基于數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥方劑治療心肌缺血的用藥規(guī)律及分子機(jī)制

孟棵，楊秋蕊，姜迪，王彩君，閆海峰，陳瑞，張淑潁，肖娟蘭，王怡

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

心肌缺血（myocardial ischemia）是常見的病理狀態(tài)，是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。缺血性心臟病嚴(yán)重危害著人們的身體健康，僅在2010年缺血性心臟病造成700萬的病死率，較1990年上升了35%[1]。研究表明，截止到2017年，缺血性心臟病在中國仍是威脅生命的5個(gè)主要因素之一，該病每10萬人中的平均致殘年齡標(biāo)準(zhǔn)較1990年下降了4.6%[2]。

中醫(yī)在治療心肌缺血方面也有突出貢獻(xiàn)，同時(shí)在治療過程中具有風(fēng)險(xiǎn)小，副作用低，患者經(jīng)濟(jì)壓力小等優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有多靶點(diǎn)多成分多靶點(diǎn)多途徑的特點(diǎn)，對(duì)于研究中醫(yī)藥療效具有獨(dú)特的優(yōu)勢。因此本研究采用數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)此案結(jié)合的方法探討中醫(yī)藥治療心肌缺血的用藥規(guī)律以及對(duì)其分子機(jī)制的預(yù)測。

1 方法與資料

1.1 方劑來源 登錄國家專利網(wǎng)（http：//epub.sipo.gov.cn），按照國家專利網(wǎng)格式輸入“中藥心肌缺血”所得方劑。

1.2 納排標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 將所有主要治療心肌缺血的方劑納入。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）不以心肌缺血為主要治療方向的方劑；2）重復(fù)方劑；3）大量包含不常見中藥或非中藥類方劑；4）以食療為主的食療食譜。

1.3 中藥名稱規(guī)范 按照《中華人民共和國藥典》上的中藥名稱將所有錄入中藥進(jìn)行規(guī)范，將“仙靈脾”統(tǒng)一為“淫羊藿”，“土元”統(tǒng)一成“土鱉蟲”，“全蟲”統(tǒng)一為“全蝎”，“杞果”統(tǒng)一為“枸杞子”等。

1.4 用藥規(guī)律分析

1.4.1 藥頻及性味歸經(jīng)分析 將篩選所得的149首方劑中的所有中藥輸入Microsoft Excel 2016中進(jìn)行藥頻統(tǒng)計(jì)。

1.4.2 主成分分析 采用R語言版本3.6.0，通過對(duì)高維度數(shù)據(jù)（中藥組成）進(jìn)行正交變換，不斷尋找方差最大化的線性組合，最終取方差最大的前幾個(gè)線性組合作為描述整個(gè)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵點(diǎn)。

1.4.3 聚類分析 采用R語言版本3.6.0，通過Kmeans聚類法和分層聚類法對(duì)原數(shù)據(jù)在高維空間中的歐式距離來判斷不同觀測間的相似度，將相似度接近的觀測分為同一類，最終將數(shù)據(jù)投影至二維空間，以此判斷對(duì)原數(shù)據(jù)貢獻(xiàn)度大的類別。

1.4.4 關(guān)聯(lián)規(guī)則 采用R語言版本3.6.0，通過Apriori算法分析數(shù)據(jù)變量間的頻數(shù)發(fā)生規(guī)律，設(shè)置最低支持度為0.05，最小置信度為0.8，分別從三個(gè)角度（支持度、置信度、提升度）尋找出變量間關(guān)聯(lián)或相關(guān)的關(guān)系，并且基于置信度和提升度給出具體規(guī)則的可視化圖。

