基于刃天青微平板法檢測金黃色葡萄球菌對天然產物的敏感性

崔乃菠，馬境謙，余河水，3，李正，2，3，何永志，3，別松濤，3

（1.天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津 301617；2.組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.中藥制藥工程市級實驗教學示范中心，天津 301617）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭氏陽性菌（G+菌），在自然界中分布廣泛，不僅會導致皮膚和軟組織感染[1]，也是導致食物中毒的常見食源性細菌[2]。研究表明，由于抗生素的不合理使用導致金黃色葡萄球菌耐藥性增強[3]，影響了很多疾病的有效防治，逐漸成為了全球性的公共衛生問題[4]。從植物中分離出的天然產物具有不易產生耐藥性、毒副作用低、來源廣泛等特點，成為了國內外學者研究的新熱點[5-7]。目前，有多種方法可用于金黃色葡萄球菌的藥敏性研究。傳統的微量肉湯法主要依賴于孔內渾濁度判定藥物的抑菌效果，所用時間較長且無法判斷細菌的存活狀態。其他顯色方法（例如MTT法）只能根據反應終點判定藥物的最低抑菌濃度（MIC），不能動態的反應細菌的生長狀態。鑒于此需要一種快速、高通量、低成本、易觀察的檢測方法篩選抗菌藥物。

刃天青（resazurin）是一種無毒的氧化還原染料，因其安全、經濟等特點已被廣泛用于真菌及細菌的藥敏實驗[8-10]。在細胞質中，刃天青可在多種還原酶的作用下由藍色態被還原為粉色、具有強熒光的試鹵靈（resorufin），見圖1，進一步反應會變成無色且無熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）[11]。反應過程中，刃天青的減少與細菌數量的增加存在直接關系[12]。所以，可以通過顏色變化結合熒光法或分光光度法來判斷藥物的抑菌效果[13]。影響刃天青顯色的因素包括培養基的種類、刃天青濃度、菌懸液濃度和反應時間等[14]。本實驗目的在于優化刃天青的工作條件，基于肉眼觀察和微孔板吸光度檢測考察五種天然產物對金黃色葡萄球菌的MIC，求得毒力回歸方程、相關系數（R2）和半抑菌濃度（IC50）。計算Z值，判定刃天青顯色法對高通量篩選藥物的可行性，為抗金黃色葡萄球菌藥物的快速檢測提供了新思路。

圖1 刃天青顯色法原理

1 試劑與儀器

1.1 實驗菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003）購自中國食品藥品檢定研究所。

1.2 試劑與試藥 大黃酸（LOT：T06J10F92311）、鹽酸小檗堿（LOT：S01A10K94340）、槲皮素（LOT：C28J11Y116820）、蘭雪醌（LOT：Z30M7H12124）購自上海源葉生物有限公司；棉子酚（LOT：028M4048V）購自于 SIGMA；氯霉素（批號：3251476）購自美國 EMD Millipore公司；刃天青（LOT：No.415E035）、MH培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養基（PDB）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自于北京索萊寶科技有限公司；LB培養基、M63肉湯培養基購自于生工生物工程（上海）股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自于天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.3 實驗儀器 智能恒溫培養振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；生化培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；INFINITE F50全波長酶標儀，美國TECAN公司；SB-5200DTD型數控超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；CP1003電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；AB135-S電子分析天平，瑞典Mettler Toledo公司；潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海云泰儀器儀表有限公司。

2 方法

2.1 菌懸液配置 從金黃色葡萄球菌的固體培養基上挑取3～5個形態學相似的單菌落，置于5 mL培養基中，37℃、220 rpm培養18～22 h至細菌的對數生長期。

2.2 藥液配置 刃天青母液配置：用無菌水配置刃天青母液濃度為5 mg/mL，過0.22 μm濾膜除菌，放置于-20℃冰箱避光保存，使用時用培養基稀釋至所需濃度。抗菌藥物母液的配置：DMSO配置大黃酸母液濃度為12 800 μg/mL，蘭雪醌、棉子酚、槲皮素母液濃度為51 200 μg/mL。鹽酸小檗堿用PBS緩沖液（pH：7.2～7.4）配置母液濃度為 3 200 μg/mL。氯霉素母液根據美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI2019）的要求配置為 1 600 μg/mL。

