貝母混合品中川貝母含量近紅外光譜檢測方法優化*

齊明輝，胡雪婷，趙靜，2，李正，2，劉明，李剛

（1.天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津 301617；2.省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.中國醫學科學院生物醫學工程研究所，天津 300192；4.天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 300072）

貝母始載于《神農本草經》，因其良好的止咳化痰的療效，在中國應用較為廣泛[1-3]，其中川貝母（Fritillariae Cirrhosae，FC） 療效最佳。 浙貝母（Fritillariae Thunbergii，FT）、伊貝母（Fritillariae Pallidiflorae，FP）因與FC外觀相似、顏色差異小，價格遠遠低于FC，所以市面上將FT、FP摻入川貝母中進行銷售的情況屢有發生[4]，這給制藥企業原料采購帶來嚴重的影響。因此，對貝母樣品進行質量檢測顯得尤為必要。

目前對貝母的質量檢測采用的方法有色譜分析、色譜與質譜聯用分析、形態學方法、以及DNA分子標記[5]。其中，色譜分析方法是貝母樣品質量檢測的常用方法，也被列入中國藥典作為貝母質量檢測的金標準。隨著質譜技術的發展，色譜與質譜聯用技術也得到廣泛的應用[6-7]。如Liu等[8]利用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜為基礎的非目標代謝組學結合化學計量學分析，發現了不同貝母的特異性標記，實現了貝母品種的鑒別。Luo等[9]結合化學計量學方法和UPLC-ELSD指紋圖譜，采用相似性分析、層次聚類分析和主成分分析的方法，實現了FC及其混淆品的鑒別。上述方法均獲得了較好的FC質量檢測結果，然而這些方法要求操作者技術熟練且有豐富的經驗，化學試劑，分析過程中需要其他化學試劑的消耗，并且整個分析時間較長，一般用于對原料藥材的抽檢。不能滿足制藥企業大批量原料藥材快速質量檢測的要求。

近紅外光譜技術以其具有快速、無損的分析特點，已經被廣泛應用于食品、醫藥、農業等[10-12]多個領域。近紅外光譜技術也被應用到貝母的質量檢測中來。如：在掃描次數、分辨率分別為32、16 cm-1的參數設定下，Chen et al[13]利用傅里葉變換近紅外光譜儀（PerkinElmer，MA，USA）采集四種完整顆粒貝母的光譜，快速準確地實現了川貝母、浙貝母、伊貝、平貝的品種鑒別。趙耀東等[14]利用傅里葉變換近紅外光譜系統定量檢測浙貝母中有效成分的實驗中，將掃描次數設置為64次，分辨率為8.0 cm-1，增益為1，對過60目篩的浙貝母粉末采集光譜，結合偏最小二乘回歸模型，實現了浙貝母貝母素甲和貝母素乙含量的快速檢測。Yu等[15]設置傅里葉近紅外光譜儀器參數掃描次數、分辨率分別為32、4 cm-1，建立了一種簡單、準確鑒別七種不同產地貝母藥材的方法。鄧波等[16]在分辨率為4 cm-1，掃描次數為64，增益為自動增益的參數條件下，利用傅里葉變換近紅外光譜儀獲取貝母及其近緣物種的光譜數據，并結合主成分分析方法，實現了兩者的鑒別。

由上述研究可見，近紅外光譜技術為貝母樣品的質量檢測提供了一種快速便捷的檢測方法。然而該方法在數據采集過程中易受到粒徑大小、掃描次數、分辨率、增益等實驗條件的影響。粒徑大小在已有的相關研究中，還沒有考慮到對采集條件進行優化。考慮到實際應用中各參數相互影響，本研究以市面上經常出現的FT、FP混入FC進行售賣的混合樣品為例，采用正交試驗設計，對貝母粉末近紅外光譜質量檢測中的粒徑大小、掃描次數、分辨率以及增益4個參數進行優化研究，并在同樣的建模條件和方法下進行模型性能比較，為貝母粉末樣品的近紅外光譜質量檢測參數優化提供參考。

1 實驗方法

1.1 樣品準備 貝母藥材采自四川、浙江、新疆3個省份，共獲取FC、FT、FP各6批。為避免貝母的含水量差異對研究造成影響，所有樣品經過烘干至恒重，然后進行粉碎、混合處理。為提高模型的豐富性，避免單批樣品導致模型的特異性，本研究將6批FC、FT、FP分別混合成3批，針對混合的純品分別隨機選出1種，將3種貝母組合，最終得到6種組合（A1、A2、A3、A4、A5、A6）。FC、FT、FP 的混合比例如圖1所示，根據FC在混合品所占比例（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1），將混合品分為 6 組，從 group0 到group5表示FC比例增大，從左到右FT比例減小，FP比例增大，其中編號19為FC純品，因此共得到18×6+3=111例混合品樣本。受到采購樣品總量的限制，其中獲得的2個混合品樣本量較少，不能滿足近紅外光譜數據采集要求，因此用于后續實驗的混合品樣本共109例。