1.5 靶點(diǎn)獲取與數(shù)據(jù)集的建立 取藥頻大于50的4味藥物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。通過中藥系統(tǒng)生物學(xué)分析數(shù)據(jù)庫 TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB），血腦屏障（BBB），類藥性（DL）作為藥物成分ADME的重要參數(shù)，獲取上述四味藥的化學(xué)成分以及作用靶點(diǎn)的信息（OB≥15；BBB≥-0.3；DL≥0.1）。使用 Cytoscape3.7 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)采用DisGeNET 網(wǎng)站（http：//www.disgenet.org/）通過搜索疾病關(guān)鍵詞“myocardialischemia”，獲取治療心肌缺血的所作用的藥物靶點(diǎn)。將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集獲得共有基因。

1.6 PPI關(guān)系分析 采用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/network.pl）進(jìn)行蛋PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析，將藥物和疾病的共同基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)置為“人類”進(jìn)行分析，將結(jié)果輸入Cytoscape3.71進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。

1.7 Kegg通路和Go功能的富集分析 將共同基因集輸入 Enrichr數(shù)據(jù)庫（http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/），獲取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的重合基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析選擇生物過程（biological proces）。富集分析結(jié)果選擇按校正后的P值從小到大排列。

2 結(jié)果

2.1 藥頻分析 通過納排標(biāo)準(zhǔn)篩選得出149首方劑，并對(duì)藥頻進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)丹參、黃芪，川芎，三七用藥頻次大于50，其中丹參最多為82次。

2.2 主成分分析 在主成分分析中，按照貢獻(xiàn)度選取最高的兩個(gè)維度進(jìn)行分析，如圖1所示。在第一維度中，貢獻(xiàn)度前20的藥物多是補(bǔ)氣養(yǎng)血，收斂安神之藥。而在第二維度中，貢獻(xiàn)度前20的藥多為滋陰活血、理氣走竄之藥。同時(shí)可以在主成分向量圖中可以觀察到，在第一維度中，黨參的作用效果最強(qiáng)，山楂則在第二維度中作用最明顯，黃芪在一、二維度中，均有較強(qiáng)的作用。

圖1 主成分分析圖

2.3 聚類分析 通過聚類分析可以看出，如圖2所示，采用不同算法進(jìn)行聚類分析，其中左圖按貢獻(xiàn)度將藥物分為4類，其中綠色區(qū)域，在可見的2個(gè)維度中集中于0點(diǎn)附近，多為加減用藥，紫色和藍(lán)色區(qū)域則明顯有較強(qiáng)重要性，其中紫色區(qū)域多是活血化瘀、行氣走竄之藥；而藍(lán)色區(qū)域則多為補(bǔ)氣養(yǎng)血、斂陰助陽的藥物組成。右圖采用層次聚類法同樣將所有藥物分為4類，其中綠色仍以加減藥物為主，紫色以補(bǔ)氣活血藥居多，紅色區(qū)域以行氣通絡(luò)藥為主，而藍(lán)色區(qū)域則以養(yǎng)血安神藥為主。

圖2 聚類分析圖

2.4 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 在關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中，如圖3所示，左圖表明丹參和酸棗仁等藥在用于治療心肌缺血時(shí)經(jīng)常與其他藥聯(lián)用，而石斛和遠(yuǎn)志的高置信度則顯示了其作為后項(xiàng)經(jīng)常被關(guān)聯(lián)使用的事實(shí)。我們將置信度前30的藥對(duì)進(jìn)行觀察，如右圖所示，研究發(fā)現(xiàn)丹參、紅花、黃芪、川芎、黨參、桃仁這幾位藥與其他藥關(guān)聯(lián)度和提升度最高。

圖3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析圖

2.5 靶點(diǎn)的獲取及數(shù)據(jù)庫的建立 采用在藥頻分析中用藥頻率≥50的四味中藥“丹參”“黃芪”“川芎”“三七”構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)分析圖，如圖4。將在DisGeNET網(wǎng)站搜索的疾病靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)相交獲得共有基因。其中四味藥物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共有240個(gè)，疾病靶點(diǎn)共有447個(gè)，其中共有基因64個(gè)。表1見開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼。