2.3 刃天青反應條件的優化

2.3.1 刃天青濃度對顯色法的影響 在96孔板中加入LB培養基80 μL和20 μL的刃天青，倍半稀釋刃天青的孔內終濃度為160～0.625 μg/mL，每個濃度設置3組平行；用培養基稀釋菌懸液濃度為5×105CFU/mL，加100 μL于96孔板中。設置加20 μL刃天青和180 μL空白培養基的孔作為對照。37℃、120 rmp恒溫振蕩培養12 h，每小時觀察顏色變化，并用酶標儀測定其吸光度值（OD570-OD600）。

2.3.2 菌懸液濃度對刃天青顯色法的影響 在96孔板中加入LB培養基80 μL和20 μL孔內終濃度為20μg/mL的刃天青，培養基稀釋菌懸液濃度為5×108～5×102CFU/mL，加 100 μL 于 96 孔板中，每個濃度設置3組平行。對照設置和培養條件如2.3.1。

2.3.3 不同培養基對刃天青顯色法的影響 在96孔板中加入不同的培養基（LB、MH、TSB、M63、PDB）80 μL，孔內終濃度為 20 μg/mL 的刃天青 20 μL 和濃度為5×105CFU/mL的菌懸液100 μL。每種培養基平行實驗3次。對照設置和培養條件如2.3.1。

2.3.4 確定刃天青反應時間 96孔板中加入LB培養基 80 μL，孔內終濃度為 20 μg/mL 的刃天青 20 μL和濃度為5×105CFU/mL的菌懸液100 μL。對照設置和培養條件如2.3.1。刃天青顏色從氧化狀態的藍色變為還原狀態的粉色則說明細菌生長。

2.4 天然產物抑菌活性的測定 刃天青法：根據篩選出的刃天青工作的最優氧化還原條件，利用刃天青顯色法進行藥敏實驗。加入80 μL不同濃度的含藥培養基于96孔板的1-10列，（大黃酸和蘭雪醌的孔內終濃度為128～0.25 μg/mL；棉子酚和槲皮素的孔內終濃度為1 024～2 μg/mL；鹽酸小檗堿的孔內終濃度為128～0.25 μg/mL），選用氯霉素作為抗生素對照（孔內終濃度為32～0.0625 μg/mL）。調節菌懸液濃度為 0.5麥氏濁度（1×108CFU/mL）[15]，用培養基1∶200稀釋菌液濃度為5×105CFU/mL，刃天青濃度為 200 μg/mL，加 100 μL 菌液和 20 μL 刃天青于96孔板中。11列加100 μL菌懸液、20 μL刃天青和80 μL空白培養基作為陰性對照，12列加180 μL培養基和20 μL刃天青作為陽性對照，放置于37℃恒溫培養箱中，120 rpm培養9 h，通過測定吸光度和觀察顏色變化來判定藥物的抑菌效果。用以下公式計算抑菌率[16]。

微量肉湯法：96孔板的1-10列分別加入100μL不同濃度藥液和濃度為5×105CFU/mL的菌懸液，藥液的孔內終濃度同刃天青法，11列加100 μL的空白培養基和菌懸液作為陽性對照，12列加200 μL的空白培養基作為陰性對照。并計算其抑菌率。

2.5 數據處理 用Origin 2019b軟件進行繪圖，得到刃天青反應最優條件。根據幾率值表將藥物抑菌率轉化得到的幾率值作為縱坐標（y），藥物濃度的對數值為橫坐標（x），得到五種藥物在兩種檢測方法下的毒力回歸方程、R2和IC50。并通過下列公式計算Z因子[17]，分析刃天青在高通量實驗中的可行性。

