì)虛弱，腰腿酸痛等。但目前尚缺乏贊化鹿茸丸干預(yù)腎陽(yáng)虛證的相關(guān)療效的研究。因此本試驗(yàn)通過(guò)肌注氫化可的松建立腎陽(yáng)虛大鼠模型[4]，探討贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠的影響，為臨床更好的用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑 贊化鹿茸丸（購(gòu)自葵花藥業(yè)股份有限公司）；氫化可的松（購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司）；水合氯醛（購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌、雄各18只。雄性體質(zhì)量為（180±20）g；雌性體質(zhì)量為（180±20）g。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)，溫度（20±2）℃，濕度（60±5）%，自由飲食飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 D-37520高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific，Germany）；TLE204 電子天平 [梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；熒光倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 模型建立 本研究選用SD大鼠通過(guò)肌肉注射氫化可的松3周造腎陽(yáng)虛大鼠模型[5-7]。雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取6只作正常對(duì)照組，其余作為造模組。正常對(duì)照組注射生理鹽水，造模組每日按25 mg/kg肌肉注射氫化可的松1次，連續(xù)給藥三周，制備雄性腎陽(yáng)虛模型大鼠。雌性SD大鼠造模方法同雄性SD大鼠。造模過(guò)程中，每隔7 d稱量記錄各組大鼠體質(zhì)量，并記錄大鼠的行為學(xué)特征，觀察是否出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、體毛枯燥并失去光澤、爪甲與耳廓顏色變淡、弓背蜷縮、畏寒怕冷喜扎堆，以及尿量增加、食量及飲水量減少、體溫及體質(zhì)量顯著下降等表現(xiàn)，評(píng)價(jià)腎陽(yáng)虛模型是否造模成功[8]。

1.5 分組與給藥 正常對(duì)照組外，雄性/雌性造模大鼠分為模型組、模型給藥組，每組6只。正常對(duì)照組和模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液；模型給藥組灌胃贊化鹿茸丸（按2.4 g/kg給藥）。連續(xù)給藥3周。治療期間各組大鼠正常飲食。

1.6 贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠的治療作用評(píng)價(jià)

1.6.1 一般活動(dòng)狀態(tài)評(píng)價(jià) 連續(xù)給藥3周后，分別對(duì)雌性大鼠和雄性大鼠的正常對(duì)照組、模型組、模型給藥組的體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，比較差異；同時(shí)觀察大鼠被毛光澤程度、行動(dòng)反應(yīng)是否依舊遲鈍、蜷縮畏冷以及及多尿等情況有無(wú)改善。

1.6.2 雄性腎陽(yáng)虛大鼠模型睪丸組織結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià) 各組雄性大鼠摘取單側(cè)睪丸，用生理鹽水洗凈后，放入4%多聚甲醛溶液中，固定、脫水、包埋、切片，HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠睪丸病理變化，記錄其病變性質(zhì)和程度。

1.6.3 臟器指數(shù)評(píng)價(jià) 給藥3周后，大鼠腹腔注射水合氯醛（0.33 g/mL）進(jìn)行麻醉，雄性大鼠摘取單側(cè)睪丸、精囊腺和單側(cè)腎臟；雌性大鼠摘取子宮、雙側(cè)卵巢及單側(cè)腎臟（去除周圍脂肪），以電子天平稱各臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.6.4 生化指標(biāo)評(píng)價(jià) 給藥3周后，大鼠腹腔注射水合氯醛（0.33 g/mL）進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL左右，于4℃下3 500 r/min離心10 min，保留血清。血清送于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，對(duì)大鼠血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、睪酮（T）、雌二醇（E2）進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)，LSD檢驗(yàn)比較兩組間差異，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎陽(yáng)虛大鼠模型的評(píng)價(jià) 造模兩周后，雌性/雄性大鼠正常對(duì)照組活潑好動(dòng)，形體肥胖，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤；造模組行動(dòng)遲緩，形體消瘦，被毛疏松無(wú)華，時(shí)有脫毛，耳朵顏色發(fā)白，蜷縮弓背，畏寒扎堆，小便增多，食量減少。雌性/雄性大鼠造模組體重明顯減輕（P＜0.001）。造模3周后，雌性/雄性大鼠正常對(duì)照組體質(zhì)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，造模組體質(zhì)量和正常對(duì)照組體質(zhì)量相比相差較大（P＜0.001）。具體數(shù)據(jù)見表1、表2。此外，造模組大鼠出現(xiàn)明顯的體毛發(fā)枯變疏且無(wú)光澤、皮肉松弛、反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)明顯減少，畏寒、弓背蜷縮等現(xiàn)象，以及食量減少，尿量增多、溏便等情況。綜合以上各項(xiàng)因素，本次造模成功，可以進(jìn)行下一步工作。