圖1 混合設計與分組方法

1.2 近紅外光譜數據采集 本研究采用Thermo Electron公司生產的Antaris Ⅱ FT-NIR System傅里葉變換近紅外光譜儀獲取樣品的漫反射光譜。光譜波數范圍為4 000 cm-1～10 000 cm-1。光譜采集過程中，溫度始終保持在25℃左右，濕度在35%左右。

采集光譜前，基于 DOE（Design of experiment）的正交試驗設計對文獻中常用的粒徑大小、掃描次數、分辨率、增益4個參數進行優化組合。選擇L9（34）正交表，3因素3水平的因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

采集9個實驗條件下的貝母粉末樣品近紅外光譜。在光譜采集過程中，每個樣品采集3次，取其平均光譜作為樣品光譜，以進行下一步分析。

1.3 數據處理 為消除顆粒分布不均勻和顆粒大小產生的散射現象，本研究采用多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）[17-18]進行數據預處理，從而去除散射影響。偏最小二乘回歸（Partial Least Squares Regression，PLSR）是一種有用的多變量分析方法，廣泛應用于自變量（X）與因變量（Y）之間具有大量共線性變量的數據。作為經典的線性回歸模型，PLSR已被廣泛用于解決農業、食品等領域的定量預測問題。PLSR結合了主成分分析和多元回歸的特點。它提取了1組潛在因素，并盡可能解釋了自變量和因變量之間的協方差，在處理共線性變量的數據中具有較大的優勢，在處理共線性變量的數據中具有較大的優勢。本研究利用PLSR對劃分的數據集進行建模分析，并采用決定系數R2、預測集均方根誤差（Root Mean Square Error of Prediction，RMSEP）以及F值對模型預測能力進行評價，F值計算公式如下所示，F值越大，表明模型的預測能力越好。本研究所有數據處理均使用Matlab R2018a軟件完成。

2 結果與分析

2.1 單因素考察 圖2a、b、c、d分別為粒徑大小、掃描次數、分辨率、增益四個研究因素對光譜的考察。研究通過針對同1個樣本，改變其他3個因素，控制一個因素的方法，以考察單因素對樣品光譜的影響。圖2a表明，粒徑大小對樣品光譜的吸光度有影響，隨著粒徑越小，吸光度呈現越小的現象。光譜信噪比大小與掃描次數有關，因此，本文對3水平下4 000～9 000 cm-1波數范圍的樣品光譜峰谷數量進行比較，以獲得光譜平滑度，來評估不同掃描次數的光譜質量。其中，峰谷數量越多，說明光譜波動較大，毛刺較多，光譜質量低；峰谷數量越少，光譜越平滑，毛刺少，光譜質量高。圖2b為不同掃描次數峰谷數量的箱線圖。圖2d直觀地表達了不同掃描次數峰谷數量的差異，掃描次數少，峰谷數量多，說明光譜毛刺較多；隨著掃描次數增多，峰谷數量減少，光譜越平滑，說明多次掃描平均，能夠有效去除光譜中的部分噪聲，但掃描次數并不是越多越好，多次測量平均雖然可以去除部分噪聲，但是在去除噪聲的同時，也可能去除了部分有用信號，導致儀器所產生的系統誤差較大。因此選取最佳掃描次數提高后續定量模型的預測能力顯得非常必要。分辨率反映了不同光程下的樣品信息，增益為信號增強的程度，圖2c、d分別顯示了不同水平分辨率與增益的樣品光譜，右上角分別顯示了不同水平分辨率與增益的光譜，從圖中發現，不同水平分辨率和增益的光譜彼此重疊，吸光度沒有明顯差異。利用三維光譜圖考察了不同水平分辨率和增益的光譜噪聲，從圖中發現，依據光譜噪聲也不能選出最佳水平。因此，單因素考察不能得出有效結論。

圖2 不同影響因素的光譜

2.2 不同因子水平組合下貝母樣品的近紅外光譜 3種純品貝母的光譜特征及九組不同因子水平組合下109例樣本的平均近紅外光譜曲線如圖3所示。

圖3 九種不同因子水平組合的MSC光譜

由圖3可見，9個組合下各光譜曲線的波形無明顯差異，均存在6個吸收峰，分別位于4 200 cm-1、4600cm-1、5600cm-1、6300cm-1、6900cm-1、8300cm-1，這與C-H、O-H、N-H的伸縮與倍頻振動相關[19]。進一步對九組不同因子水平光譜吸光度進行比較發現，各組間吸光度存在差異，但與文獻中已證明的粒徑越小，吸光度越小[20]結論不同，表明掃描次數、分辨率、增益對吸光度也有一定的影響，同時進一步證明參數之間相互影響，基于正交實驗設計進行參數優化研究是有必要的。