其中，SD－，SD+分別表示陰性對照組和陽性對照組的標準偏差；Ave－，Ave＋分別表示陰性對照組和陽性對照組的平均值。

3 結果與分析

3.1 刃天青反應條件的優化

3.1.1 刃天青濃度的影響 實驗數據顯示，刃天青濃度范圍在2.5～40 μg/mL時，刃天青濃度與吸光度值之間的線性關系良好（圖2），其線性關系為y=0.036 7x+0.003 2，R2=0.998 9。反應過程中，當刃天青濃度小于5 μg/mL時，吸光值較低，顏色變化不明顯，不利于觀察，即使在線性范圍內，也不適合作為下一步的反應條件；刃天青濃度大于40 μg/mL時，吸光值增加速率變慢；大于80 μg/mL時，吸光值開始下降，可能是因為刃天青濃度過高會抑制細菌體內還原酶的活性[18]。本研究選擇刃天青的孔內反應濃度為20 μg/mL進行下一步實驗。

圖2 刃天青濃度對吸光值的影響

3.1.2 菌懸液濃度的影響 在反應時間12h內，20μg/mL的刃天青濃度下，菌懸液濃度為5×104CFU/mL～5×107CFU/mL時，刃天青的顏色變化明顯，初始態和終止態的吸光度值相差較大（圖3），適用于刃天青顯色法的檢測。若菌濃過高，刃天青變色所需時間過短，可能藥物還未與細菌作用，刃天青就已被還原，降低檢測方法的敏感性[19]；若菌濃過低，實驗孔顏色和吸光度值都與刃天青對照組無明顯差異，不適用于刃天青顯色。故選用菌懸液濃度為5×105CFU/mL進行藥物敏感性實驗，該濃度刃天青顯色明顯，便于觀察。

圖3 菌懸液濃度對吸光值的影響

3.1.3 不同培養基的影響 圖4為LB、MH、TSB、YPD、M63五種培養基在刃天青濃度為20 μg/mL，菌懸液濃度為5×105CFU/mL的條件下，吸光值隨時間的變化曲線。數據表明，LB、MH、TSB 3種培養基的吸光值變化較大，顏色變化明顯，易用肉眼觀察，適用于刃天青顯色法檢測。M63培養基在加入刃天青后立即變為淺粉色，YPD培養基顏色變化也不明顯。這可能與培養基滅菌后酸化有關[21]。培養基酸化后將刃天青轉化為淡粉色物質。本實驗選用LB培養基進行下一步操作。

圖4 培養基類型對吸光值的影響

3.1.4 刃天青反應時間的確定 刃天青顯色依賴于細菌體內還原酶將藍色的氧化態還原為粉色的還原態，但是若進一步反應，則會變為無色。所以選用刃天青濃度為20 μg/mL，菌懸液濃度為5×105CFU/mL時，孔內顏色完全變為粉色的時間點作為反應時間。選用9 h為藥敏實驗的反應時間，該時間點的目測結果與數據顯示（圖5）結果一致。

圖5 刃天青反應時間的確定

3.2 天然產物對金黃色葡萄球菌抑制作用的測定 采用上述刃天青顯色法所確定的最優條件，以氯霉素為抗生素對照，測定大黃酸、鹽酸小檗堿、蘭雪醌、槲皮素、棉子酚對金黃色葡萄球菌的抑制作用。肉眼觀察得到五種藥物的MIC（以鹽酸小檗堿為例，圖6），求得毒力回歸方程、R2和IC50（表1）。結果表明刃天青顯色法觀察得到5種天然產物的MIC與微量肉湯法得到的結果一致。大黃酸、蘭雪醌、棉子酚、槲皮素、鹽酸小檗堿、氯霉素的MIC分別為 8、4、1 024、256、64 和 2 μg/mL。其中，大黃酸和蘭雪醌的抑菌活性突出，幾乎可以達到抗生素水平。刃天青顯色法所得的R2略高于或與微量肉湯法得到的R2相差不大，兩種方法所求得的IC50也較為接近，說明刃天青顯色法的靈敏性和準確性較好，適用于天然產物抑菌活性的判定。Z因子是評判高通量篩選方法穩定性和可行性的標準，用來評價細菌在96孔板中的生長是否具有一致性。若Z＜0，則說明該方法無法區分陰性對照和陽性對照，不適合高通量篩選；若0≤Z＜0．5，說明該方法處于臨界狀態；若 0．5≤Z＜1，則說明該方法穩健性和靈敏性好，適用于高通量篩選藥物[16]。兩種方法的Z因子范圍均在0．5～1之間，且刃天青檢測法略高于微量肉湯法，說明刃天青顯色法穩健性和靈敏性良好，適用于高通量篩選抗金黃色葡萄球菌的藥物。