表1 雌性大鼠正常對(duì)照組與造模組體質(zhì)量變化g

表2 雄大鼠正常對(duì)照組與造模組體質(zhì)量變化 g

2.2 贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型的治療作用評(píng)價(jià)

2.2.1 贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型一般活動(dòng)狀態(tài)的影響 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常對(duì)照組大鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)，體態(tài)豐滿，體毛緊密有光澤，反應(yīng)靈敏，尿量與排便正常，體質(zhì)量逐步增加；模型組大鼠出現(xiàn)體毛發(fā)枯變疏且無(wú)光澤，反應(yīng)遲鈍，畏寒、弓背蜷縮，活動(dòng)明顯減少，食量降低，出現(xiàn)多尿等情況。而給藥贊化鹿茸丸后，模型給藥組相較于模型組上述情況均有不同程度的改善，身形雖也略顯消瘦，出現(xiàn)少許蜷縮現(xiàn)象，但反應(yīng)比較活潑，體毛較有光澤，多尿情況好轉(zhuǎn)。從給藥后大鼠體質(zhì)量進(jìn)行分析，模型組體重恢復(fù)均高于模型組，說(shuō)明贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛證之“形體消瘦”具有明顯改善作用，雖兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、表4。

表3 雌性大鼠給藥后體質(zhì)量變化 g

表4 雄性大鼠給藥后體質(zhì)量變化 g

2.2.2 贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響 在光鏡下觀察各組大鼠睪丸病理切片（放大倍數(shù)依次為 4×10、10×10、20×10），就其病變程度進(jìn)行非定量分析。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組睪丸組織結(jié)構(gòu)完整，生精小管發(fā)達(dá)，各級(jí)生精細(xì)胞排列緊密，生精小管管腔內(nèi)可見大量精子，睪丸間質(zhì)少。模型組管壁萎縮，生精小管內(nèi)細(xì)胞層數(shù)減少，排列疏松，初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞數(shù)均減少，并伴隨有精母細(xì)胞死亡脫落，管腔內(nèi)還有大量脫落的精子細(xì)胞；睪丸間質(zhì)組織增生，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，呈現(xiàn)睪丸萎縮圖像。模型給藥組睪丸結(jié)構(gòu)較模型組有很大程度的改善，表現(xiàn)為生精小管管壁增厚，細(xì)胞層數(shù)增多，精子細(xì)胞和精子生成增加，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)。見圖1。

圖1 雄性大鼠各組睪丸橫切面

2.2.3 贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型臟器指數(shù)的影響 給藥3周后，雌性大鼠摘取子宮、雙側(cè)卵巢及單側(cè)腎臟（去除周圍脂肪），計(jì)算臟器指數(shù)。與正常對(duì)照組比較，模型組的子宮、腎臟的臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。模型給藥組與正常對(duì)照組比較，子宮、腎臟的臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異；與模型組相比較，腎臟臟器指數(shù)有顯著提高（P＜0.05），子宮指數(shù)有所提高，但無(wú)顯著差異。卵巢指數(shù)，各組均無(wú)差異。結(jié)果表明，給藥贊化鹿茸丸能夠在一定程度提高腎陽(yáng)虛雌性大鼠模型的子宮和腎臟的臟器指數(shù)。見圖2。