2.3 正交實驗結果 由于模型性能涉及到多種指標，實驗在保證模型未過擬合的情況下，綜合考慮R2、RMSEP對建模效果及模型預測能力的影響，因此采用F值進行綜合評價。基于PLSR模型的正交試驗結果如表2所示。其中R值反映了同一影響因素不同水平所建模型預測能力的模型差異，R值越大，表明同一因素不同水平的影響越顯著。K值反映了同一影響因素對試驗指標的影響，K值越大，該水平對應該因素的影響越大，K值最大是因素水平為該影響因素的優水平。

表2 正交實驗結果

從表2的極值 R 來看，RC＞RA＞RB＞RD，由此可見影響貝母粉末樣品中FC含量定量模型預測精度的主次因素為掃描次數＞粒徑＞分辨率＞增益。

嚴衍祿[22]提到：“掃描次數增加，相應模型的性能有所改善，這是因為掃描次數增加提高了光譜的信噪比，但不是掃描次數越多越好”。本研究中，C3為優水平，即掃描次數為64時，模型較好。進一步對正交試驗K值結果進行比較，對于掃描次數，K1＜K2＜K3，表明掃描次數越大，模型越優，然而掃描次數與模型性能是否呈現線性還有待研究。

粒徑大小反映了樣品對光譜散射影響，有研究[20]表明粒徑越小，光譜質量越高，本研究中過120目藥典篩的樣品粒徑為該影響因素的優水平，其中K2＜K1＜K3，與已有結論存在差異，這可能是因為 4個參數之間相互影響的結果。

傅里葉變換近紅外光譜儀的分辨率與移動反光鏡的移動距離有關[23]，分辨率越高，波數點越多，光譜數據越豐富；對于對光譜有較強吸收的樣品來說，可以獲取樣品更多光譜特征信息；對于吸收較弱的樣品來說，造成光譜數據冗余，有效光譜數據比例降低，從而導致模型較差[24]。本研究將4 cm-1、8 cm-1、16 cm-13個水平的分辨率引入正交試驗設計中，其中最佳模型對應的分辨率為介于3個水平的中間值，表明分辨率為8 cm-1時，川貝母及其摻假品有較好的吸收，同時避免了數據冗余對數據處理的影響。

系統信號的增強程度用增益表示，實驗設置了2、4、8三個水平的增益，其中增益為8時，模型最佳。

由表2可見，九個不同參數組合下的F值范圍為69.07-88.11。F值反映了不同因素的最優水平組合，F值越大，模型預測性能越好，因此正交實驗設計的最佳組合是A3B2C3D1。K值反映了同一影響因素對實驗指標的影響，K值越大，該水平對應該影響因素的優水平，因此四個影響因素的最佳優水平組合為A3B2C3D3。A3B2C3D3并沒有出現于正交實驗設計方案中。為了確定最優參數組合，分別對A3B2C3D1、A3B2C3D3兩種參數組合下獲得的模型預測結果進行比較。圖4a、b為A3B2C3D1、A3B2C3D3對應的PLSR模型預測結果。圖4c為兩參數組合所建模型性能指標參數。其中數值1代表A3B2C3D1參數組合，2代表A3B2C3D3參數組合。圖4c直觀地反映了A3B2C3D3的模型預測性能整體優于A3B2C3D1。結果表明，A3B2C3D3即粒徑為過120目藥典篩、掃描次數為64、分辨率為8，增益為8，此時建模結果為：Rp2=0.9742，RMSEP=0.0438，F=93.33。

圖4 不同參數組合PLSR模型預測結果

由上述實驗結果可見，合理的參數設計可以最大程度地提高模型的可靠性和預測能力。掃描次數、粒徑大小、分辨率以及增益4個因素對模型預測精度均有一定的影響，正交實驗設計可以綜合考慮各因素的共同影響，獲取最優參數組合。

3 總結

近紅外光譜檢測參數的選擇直接影響模型的預測能力。本研究以市面上常見的FC中摻入FT和FP的貝母樣品為例，對貝母粉末中FC含量的近紅外光譜定量檢測條件進行優化，為避免對模型單因素影響研究的局限性，本研究通過正交實驗設計綜合評價粒徑大小、掃描次數、分辨率、增益多因素對模型的共同影響。實驗結果表明，4個參數均會給貝母粉末近紅外光譜定量分析模型精度帶來影響。并且貝母粉末粒徑大小為120目，掃描次數為64，分辨率為8，以及增益為8時，可以建立最優模型，獲得最佳的檢測結果。該方法綜合考慮了近紅外光譜數據采集中的4個重要參數的不同水平組合，有效的避免了單因素研究的局限性，本研究為制藥企業中貝母粉末樣品近紅外光譜質量檢測參數優化提供了借鑒。