圖6 刃天青在鹽酸小檗堿藥敏性實驗中的顏色變化

表1 天然產物對金黃色葡萄球菌的抑制活性

4 討論

本實驗發現，刃天青在一定濃度范圍內（2．5～40 μg/mL），吸光值變化與其呈正相關關系，顯色靈敏。這與唐靜等[12]的實驗結果相一致。當刃天青濃度過低時（≤5 μg/mL），顏色變化不明顯；當刃天青濃度過高時（≥40 μg/mL），兩者之間的線性關系不好，原因可能是刃天青濃度過高會抑制細菌體內還原酶的活性[19]，還原得到試鹵靈的效率變低。所以，刃天青濃度范圍應在10～40 μg/mL之間。在考察菌懸液濃度對吸光值的影響時，濃度為5×104CFU/mL～5×107CFU/mL的菌懸液對刃天青顯色反應靈敏。若接種物濃度過高，會使刃天青顯色過快，降低實驗靈敏性；若接種物濃度過低，細菌體內的還原酶不足以將所有刃天青還原，顯色前后變化都不明顯。培養基結果表明，用LB、MH、TSB培養的菌懸液的吸光值隨著時間變化明顯，顏色變化易于觀察，適用于刃天青顯色法檢測。但M63、YPD培養的菌懸液在加入刃天青后就開始變色，原因是刃天青不僅是檢驗氧化還原反應的指標，也是酸堿指示劑。M63和YPD培養基在滅菌后酸化，將刃天青還原為無色化合物。所以，在基于刃天青顯色的微量滴定法，培養基不僅需要提供足夠的營養以確保細菌的生長，還應考慮培養基對刃天青顯色的影響，避免使用產生低pH的培養基。本次實驗選擇拐點9 h作為藥敏實驗的反應時間，該時間點孔內刃天青由藍色的氧化態變為粉色的還原態，且沒有進一步被還原為無色。常用的微量肉湯法對反應時間并沒有明確的規定，12、18、24 h均有被選用為反應終點時間。終點時間選定的不同可能會引起測定結果出現偏差，反應時間過長可能會導致藥物活性降低從而造成測得的MIC偏高；反應時間過短，可能會導致藥物未與細菌完全作用而致使測得的MIC偏低。相較于微量肉湯法，刃天青顯色法選用孔內顏色變化的時間點作為終止反應時間，不僅所用時間縮短而且結果較為準確。

刃天青顯色法的藥敏實驗結果表明，大黃酸、棉子酚、槲皮素、蘭雪醌、鹽酸小檗堿五種天然產物對金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用。其中，大黃酸和蘭雪醌的抑菌活性幾乎與抗生素達到同一水平。刃天青法測得的MIC與微量肉湯法所得到的結果相同。參考袁高慶等[19]的方法求得毒力回歸方程，其R2略高于或與微量肉湯法相近，兩種方法求得的IC50相差不大。刃天青顯色法的Z值為0.91，在0.5～1之間，適用于高通量的藥敏實驗。

本研究顯示，以刃天青為檢測試劑，在96孔板中進行金黃色葡萄球菌的藥敏實驗，更容易確定反應時間且反應時間較短，靈敏性和準確度高，不影響細胞的正常代謝[12]，易于通過顏色變化動態檢測細菌的代謝活性，從而判斷藥物的抑菌效果，為高通量篩選抗菌藥物提供了新思路。