圖2 雌性大鼠臟器指數(shù)（±s，動(dòng)物數(shù)=6）

給藥3周后，雄性大鼠摘取單側(cè)睪丸、精囊腺和單側(cè)腎臟，計(jì)算臟器指數(shù)。與正常對(duì)照組比較，模型組的睪丸與腎臟的臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；模型給藥組睪丸與腎臟的臟器指數(shù)，與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，與模型組相比有顯著提高（P＜0.01）。精囊腺指數(shù)，各組均無(wú)差異。結(jié)果顯示，贊化鹿茸丸能夠在一定程度提高腎陽(yáng)虛雄性大鼠模型睪丸及腎臟的臟器指數(shù)，改善腎臟異常。見圖3。

圖3 雄性大鼠臟器指數(shù)（±s，動(dòng)物數(shù)=6）

2.2.4 贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型生化指標(biāo)的影響 造模后，雄性模型組大鼠血清中T水平與其正常對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.000 1）；贊化鹿茸丸干預(yù)后，雄性模型給藥組大鼠血清中T水平與造模組相比顯著提高（P＜0.01），與其正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。雌性模型組大鼠血清E2與其正常對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.01）；贊化鹿茸丸干預(yù)后，雌性模型給藥組大鼠血清中E2與造模組相比顯著提高（P＜0.01），與其正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，造模后，雄性模型組大鼠血清中T水平下降，雌性模型組大鼠血清中E2水平下降，贊化鹿茸丸干預(yù)能在一定程度使T和E2回調(diào)，使其恢復(fù)之正常水平。雌性模型給藥組大鼠血清中的T和雄性模型給藥組大鼠血清中E2水平雖無(wú)顯著變化，但也呈現(xiàn)出造模后下降，贊化鹿茸丸干預(yù)后升高的趨勢(shì)。結(jié)果見圖4。

圖4 血清中的T和E2水平（±s，動(dòng)物數(shù)=6）

造模后，雌性/雄性模型組大鼠血清中TNF-α水平與其正常對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）；給藥贊化鹿茸丸后，雌性/雄性模型給藥組大鼠血清中TNF-α水平與造模組相比顯著降低（P＜0.01），與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，贊化鹿茸丸能夠在一定程度調(diào)節(jié)大鼠血清中TNF-α水平，見圖5。

圖5 血清中 TNF-α 水平（±s，動(dòng)物數(shù)=6）

3 討論

腎中陽(yáng)氣為人體陽(yáng)氣之根本，具有溫煦、蒸騰、氣化、推動(dòng)、激發(fā)以及固攝等生理作用，是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和生命活動(dòng)的根本。王琦教授《中醫(yī)藏象學(xué)》將腎陽(yáng)虛證解釋為元陽(yáng)不足、命門火衰：“腎陽(yáng)虛又稱命門火衰，命火式微，是以元陽(yáng)不足、氣化無(wú)權(quán)而出現(xiàn)的溫煦失職、水濕內(nèi)盛以及性機(jī)能衰弱等臨床表現(xiàn)的概稱”[9]。腎陽(yáng)虛證在臨床多發(fā)，臨床表現(xiàn)為腰膝酸痛，畏寒怕冷，四肢發(fā)涼，精神萎靡，頭暈?zāi)垦＃募驴却Q，記憶力減退，須發(fā)早白，男子陽(yáng)痿、早泄、遺精，女子代下，胞寒不孕等[10]。