圖4 “藥物-成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 PPI分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫與Cytoscape3.7進(jìn)行可視化分析的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示，節(jié)點(diǎn)顏色越鮮亮說明節(jié)點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度越高。其中關(guān)聯(lián)度最高的前3位蛋白是白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP9）。

圖5 PPI可視化分析網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 KEGG通路富集分析和GO富集分析 通過Enrichr數(shù)據(jù)庫過共有基因進(jìn)行富集分析，根據(jù)校正后P值升序取前十條通路進(jìn)行分析，其中排名第1的是糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路，其余通路還包括動(dòng)脈粥樣硬化流體剪切力信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等如圖6。在GO功能分析中，根據(jù)校正后P值從小到大排列，取前十功能進(jìn)行分析，其中大多為炎癥因子、細(xì)胞因子和趨化因子或是血管生成或發(fā)育功能，包括細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激的回應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、血管生成的積極調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)等，如圖6。

圖6 富集分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)理論治療心肌缺血多采用“補(bǔ)氣養(yǎng)血，行氣活血”的藥物治療，或以“行氣活血”之藥加以輔助。同時(shí)本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)其中互作水平最高的兩個(gè)基因?yàn)镮L-6與VEGFA；在KEGG富集分析中排名前2的通路是糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路和脈粥樣硬化流體剪切力信號(hào)通路；GO功能富集分析中大部分功能以炎癥、細(xì)胞因子和血管功能為主。

IL-6在缺血性心臟疾病的診斷和治療中有著重大的意義。IL-6在再灌注損傷中表達(dá)上升，其表達(dá)在溶栓后12～24 h含量可達(dá)到峰值[3]。而VEGFA與心血管疾病息息相關(guān)，其可以有效提高心臟中血漿酶原活化因子的活性，進(jìn)而加速細(xì)胞外蛋白水解，最終形成新生的毛細(xì)血管的作用[4]。VEGFA在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中還被證明可以作為致死性心律失常的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[5]。AGE-RAGE通路的表達(dá)與心肌纖維化密切相關(guān)，研究表明Ⅱ型糖尿病大鼠的AGERAGE的上調(diào)與Ⅱ型糖尿病大鼠的心肌纖維化程度程顯著正相關(guān)[6-8]。此外剪切應(yīng)力的不良變化不僅可以加快心血管中斑塊的形成，而且還可以通過炎癥通路來影響基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)從而導(dǎo)致心肌和血管的重塑[9]。同時(shí)，眾多炎癥因子的表達(dá)也是心肌缺血的重要機(jī)制[10]，有研究表明重組人白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）受體拮抗劑，可以抑制實(shí)驗(yàn)性急性心肌梗死細(xì)胞凋亡[11]。

在中醫(yī)角度講，心肌缺血的辨證基本可分為痰瘀痹阻，寒凝心脈，氣陰兩虛，心陽不振4個(gè)證型。其中虛癥多為氣陰兩虛、心陽不振為主[11]。而實(shí)證多為氣痰瘀痹阻，寒凝心脈為主。筆者從納入的方劑中分析所得的用藥規(guī)律可以了解到，中藥治療心肌缺血，對(duì)于虛癥而言，多以補(bǔ)氣養(yǎng)血的藥物來滋補(bǔ)心腎，心主血脈，腎納精氣，心腎雙補(bǔ)，氣血同養(yǎng)；而針對(duì)實(shí)證來說，多采用活血化瘀，行氣通絡(luò)的藥物作為主要治療手段；從性味歸經(jīng)上來看，多以甘溫藥物用以滋補(bǔ)，佐以苦寒藥物以防滋補(bǔ)太過，體現(xiàn)了中醫(yī)的平衡理論。

本研究從數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討了中藥方劑治療心肌缺血的用藥規(guī)律與分子機(jī)制，其結(jié)果具有可靠性，但仍需要臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究對(duì)其用藥規(guī)律和分子機(jī)制進(jìn)行更加科學(xué)系統(tǒng)的驗(yàn)證和闡釋。