贊化鹿茸丸方中，鹿茸為君藥，性味甘、咸、溫，歸腎、肝經(jīng)，具有溫腎壯陽(yáng)、益精補(bǔ)血、強(qiáng)筋健骨、調(diào)沖任、托瘡毒之效；用于腎陽(yáng)不足、精血虧虛、陽(yáng)痿滑精、宮冷不孕、羸瘦、神疲、畏寒、眩暈、耳鳴、耳聾、腰脊冷痛、筋骨痿軟、崩漏帶下、陰疽不斂等。鹿茸首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味甘，溫，主漏下惡血，寒熱，驚癇，益氣強(qiáng)志，生齒不老。”唐代《藥性論》記載其“主補(bǔ)男子腰腎虛冷，腳膝無(wú)力，夢(mèng)交，精溢自出，女人崩中漏血，炙末空心溫酒服方寸匕。”明確指出鹿茸具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)的功效[11]。余下藥味，當(dāng)歸補(bǔ)血活血；酸棗仁（炒）養(yǎng)血安神；鹿角霜溫腎壯陽(yáng)；柏子仁養(yǎng)心安神；熟地黃滋補(bǔ)腎陰；肉蓯蓉溫腎壯陽(yáng)；鹿角膠溫補(bǔ)肝腎，益精養(yǎng)血；黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)；附子回陽(yáng)助陽(yáng)[12]。全方共奏補(bǔ)氣養(yǎng)血，扶腎壯陽(yáng)，調(diào)經(jīng)去寒之功。故本試驗(yàn)通過(guò)肌注氫化可的松所建立的腎陽(yáng)虛大鼠模型，從補(bǔ)腎益精的角度探究了贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛模型動(dòng)物的影響。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型有一定治療效果，該方可以明顯改善腎陽(yáng)虛模型大鼠的臨床癥狀，如體質(zhì)量下降、四肢末端發(fā)白、精神萎靡，被毛疏松等癥狀，同時(shí)相關(guān)臟器指數(shù)、睪丸組織結(jié)構(gòu)等也有明顯改善。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為腎陽(yáng)虛的發(fā)生與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)有關(guān)，腎陽(yáng)虛證主要表現(xiàn)出下丘腦-垂體-靶腺軸功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致激素分泌紊亂[13-14]。下丘腦-垂體-靶腺軸也應(yīng)用于腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的建立：即針對(duì)不同的軸使用相應(yīng)的藥物破壞其正常功能，從而導(dǎo)致腎陽(yáng)虛的發(fā)生[15-16]。本文所采用的建模方法為肌肉注射氫化可的松，它是利用外源性糖皮質(zhì)激素抑制垂體前葉的促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，從而抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamicpituitary adrenal Axis，HPA）的功能，誘發(fā)病理性腎陽(yáng)虛證的癥狀[17]；此外，也有研究報(bào)道氫化可的松對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-pituitarygonadal Axis，HPG）也具有明顯抑制作用，造成性激素降低[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，雄性模型大鼠血清中的T和雌性模型組大鼠血清中的E2相較于正常組顯著下降，贊化鹿茸丸干預(yù)后，T和E2均恢復(fù)到正常水平，故推測(cè)贊化鹿茸丸可能通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸來(lái)調(diào)節(jié)腎陽(yáng)虛大鼠模型的體內(nèi)激素的分泌，從而干預(yù)腎陽(yáng)虛模型大鼠，發(fā)揮治療作用。贊化鹿茸丸對(duì)血清中的TNF-α也具有一定的調(diào)節(jié)作用。TNF-α是主要的炎癥因子，參與正常炎癥反應(yīng)，與炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展息息相關(guān)[21]。研究表明，炎癥與許多腎功能障礙疾病相關(guān)，如急性腎損傷、慢性腎臟病等[22-24]。本文中，模型組與正常對(duì)照組相比，其血清中的TNF-α顯著增加（P＜0.05），但贊化鹿茸丸干預(yù)后，TNF-α恢復(fù)至正常水平。故推測(cè)贊化鹿茸丸可能通過(guò)降低腎陽(yáng)虛模型大鼠的TNF-α表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而起到治療作用。

綜上所述，本研究揭示了贊化鹿茸丸對(duì)腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型具有一定的治療作用，為臨床的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。